Estudo sobre glicosídeos de feniletanol em Cistanche Tubulosa

Abstrato: Objetivo: Confirmar os glicosídeos feniletanóides na erva medicinal Cistanche deserticola (Xinjiang) e estabelecer um método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para a determinação simultânea de glicosídeos feniletanóides. Método: Foi utilizada coluna cromatográfica ThermoSyncronis C18 (250mm) × ４．６ｍｍ,５ μ ｍ）; Acetonitrila como fase móvel A, solução de ácido fosfórico de 00,1 por cento como fase móvel B, eluição gradiente (0-10min, 10 por cento A{{10}} por cento A; 10-20min, 15 por cento A-18 por cento A; 20-45min, 18 por cento A-27 por cento A); Vazão 1,0mL/min; Temperatura da coluna 30 graus; O comprimento de onda de detecção é 330nm; Volume de injeção 10 μＬ. Resultado: Cistanche deserticola contém seis feniletanol glicosídeos, incluindo equinasídeo, antocianina A, pilosídeo, isopilosídeo, 2'-acetilpilosídeo e antocianina B, sem nenhum outro feniletanol glicosídeo; O método de cromatografia líquida de alta eficiência estabelecido para a separação de seis glicosídeos de feniletanol apresentou bons resultados, variando de 80,438 a 1287,000 mg/L, 7,552 a 120,834 mg/L, 28,144 a 450,305 mg/L, 18. 865 a 301,840 mg/L e 1,100 a 17,593 mg/L, respectivamente A relação linear é boa dentro do intervalo de 0,382~6,113 mg/L (R2 maior ou igual a 0,9998); O RSD de precisão, estabilidade e repetibilidade é inferior a 3,2 por cento; A taxa média de recuperação está entre 97,19% e 102,51%, e o método é preciso e confiável. Conclusão: Cistanche deserticola (Xinjiang) contém seis glicosídeos de feniletanolamina, incluindo echinacosídeo, antocianina A, poolside, isopilosídeo, 2 '-acetilpilosídeo e antocianina B. O método de cromatografia líquida de alto desempenho estabelecido é simples, rápido, preciso e reprodutível, e pode determinar simultaneamente o conteúdo de seis glicosídeos de feniletanolamina em Cistanche deserticola. Isso pode fornecer uma base científica para a pesquisa e controle da qualidade de Cistanche deserticola.

Palavras-chave: Tubular Cistanche; glicosídeos de feniletanol; ＨＰＬＣ

Este produto é um caule carnudo seco com folhas escamosas da Cistanchetu hulosa (Schenk) Wish, uma planta da família Orobaceae. Tem os efeitos de tonificar o yang do rim, nutrir a essência e o sangue e umedecer os intestinos para aliviar a constipação. É usado para tratar deficiência de yang do rim, deficiência de essência e sangue, impotência e infertilidade, cintura e joelhos fracos, músculos e ossos fracos e secura intestinal e constipação. Pesquisas modernas mostraram que os principais componentes químicos das ervas medicinais do gênero Cistanche incluem glicosídeos de feniletanolamina, iridóides, lignanas, polissacarídeos, alcalóides, óleos voláteis e outros componentes [2]. Entre eles, os glicosídeos feniletanóides são os principais ingredientes ativos da Cistanche deserticola por seus efeitos antienvelhecimento, antifadiga, tonificante do rim e yang, anti-demência senil e outros efeitos farmacológicos. Cistanche deserticola contém principalmente echinacea, gangliosídeo A, poolside, isopiloside, crisotila, 2 '- acetil glicosídeo, 2' - acetil poolside, cistanche glicosídeo A, cistanche glicosídeo C Feniletanol glicosídeos como antocianina B [3-7]. Este estudo usou HPLC para identificar os glicosídeos de feniletanolamina em Cistanche deserticola (Xinjiang) e estabeleceu um método de determinação simultânea, que pode ser usado para distinguir a autenticidade e a qualidade de Cistanche deserticola, fornecendo uma base científica para a pesquisa e controle de qualidade de Cistanche deserticola.

