Estudo sobre a função neuroendócrino-imune de Cistanche Deserticola e seus produtos de vapor de vinho de arroz em modelo de rato induzido por glicocorticóide-Ⅱ

3.2.4. Imunohistoquímica

A apoptose neuronal é controlada por muitos genes apoptóticos e antiapoptóticos, principalmente o gene promotor de apoptose Bax e os genes antiapoptóticos da família de genes Bcl -2. Bcl-2 está localizado em organelas reativas produtoras de oxigênio, como mitocôndrias, retículo endoplasmático e membranas nucleares. Bcl-2 tem pouco impacto sobre os radicais livres de oxigênio, mas podeprevenir danos oxidativos nas células. Bax é transportado do citoplasma para a membrana mitocondrial, altera a estrutura da membrana mitocondrial e promove a liberação do citocromo c e a indução da apoptose.

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Houve expressão no citoplasma adrenal da proteína Bax e Bcl-2. A coloração mostrou todas as partículas amarelas. Em comparação com a do grupo BC, a densidade óptica média da proteína Bax no grupo MC aumentou significativamente (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

A Figura 5 (b) mostra que, em comparação com o grupo BC, a densidade óptica média da proteína Bcl-2 no grupo MC diminuiu significativamente (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

A proteína caspase-3 está localizada principalmente no citoplasma em sua forma original em tecidos normais e tem baixa expressão. Os sinais positivos são amarelo pálido ou amarelo acastanhado. Em comparação com o grupo BC, a expressão de caspase-3 no grupo MC aumentou significativamente (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

Nos tecidos normais, a expressão do gene Fas foi reduzida e o sinal positivo para hibridização in situ foi amarelo acastanhado. Conforme mostrado na Figura 5 (d), em comparação com o grupo BC, a densidade óptica média da proteína Fas no grupo MC aumentou (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

A proteína FasL está localizada principalmente na membrana celular ou citoplasma e seus sinais positivos são marrons. Em comparação com a do grupo BC, a densidade óptica média do gene FasL no grupo MC aumentou significativamente (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Os resultados demonstraram que CD e WCD poderiaminduzir apoptose em células inflamatóriase reduzir o dano adrenal promovendo a expressão da proteína FasL e a ligação à proteína Fas, ativando a proteína caspase-3 e desencadeando uma cascata de caspases. O efeito do grupo WCD-HD foi o melhor.

3.3. Determinação da função imunológica

3.3.1. Índice de Órgãos Imunológicos

Em comparação com os do grupo BC, o coeficiente do timo e o índice do baço do grupo MC diminuíram significativamente (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

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3.3.2. Detecção de subconjuntos de linfócitos T no sangue periférico

A porcentagem de células CD4+ no quadrante superior esquerdo e células CD8+ no quadrante inferior direito no BC e em cada grupo de medicamentos foi maior do que no grupo MC. Em comparação com o grupo BC, a proporção de CD4+ThCD8+ diminuiu significativamente no grupo MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Determinação do nível de IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α e IFN-C no soro

A Figura 8 mostra que, comparado ao grupo BC, o nível de IL-6, TNF- e IFN-c aumentou significativamente (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Resultados do experimento de observação com microscópio de tecido Lymus

A Figura 9 mostra que no grupo BC estava presente um grande número de linfócitos. Linfócitos e reticulócitos estavam frouxamente dispostos no centro com timócitos redondos ou ovais espalhados. Não houve necrose, nem infiltração de células inflamatórias, nem alterações anormais.

O grupo MC apresentou grande quantidade de tecido de necrose linfóide, com disposição desordenada de linfócitos e reticulócitos no centro. Os timócitos redondos ou ovais desapareceram, a degeneração ou necrose celular maciça era evidente e havia infiltração de células inflamatórias com alterações patológicas anormais.

Nos grupos DC, as características morfológicas dos linfócitos voltaram ao normal e o arranjo dos linfócitos centrais e reticulócitos estava quase normal. Os timócitos redondos ou ovais recuperaram, mas permaneceu um pequeno número de linfócitos degenerativos ou necróticos e células inflamatórias infiltrantes.

