Estudo sobre o efeito do acteosídeo (um ingrediente ativo em Cistanche Deserticola) na DHGNA induzindo a autofagia

2 resultados

2.1 Comparação de LC 3- ⅱ Níveis de expressão de proteína nas células HepG2 tratadas comACT e ECH A expressão relativa de LC 3- ⅱ proteínaNas células Hepg2 tratadas com BAFA1 (0. 67 ± 0. 0 4) foi significativamente maior que o do grupo de controle em branco (0}. A expressão relativa de LC {{1 {{2 {28}}}}}} ⅱ proteína nas células HepG2 no grupo rapamicina+BAFA1 (1,24 ± {{3 {34}}}}. (0. 28 ± {{4 0}}. 02). The expression of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells in the ECH+BafA1 group and the ACT+BafA1 group [0.43±0.02 and 1.36±0.11, respectively] were significantly higher than those in the ECH group and the ACT group [(0.18±0.01 and 0.28±0.02, respectively]], and the differences were statistically significant (P<0.05).

TCM Herb Cistanche para proteção hepática

2.2 Comparação de LC 3- ⅱ Níveis de expressão de proteína em células HepG2 tratadas com diferentes concentrações de ACT

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); Os níveis de expressão de proteína LC 3- ⅱ de células HepG2 no BAFA1 combinadas com 25, 5 0 e 1 0 0} μmol/l Act Groups (1.17 0}. 1,83 ± 0. 53, e 0. 97 ± 0,25, respectivamente) foram significativamente maiores que os dos grupos ACT 25, 50 e 100 μmol/L (0,38 ± 0,09, 0,35 ± 0,18 e 0,30 ± 0,15, respectivamente), com 0,35 ± 0,35, e 0,30 ± 0,15, com 0,38 ± 0,09.<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Nota: A. imunotransferência proteica; B. Resultados da Análise Semi-Quantitativa; comparado com o grupo ACT sem BAFA1, AP<0.05.
Figura 1 Comparação de LC 3- ⅱ Níveis de expressão de proteína em células HepG2 tratadas com diferentes concentrações de ACT

2.3 Comparação da viabilidade das células HepG2 tratadas com diferentes concentrações de ato por 24 e 48 h

The OD values ​​of HepG2 cells after intervention with 0, 20, 4{{10}}, 60, 80, and 100 μmol/L ACT for 24 h were 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 0}}. 15, 0. 0. 94 ± 0. 15 e 0. 94 ± 0. 20, respectivamente; e os valores de OD das células HepG2 após a intervenção por 48 h foram de 3,06 ± 0,27, 0,96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 e 0,09 ± 0,22, respectivamente. Não houve diferença significativa nos valores de OD das células HepG2 após 24 e 48 h de intervenção com diferentes concentrações de ACT (f =0}. 213, 0,213, p =0}. 96, 0,36). Veja a Figura 2.

Nota: A. As células HepG2 foram tratadas com diferentes concentrações de ACT por 24 h; B. As células HepG2 foram tratadas com diferentes concentrações de ACT por 48 h.

Figura 2 Valores de OD a 570 nm após 24 e 48 h de tratamento com diferentes concentrações de ato

2.4 Comparação dos níveis de TG e coloração de óleo de óleo O no modelo de célula in vitro de NAFLD após intervenção do ACT

O nível de TG das células HepG2 no grupo modelo (34,15 ± 1,90) foi significativamente maior do que no grupo controle em branco (14,17 ± 2,74) e no grupo de intervenção do ACT (19,11 ± 1,68), e as diferenças foram estatisticamente significativas (P<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Nota: A. nível de TG; B. coloração de óleo vermelho o (20 ×); comparado com o grupo modelo, AP<0.05.
Figura 3 Comparação do nível de TG e do óleo vermelho o coloração na NAFLD in vitro Modelo após o tratamento do ACT

2.5 Comparação de autofagossomos e gotículas lipídicas após o tratamento do ACT em comparação com o grupo controle em branco, as gotículas lipídicas das células HepG2 no grupo de tratamento da rapamicina e o grupo de intervenção do ACT aumentaram significativamente, e os autofagossomos de LC3 de células HepG2 no grupo de intervenção do ACT aumentaram significativamente e co-localizadas com drogas de lipides. Veja a Figura 4.

