Estudo sobre os efeitos de melhoria do extrato de glicosídeos feniletanóides de Rouchongrong (Cistanche Deserticola) no metabolismo lipídico em fígados de ApoE - / - Ratos com dieta rica em gordura com base na regulação de expressões ACOX1 - CPT2

RESUMO Objetivo:Para explorar oefeitos do extrato de glicosídeos feniletanóidesdeCistanche deserticola(PGCD) no metabolismo de lipídios no fígado de camundongos ApoE-/- induzidos por uma dieta rica em gordura. Métodos: 70 camundongos machos ApoE alimentados com dieta rica em gordura foram divididos em 5 grupos, grupo modelo (MOD), grupo controle positivo, camundongos receberam atorvastatina [20 mg / (kg · d)] + ezetimiba [20 mg / (kg ·d)](A + E), grupos de dose baixa, média e alta de PGCD foram administradosPGCD[250, 500, 1000 mg/(kg·d)]; outros 14 camundongos machos C57BL/6J com dieta achow foram definidos como grupo controle normal (CON). No 12º fim de semana, o conteúdo de TG e as atividades de ALT e AST no soro e no tecido hepático foram detectados de acordo com as instruções de operação. O tecido hepático fresco foi homogeneizado e o conteúdo de ácidos graxos sintase (FAS), acil-CoA desidrogenase de cadeia longa (LCAD) e glutationa peroxidase (GSH - Px),superóxido dismutase (SOD)as atividades foram testadas pelo método ELISA, enquanto os conteúdos de malondialdeído (MDA) e peróxido lipídico (LPO) foram detectados pelos métodos kid. As expressões de mRNA da acil-coenzima A oxidase 1 (ACOX1) e carnitina palmitoiltransferase 2 (CPT2) foram detectadas por experimentos de RT-PCR.

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Resultados:Ao contrário do grupo modelo,PGCD de três doses reduziu os níveis de TGno fígado e no soro de maneira dose-dependente e reduziu as atividades de ALT e AST no soro. Todas as PGCD de três doses reduziram o conteúdo de FAS de uma forma dependente da dose e aumentaram significativamente o conteúdo de LCAD no fígado.PGCD promovidoas atividades de GSH - Px e SODand reduziram significativamente o conteúdo de MDA e LPO no fígado. Experimentos de RT-PCR mostraram que o PGCD elevou os níveis de mRNA de ACOX1 e CPT2 no tecido hepático.

Conclusão:O PGCD pode melhorar o metabolismo lipídico e a resposta ao estresse oxidativo, e reduzir a deposição lipídica no tecido hepático, regulando as expressões de mRNA de ACOX1 e CPT2.

Palavras-chave:Extrato de glicosídeos feniletanóides de Cistanche deserticola; ACOX1; CPT2;metabolismo lipídico;estresse oxidativo; ApoE-/- ratos

Doença hepática gordurosa não alcoólica(DHGNA) é uma das doenças hepáticas mais difundidas no mundo, com uma prevalência de quase 30% na população em geral. A doença hepática gordurosa na China está crescendo a uma taxa anual de 0,594% [1]. A ocorrência e o desenvolvimento da DHGNA estão intimamente relacionados à ingestão calórica excessiva do organismo. A dieta rica em gordura leva ao acúmulo excessivo de gordura no fígado e induz DHGNA[2], e o passo inicial em sua patogênese é a deposição de triacilglicerol (TG) nas células do fígado[2] 3]. Até o momento, não existem medicamentos terapêuticos específicos direcionados à patogênese da DHGNA. Encontrar medicamentos seguros e eficazes com mecanismos claros para a prevenção e tratamento da DHGNA tornou-se uma tarefa importante para os investigadores. Cistanche deserticola YC Ma é uma planta parasita do gênero Cistanche da família Orobanchaceae. Seu principal componente, os glicosídeos feniletanóides, tem as funções de potencializar a função imunológica do organismo, antienvelhecimento, antirradiação, antioxidante e hepatoprotetor, entre outros efeitos[4-5]. Este trabalho pretende realizar um estudo preliminar sobre o mecanismo deGlicosídeos feniletanóides de Cistanche deserticola(PGCD) na melhoria do metabolismo lipídico.

1 Materiais experimentais

1.1 Medicamentos experimentais

Os caules carnudos de Cistanche deserticola (teor de umidade 8,5%) foram adquiridos da Hotan Dichen Pharmaceutical Co., Ltd.; as substâncias de referência dos glicosídeos feniletanóides (componentes principais verbascosídeo e equinaceasídeo) (ambas com pureza> 98%) foram adquiridas de Manster, Chengdu, Sichuan Biotechnology Co., Ltd .; Atorvastatina: Pfizer Xangai; Ezetimiba: Merck Pharmaceuticals Co., Ltd.