Nos grupos WCD e PC, as características morfológicas dos linfócitos foram melhor reparadas. Os linfócitos e reticulócitos do centro estavam bem alinhados, os timócitos redondos ou ovais estavam quase normais, mas permanecia um pequeno número de linfócitos infiltrantes e degenerativos.

3.4. Expressão Gênica da Proteína CaM

O valor RQ (mRNA de CaM -mRNA de actina) foi considerado para examinar a expressão de mRNA de CaM. O RQ do grupo BC foi 1. A expressão de mRNA de CaM no hipotálamo no grupo MC aumentou significativamente (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Discussão

A Farmacopeia Chinesa [2] registra que o CD e o WCD podem ser utilizados na clínica como os principais tipos de peças para decocção. Depois de cozido no vapor com vinho de arroz, oefeitos antienvelhecimento e tonificantes do rim-yangforam aprimorados. Através do UPLC-QqQ-MS, detectamos as alterações quantitativas na base do material químico durante o processo de vaporização do vinho de arroz. Os glicosídeos iridóides eram instáveis ​​e o conteúdo desses glicosídeos diminuiu, tornando-se até indetectável. O conteúdo de glicosídeos feniletanol também mudou, o que poderia induzir alterações na farmacodinâmica e no efeito clínico.

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O modelo clássico de deficiência de yang do rim foi replicado por injeção subcutânea de corticosterona [19]. A overdose de corticosterona pode inibir a secreção de CRH no hipotálamo. Enquanto isso, o segredo do ACTH também foi inibido. O nível do hormônio do córtex adrenal diminuiu e, assim, a função do eixo HPA foi reduzida. A hipofunção do eixo HPA é uma característica comum da deficiência de yang do rim [20]. Então os ratos apresentam fenômenos de “esgotamento” e os sintomas estão de acordo com os da deficiência de yang do rim na clínica.

No grupo MC, o nível de CRH, ACTH, T e CORT no soro de rato diminuiu significativamente (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

A modulação da proporção de membros da família Bcl-2 é um dos principais mecanismos pelos quais o FasThFasL medeia a via do receptor de morte, e a família Bcl-2 regula a via mitocondrial [21]. O fator inibidor de apoptose Bcl-2 e os fatores indutores de apoptose, como Bax, pertencem todos à família Bcl-2 [22]. A apoptose celular pode ser determinada pela proporção relativa de fatores inibidores de apoptose e fatores indutores de apoptose [23]. As mitocôndrias têm a função de pontos de controle centrais para muitas formas de apoptose [24]. O presente estudo mostrou que CD-MD e WCDs poderiam deduzir a expressão de Bax e aumentar Bcl-2 paramelhorar a deficiência de yang do rim. Fas é o principal receptor de morte que induz a apoptose por ligação com o ligante Fas (FasL) [25]. A expressão de Fas e FasL no grupo MC aumentou, enquanto esta expressão aumentou significativamente no grupo WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

A deficiência da função imunológica é uma das manifestações importantes da deficiência do Yang do Rim [28]. Neste estudo, descobrimos que o índice do baço e do timo do grupo WCD-MD se recuperou significativamente (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

O eixo HPA é o sistema regulador mais importante porque regula a secreção de glicocorticóides e o sistema endócrino para manter a função secretora do córtex adrenal [32]. A superexpressão do mRNA do CaM no tecido do hipotálamo foi relacionada à deficiência do yang do rim. CD e WCD poderiam bloquear os canais de cálcio, inibir a expressão de mRNA de CaM no hipotálamo e diminuir o influxo de cálcio, diminuindo assim a atividade do complexo Ca2+·CaM.

A formação da deficiência de yang do rim é um processo de desenvolvimento de doenças crônicas. Rim não é mais um conceito puramente anatômico, e é um termo geral para imunidade neuroendócrina e sistemas geniturinários. A rede neuroendócrino-imune (NEI) é um importante sistema regulatório integrado [33]. CD e WCD podem regular a função do eixo HPAT e melhorar a recuperação da deficiência de yang do rim. Este resultado fornece a base experimental para a prevenção clínica e tratamento da deficiência de yang do rim.

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