3 discussão

A NAFLD é a doença hepática crônica mais comum do mundo, respondendo por cerca de 1/4 da população total do mundo e se tornou um problema global de saúde pública. A sobrenutrição é o principal fator que impulsiona a NAFLD. Excessive intake of nutrients by liver cells causes excessive fat deposition in the cells, leading to lipotoxic reactions such as cell stress (oxidative stress and endoplasmic reticulum stress), inflammasome activation, and cell apoptosis, and subsequently causing a series of changes in liver tissue phenotypes such as inflammatory stimulation, tissue regeneration, and fibrosis [14-15]. Nos últimos anos, estudos mostraram que a autofagia desempenha um papel importante na prevenção do desenvolvimento da NAFLD humana. Os resultados da detecção de índice relacionados à autofagia no fígado de pacientes com DHGNA e doença hepática gordurosa não alcoólica e os fígados de camundongos obesos e de dieta rica em gordura mostraram que o processo de autofagia em hepatócitos foi bloqueado, o que levou ao acúmulo maciço de TG intracelular e outras gotas lipídicas [16]. Outros estudos mostraram que, após o gene chave 7 da autofagia dos hepatócitos ter sido eliminado especificamente em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura, o nível de TG nos hepatócitos de camundongo aumentou significativamente [17]. No entanto, após a superexpressão do gene ATG7 ou intervenção com indutores de autofagia como rapamicina e carbamazepina, a degeneração gordurosa no fígado do camundongo foi significativamente reduzida [18-20].
Isso sugere que a degeneração gordurosa do fígado pode ser significativamente reduzida pela melhoria da atividade da autofagia hepática, fornecendo uma estratégia eficaz para o tratamento da DHGNA. Os produtos naturais, como uma importante fonte de desenvolvimento de novos medicamentos, são amplamente utilizados na prevenção e tratamento de várias doenças hepáticas. Como um excelente produto comumente usado na medicina tradicional chinesa, a Cistanche Deserticola atraiu atenção generalizada por seus efeitos farmacológicos, como neuroproteção, imunomodulação, antioxidante, anticâncer e proteção hepática. Até o momento, mais de 120 compostos foram isolados do deserticola de Cistanche, incluindo glicosídeos feniletanóides, terpenóides e seus glicosídeos, lignanos e seus glicosídeos, oligossacarídeos, polióis e polissacarídeos [21]. Entre eles, os glicosídeos feniletanóides são a classe de compostos mais estudados nos ingredientes ativos de Cistanche Deserticola. ECH e ACT são compostos representativos dos glicosídeos feniletanóides da deserticola de Cistanche, que têm efeitos positivos em antioxidantes, protegendo o fígado, o miocárdio, as células nervosas e o aprimoramento da memória [22-23]. No entanto, não há um relatório de literatura relevante sobre se os glicosídeos feniletanóides da Cistanche Deserticola estão envolvidos no processo de autofagia na proteção do fígado.

A autofagia é um processo de auto-degradação que é onipresente no corpo. É um processo catabólico no qual os autofagossomos degradam resíduos metabólicos celulares. O processo de autofagia geralmente inclui três processos: iniciação de autofagia, extensão da membrana autofágica e formação de lisossomo autofágica, que são regulados principalmente pela proteína alvo da rapamicina e vias de sinalização de fosfatidilinositol -3 quinase. Os autofagossomos são marcadores de autofagia celular. No processo de formação de autofagossomo, uma série de proteínas relacionadas à autofagia, incluindo Atg5 ~ 12 e LC3, desempenham um papel importante. Portanto, este estudo construiu um sistema de avaliação de autofagia, detectou o nível de expressão da proteína do marcador de autofagia LC3 no nível molecular e avaliou a capacidade de indução de autofagia de dois glicosídeos feniletanóides de deserticola de Cistanche em células de HepG2. Os resultados mostraram que, após a adição do tratamento com BAFA1 com base na intervenção do indutor de autofagia rapamicina, o LC intracelular 3- ⅱ das células HepG2 aumentou significativamente, indicando que o sistema de avaliação da autofagia pode avaliar com precisão a atividade de indução automática de medicamentos; Depois que a ECH e o ACT foram tratados com BAFA1, a expressão de proteína LC 3- ⅱ nas células HepG2 no grupo ECH+BAFA1 e o grupo ACT+BAFA1 foi significativamente maior do que no grupo de ECH e no grupo ACT, e as diferenças foram estatisticamente significativas (P<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and exercendo proteção hepáticae outras funções biológicas. Em segundo lugar, a segurança é uma consideração primária no desenvolvimento de medicamentos. Para avaliar a segurança da Lei, este estudo testou ainda mais o efeito da ACT na viabilidade das células HepG2. Os resultados mostraram que a viabilidade das células HepG2 quase não foi afetada pela intervenção com diferentes concentrações de ACT, indicando que a ACT pode ser usada como um medicamento candidato para estudar ainda mais seus efeitos farmacológicos e mecanismos moleculares.