Principais constituintes químicos de Cistanche deserticola

1 Instrumentos, drogas de teste e amostras

Cromatógrafo: cromatografia líquida de alto desempenho da série Ultramate3000 (bomba de gradiente quaternário LPG 3400SDN, amostrador automático WPS-3000SL, caixa de temperatura de coluna TCC 3000RS, detector VWD 3100); Coluna cromatográfica: coluna ThermoSyncronisC18 (4,6 mm × ２５０ｍｍ, ５ μ ｍ）; Balança eletrônica: balança eletrônica 1/100000 modelo Sedoris SQP; modelo da balança eletrônica 1/10000 Sedoris SQP ; Sistema integrado de água pura/água ultrapura: PURELABClassicUV, sistema de água ultrapura.

Equinosídeo, principal componente químico da Cistanche deserticola

Equinosídeo: Lemaitian Pharmaceutical, número do lote: DST191008-038, conteúdo 99,9 por cento; Guanhua glicosídeo A: ChemFace, número do lote: CFN90669, conteúdo 98 por cento; Glicosídeo de flor de Maorui: CUIDADO, lote número PS011530, conteúdo: 94,6 por cento; Isopiloside: ChemFace, número de lote CFN97049, conteúdo 98 por cento; 2 '- Acetilpilosídeo: ChemFace, número do lote: CFN92452, conteúdo: 98 por cento . Guanhua glicosídeo B: Greep, número do lote: 20120903, conteúdo 98,57 por cento; Acetonitrilo: Fisher cromatograficamente puro; Ácido fosfórico: Fisher, cromatograficamente puro; Metanol: Medicina chinesa, puro analítico.

A erva medicinal Guanhua Cistanche foi comprada da Xinjiang Heji Traditional Chinese Medicine Slice Co., Ltd., com origem em Xinjiang. Foi identificado como Guanhua Cistanche tanto pela Xinjiang Heji Tradicional Chinese Medicine Slice Co., Ltd. quanto pela Jinpai Zhengtang Pharmaceutical Co., Ltd.

2 Métodos e Resultados

2.1 Condições cromatográficas

Usando sílica gel ligada a octadecilsilano como carga (ThermoSyncronisC18); Usando acetonitrila (A) -0.1 por cento de solução de ácido fosfórico (B), eluição gradiente (0-10min, 15 por cento A → 18 por cento A; 10-20min, 18 por cento A → 2 0 por cento A; 20-45min, 20 por cento A → 27 por cento A); Vazão 1,0mL/min; Temperatura da coluna 30 graus; O comprimento de onda de detecção é 330nm; Volume de injeção 10 μＬ. O cromatograma da solução de teste sob esta condição cromatográfica é mostrado na Figura 1.

Figura 1 Análise cromatográfica da solução teste de Cistanche deserticola

2.2 Preparação da Solução

2.2.1 Preparação da solução de teste

Pegue uma amostra de aproximadamente 0,1g (peneirada na 3ª peneira), pese-a com precisão, adicione 20mL de metanol a 50 por cento, pese a massa, deixe de molho por 30 minutos, sonicar (500W, 53kHz) por 40 minutos, deixe esfriar, pese a massa novamente, use 50 por cento de metanol para compensar a massa perdida, agite bem e obtenha a amostra.

2.2.2 Preparação da solução de referência

Pese com precisão as amostras de controle de Echinacetin, Antocianina A, Pilosídeo, Isopilosídeo, 2 '-acetilpilosídeo e Antocianina B e adicione 50% de metanol para obter concentrações de 1287.000mg/L, 120,834mg/L, 450,305mg /L, 301,840mg/L e 17,593mg/L, respectivamente 6,113mg/L de solução mista de referência. O cromatograma da solução de referência é mostrado na Figura 2

Figura 2  6 Cromatograma de soluções de referência para 26 glicosídeos feniletanóides

2.3 Determinação de glicosídeos feniletanóides em Cistanche deserticola (Xinjiang)

Prepare uma solução de referência para glicosídeos de feniletanolamina, como equinacosídeo, antocianina A, antocianina A, is antocianina, antocianina, 2 '- acetil antocianina, 2' - acetil antocianina A, antocianina C e antocianina B, e colete três lotes de amostras de antocianina compradas de Heji, Xinjiang (origem Xinjiang) desde 2017, Prepare a solução de teste de acordo com o método de preparação de "2.2.1" e analise a solução padrão e a solução de teste sob as condições cromatográficas de "2.1". Os resultados mostraram que a distribuição dos picos cromatográficos nos três lotes de amostras de Cistanche deserticola foi consistente. Combinando o tempo de retenção com a curva de absorção de comprimento de onda total de cada composto glicosídico de feniletanolamina, os picos cromatográficos das amostras foram identificados. Os resultados mostraram que todos os três lotes de amostras de Cistanche deserticola tinham seis glicosídeos de feniletanolamina: echinacoside, antocianina A, antocianina, is antocianina, 2 '-acetil antocianina e antocianina B. Não há outros picos cromatográficos de glicosídeos feniletanóides. A identificação dos picos cromatográficos é mostrada na Figura 3.