1.2 Animais experimentais

Camundongos C57BL/6J machos com 6 a 8 semanas de idade e camundongos ApoE-/-, peso corporal (20 ± 2) g, adquiridos de Changzhou Cavins Experimental Animal Co., Ltd., número de licença: SCXK (Su) 2016-0010 , ciclo de luz de 12 h / 12 h, temperatura (22 ± 1) grau, umidade 50% ~ 60%, ingestão livre de alimentos e água. Antes do experimento, os ratos foram alimentados com uma dieta padrão durante 1 semana para se adaptarem. Todos os cuidados e experimentos com animais seguem os regulamentos do Comitê de Ética em Animais Experimentais da Primeira Universidade Médica de Shandong (Nº de Ética: W202107080303).

1.3 Re Experimentalagentes

Ração com alto teor de gordura: Harlan Teklad; Kits TG, ALT, AST: Beijing Solebao Biotechnology Co., Ltd.; FAS, kits LCAD: Shanghai Langton Biotechnology Co., Ltd.; Kit GSH-Px: Shanghai Jining Biotechnology Co., Ltd.; Kits SOD, MDA, LPO, BCA: Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.; Kit Trizol: Invitrogen, Carlsbad, CA; Primers ACOX1 e CPT2: projetados por Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.

1. 4 Instrumentos Experimentais Hei - Evaporador Rotativo VAP Expert: Alemanha

Heidolfo; Leitor de microplacas multifuncional Varioskan LUX: ThermoFisher; Liofilizador a vácuo FD8508: Ilshin, Coreia do Sul; Homogeneizador F6/10: Shanghai Fluoroco; Cromatógrafo líquido de alto desempenho Agilent1260, espectrofotômetro UV Cary 3500: Agilent Technologies Ltd.; Quant studio5RT - instrumento de PCR: Thermo Fisher Biochemicals, Inc.

2.3.1 Massa corporal e índice hepático

No final da 12ª semana, os ratos foram submetidos a jejum e pesados. Os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico e sacrificados. Os fígados foram colhidos para cálculo do índice hepático.

2.3.2 Detecção de indicador sérico

Pegue o soro e detecte as atividades séricas de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) em sequência de acordo com a operação do kit; O BCA determina o conteúdo de proteína no soro e detecta o conteúdo de TG.

2.3.3 Detecção de fatores relacionados ao metabolismo lipídico no tecido hepático

Sob condições de 4 graus, pesar uma quantidade apropriada de fígado fresco e homogeneizá-lo em PBS, centrifugar (raio da centrífuga 7,5 cm, 3 000 r/min) o homogeneizado por 1 min, pegar o sobrenadante e medir o teor de proteína de tecido hepático por BCA. Conteúdo de TG no tecido, método ELISA para detectar conteúdo de sintase de ácidos graxos (FAS) e acil-CoA desidrogenase de cadeia longa (LCAD) no tecido hepático.

2.3.4 Detecção de fatores oxidativos relacionados ao tecido hepático

Sob condições de 4 graus, pesar uma quantidade apropriada de fígado fresco e homogeneizá-lo em PBS, centrifugar o homogeneizado (raio centrífugo de 7,5 cm, 3 000 r/min) por 15 min, pegar o sobrenadante e medir o teor de proteína de tecido hepático com BCA. Siga as instruções dos reagentes As instruções da embalagem detectam atividades de superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px) e detectam simultaneamente os níveis de malondialdeído (MDA) e peróxido lipídico (LPO).

2.3.5 Detecção de RT-PCR

Expressão de mRNA de ACOX1 / CPT2 no tecido hepático: pegue uma quantidade apropriada de tecido hepático fresco, use um kit Trizol para extrair mRNA total do tecido hepático, use transcriptase reversa MuLV para sintetizar cDNA e use cDNA como modelo para realizar fluorescência quantitativa em tempo real Detecção de PCR (Qpcr). , as condições de reação foram: pré-desnaturação a 95 graus por 2 min; desnaturação a 95 graus por 10 s, recozimento: 60 graus por 30 s, extensão a 72 graus por 35 s, 34 ciclos e finalmente extensão a 72 graus por 5 min e quantificação em tempo real por um analisador automático. Expressão de mRNA de ACOX1 e CPT2 Software Rotor-gene Q. 1.7 (Qiagen) foi utilizado para análise de dados, e o método 2-△△Ct foi utilizado para contar os níveis relativos de mRNA e GAPDH. Cada grupo de experimentos foi realizado em paralelo> 3 vezes. As sequências iniciadoras são as seguintes: GAPDH, a montante: 5' - GCCACCC AGAAGACTGTG - 3', a jusante: 5' - ATGTAGGCCATGAGGTCCAC - 3'; ACOX1, a montante: 5' -CGCCACCTT CAATCC AGAGT - 3' a jusante: 5' -TCTGCGATGCCAAATTCCCT - 3'; CPT2, a montante: 5'- TCCTCCTACTC AGGACGCAA - 3' a jusante: TTGGGATCTTCCGCTCACAC.

2.4 Métodos estatísticos

O software estatístico SPSS 20.0 foi usado para analisar os dados. Os dados de medição foram expressos como (x ± s). Análise de variância unidirecional foi utilizada para comparação entre grupos. P < 0,05 foi considerado diferença estatisticamente significativa.