A autofagia é um processo biológico altamente conservado nas células, e pequenas alterações nas concentrações de drogas afetarão o nível de autofagossomos celulares. Para determinar ainda mais a concentração ideal de ACT para induzir a formação de autofagossomos nas células HepG2, este estudo usou diferentes concentrações de ACT combinadas com BAFA1 para tratar as células HepG2 e detectar o nível de expressão de LC 3- ⅱ proteína nas células. Os resultados mostraram que 50 μmol/L do ato poderia aumentar significativamente o nível de autofagossomos nas células HepG2. Portanto, este estudo utilizou 50 μmol/L para intervir no modelo de célula da NAFLD construído in vitro e explorou preliminarmente a relação entre seuProteção do fígadofunção e autofagia.
Estudos relacionados sobre modelos de células NAFLD mostraram que, após intervenção in vitro com ácidos graxos livres, o nível de TG das células HepG2 aumentou significativamente, e a agregação de gotículas lipídicas oleosas pode ser claramente observada nas células [24-25]. Neste estudo, 100 μmol/L PA foi usado para intervir nas células HepG2 in vitro por 24 h. O nível de TG das células HepG2 no grupo modelo foi significativamente maior do que no grupo controle em branco. Ao mesmo tempo, a agregação de gotículas lipídicas pode ser claramente observada nas células, indicando que o modelo de célula NAFLD foi construído com sucesso. Para observar ainda mais o efeito do ACT no modelo de célula NAFLD, a Lei de 50 μmol/L foi usada para intervir no modelo de célula in vitro da DHGNA, e o efeito da ACT na NAFLD foi avaliado pela detecção de nível de TG e coloração com óleo vermelho O. Os resultados mostraram que, após a intervenção da ACT, o nível de TG e o número de gotículas lipídicas oleosas nas células HepG2 foram significativamente menores do que as do grupo modelo, indicando que a Lei tem a atividade de reduzir o TG no modelo de célula NAFLD induzida por PA. Para estudar ainda mais a relação entre a atividade lipídica do ACT e a autofagia celular, este estudo utilizou anticorpos proteicos específicos de LC 3- ⅱ e sondas fluorescentes de Bodipy para co-stain autofagossomos e gotículas lipídicas. Observou-se que o número de autofagossomos nas células HepG2 após a intervenção da ACT aumentou significativamente em comparação com o grupo controle, o que foi consistente com os resultados da imunotransferência de proteínas neste estudo, confirmando ainda que a Lei possui atividade indutora de autofagia nas células HepG2. Além disso, após a intervenção do medicamento, autofagossomos intracelulares e gotículas lipídicas co-localizadas, indicando que o efeito da Lei na melhoria da degeneração gordurosa de NAFLD induzida por PA pode envolver o envolvimento da autofagia celular. No entanto, no modelo de célula da NAFLD, se a ACT exerce sua atividade farmacológica da redução dos níveis intracelulares de TG através da via lipofágica ainda precisa ser explicada ainda mais bloqueando o processo de autofagia intracelular.
Em resumo, entre os dois compostos de glicosídeo de feniletanol de Cistanche Deserticola, a Lei tem uma capacidade significativa de induzir autofagia nas células HepG2. Ao mesmo tempo, no modelo de células de esteatose hepática induzida por PA, a TC reduziu significativamente o nível de TG nas células HepG2. Após a intervenção do ACT, autofagossomos e gotículas lipídicas nas células HepG2 tinham uma certa relação de co-localização, indicando que a autofagia pode ser uma nova via envolvida no processo farmacológico da Lei em termos de proteção hepática. Veja a Figura 5. Nos estudos subsequentes, o mecanismo de ação da Lei na redução dos lipídios será estudado em detalhes, usando bloqueadores de autofagia para estabelecer as bases para o futuro desenvolvimento de novos medicamentos.