Principais constituintes químicos de Cistanche deserticola

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2.4 Revisão da Metodologia

2.4.1 Inspeção de relação linear

Dilua a solução de referência mista (1 #) em "2.2.2" em 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes e 16 vezes para obter a solução de referência 2 # -5 #. Pegue cada nível da solução de referência e analise-o de acordo com as condições cromatográficas em "2.1". Use a concentração de cada nível de solução de referência como o eixo x e a área de pico de cada nível como o eixo y para regressão linear. Os resultados são apresentados na Tabela 1, indicando uma boa relação linear entre os componentes dentro da faixa linear correspondente.

Tabela 1  6 Relações lineares de glicosídeos feniletanóides

Figura 3 Identificação de picos cromatográficos de glicosídeos de fenil etanol em Cistanche deserticola

2.4.2 Teste de precisão

De acordo com o método de preparação da solução de teste em "2.2.1", prepare uma porção da solução de teste e analise continuamente seis vezes sob as condições cromatográficas em "2.1". Os conteúdos de equinacosídeo, antocianina A, antocianina, antocianina, 2'-acetil antocianina e antocianina B em cada análise foram obtidos, com valores de RSD de 0,3 por cento , 0,3 por cento e 00,2 percent , respectivamente, 00,1 percent , 1.0 percent , 3,1 percent , indicando boa precisão do instrumento.

2.4.3 Teste de estabilidade

De acordo com o método de preparação da solução de teste "2.2.1", prepare uma porção da solução de teste e analise 6 vezes sob as condições cromatográficas de "2.1" em 0, 2, 4,5, 1{{16 }}, 13,5 e 20 horas, respectivamente, para obter o conteúdo de equinacosídeo, antocianina A, antocianina, é antocianina, 2 '-acetil antocianina e antocianina B em cada análise, os valores RSD do conteúdo são {{20}},6 por cento , 0,4 por cento , 0,5 por cento , 0,4 por cento , 1,3 por cento e 3,1 por cento , respectivamente, indicando que a solução de teste tem boa estabilidade em 20 horas.

2.4.4 Teste de repetibilidade

De acordo com o método de preparação da solução de teste "2.2.1", prepare 6 amostras da solução de teste e analise-as nas condições cromatográficas "2.1" para obter o conteúdo de cada análise de equinacosídeo, antocianina A, antocianina A, antocianina, 2 '- acetil antocianina B e antocianina B, com valores RSD de 0,6 por cento, {{1{12}}}},6 por cento, 0,6 por cento, 1,5 por cento, respectivamente 1,5 por cento indica boa repetibilidade deste método.

2.4.5 Teste de recuperação de rotulagem

Pegue aproximadamente {{0}}0,05 g do conteúdo conhecido do pó medicinal, pese-o com precisão e pese paralelamente 9 porções. Adicionar soluções de referência equivalentes a 50 por cento, 100 por cento e 150 por cento vezes o conteúdo dos 6 componentes a serem testados no material medicinal e preparar 3 porções em paralelo. Prepare a solução de teste de acordo com o método "2.2.1", analise-a nas condições cromatográficas "2.1" e calcule a taxa de recuperação de cada componente. Os resultados são mostrados na Tabela 2, indicando que a precisão desse método é boa . 2.5 Determinação do conteúdo da amostra: Pesar aproximadamente 0,1 g de diferentes lotes de pó medicinal (peneirado na peneira nº 3), pesar com precisão, preparar a solução de teste de acordo com o método descrito em "2.2.1", medir de acordo com as condições cromatográficas descritas em "2.1", registre a área do pico e calcule o conteúdo de seis glicosídeos feniletanóides usando a equação de regressão. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

3 Discussão

3.1 Determinação de glicosídeos feniletanóides

Os três lotes de Cistanche deserticola (Xinjiang) testados contêm seis glicosídeos feniletanóides, ou seja, equinacosídeo, antocianina A, poolside, isopilosídeo, 2 '-acetilpilosídeo e antocianina B, e nenhum deles contém outros componentes de fenil etanol. Isso indica que os tipos de glicosídeos de feniletanol em Cistanche deserticola (Xinjiang) são relativamente consistentes, incluindo equinasídeo e pilosídeo. O conteúdo de glicosídeos na flor de Isomeria é superior a 1%.

O feniletanol glicosídeo é o principal componente ativo da Cistanche deserticola

3.2 Otimização das condições de extração

Este experimento conduziu um estudo de fator único no solvente de extração (10 por cento ~ 90 por cento de metanol) e, finalmente, determinou 50 por cento de metanol como o solvente ideal; Uma investigação de fator único foi conduzida no tempo de extração ultrassônica (20-60 minutos) e descobriu-se que 2 '- acetil poolside atingiu um pico dentro do intervalo de tempo de extração ultrassônica de 30-40 minutos. No entanto, o conteúdo diminuiu após 60 minutos de ultrassom, e esse componente pode ser danificado devido ao tempo prolongado de ultrassom. Levando em consideração os efeitos da extração de outros componentes, um ultrassom de 40 minutos é o tempo ideal de extração.

3.3 Otimização das condições cromatográficas

A varredura de comprimento de onda total (190-400nm) foi realizada usando um detector de arranjo de diodos, indicando que as curvas de absorção de comprimento de onda total dos seis glicosídeos feniletanóides eram consistentes, com picos de absorção em 195nm e 330nm. Os comprimentos de onda baixos foram severamente afetados pela interferência de absorção da fase móvel e fundo de impurezas, então 330nm foi o comprimento de onda de absorção ideal. Os efeitos de separação de diferentes colunas cromatográficas foram investigados e verificou-se que as colunas cromatográficas DiamonsilC18, AgilentZORBAXSB-AqC18 e ThermoSyncronis C18 foram capazes de separar esses seis glicosídeos feniletanóides da amostra de teste de Cistanche deserticola, entre os quais ThermoSyn cronies C18 coluna cromatográfica teve o melhor efeito de separação.

Tabela 2 Resultados do teste de recuperação enriquecido

Tabela 3 Teor de 6 glicosídeos de feniletanol em Cistanche deserticola ( por cento )

4. Conclusão

Este experimento identificou os glicosídeos de feniletanolamina em Cistanche deserticola (Xinjiang) e estabeleceu um método de determinação simultânea para o conteúdo de seis glicosídeos de feniletanolamina em Cistanche deserticola, incluindo equinasídeo, antocianina A, antocianina, isoantocianina, 2 '-acetil antocianina e antocianina B. método é simples, rápido, preciso e tem um papel duplo na análise qualitativa e quantitativa. Isso fornece métodos analíticos e base científica para controlar efetivamente a qualidade da Cistanche deserticola.

Extrato de cistanche em pó

referência:

[1] Comissão Nacional de Farmacopeia. Farmacopéia da República Popular da China [M]. Pequim: China Medical Science and Technology Press, 2020:140-141

[2] Wang Jia, Yang Wen, Wang Dong e outros. Estudo comparativo de quatro espécies de Cistanche deserticola com base em espectros característicos de HPLC [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2021, 41 (3): 384-393

[3] Ding Yanxia, ​​Wang Xiaoqin, Zhang Ying. Determinação do conteúdo de seis principais glicosídeos de feniletanolamina em ervas medicinais do gênero Cistanche com base em cromatografia líquida de alta eficiência [J]. Shi Zhen Guoyi Guoyao, 2020, 31 (4): 813-816

Xiong Hui, Liu Yuqi, Qu Wenjia e outros. Espectro característico de HPLC de Cistanche deserticola e determinação de cinco glicosídeos feniletanolamina ［ J ］. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39 (2): 233-239

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[7] Liang Jiansong, Xue Cuili, Wu Menghua, e outros. Determinação de seis glicosídeos de feniletanol em Cistanche deserticola e Cistanche deserticola por UPLC e avaliação quimiométrica [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2021, 41 (2): 226-235