Células-tronco para medicina regenerativa e anti-envelhecimento Parte 1
Jun 01, 2022
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Abstrair:Para investigar métodos para melhorar o processamento de resíduos suínos, a pele suína foi hidrolisada utilizando diferentes proteases disponíveis comercialmente (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex e Papain) em várias condições ideais. Após a hidrólise enzimática, os hidrolicados de colágeno (CHs) foram fracionados por peso molecular (3 kDa) via ultrafiltração de membrana. Foram analisados os CHS para propriedades físicas (pH, recuperação de proteínas, conteúdo livre do grupo amino, distribuição de peso molecular e composição de amino) bem como para propriedades funcionais (atividades antioxidantes e atividades anti-envelhecimento). Entre as CHs, os CHs hidrolisados pela Alcalase (CH-Alcalase) apresentaram o maior grau de hidrólise em comparação com outros CHs. Ambos "CH-Alcalase" e "CH-Alcalase"<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">
Keywords:hidrólise; proteases comerciais; hidrolise de colágeno; antioxidante; anti-envelhecimento
1. Introdução
Com o aumento da expectativa de vida, os procedimentos anti-envelhecimento da pele estão recebendo muita atenção. O colágeno, usado em produtos de skincare como ingrediente cosmeceutical para o antienvelhecimento, é amplamente utilizado no mercado cosmético. O colágeno é uma proteína fibrosa de origem animal, encontrada abundantemente em tecido conjuntivo, pele, tendões, cartilagem, ligamentos, dentes, unhas e cabelos de humanos e animais. A pecuária continua sendo a principal fonte de colágeno industrial[1]. Anualmente, grandes quantidades de subprodutos da pecuária são descartadas em todo o mundo, como resíduos, pelas indústrias de processamento de alimentos e carne. No entanto, estes podem ser utilizados como importantes recursos proteicos para novos materiais alimentares ou convertidos em produtos de valor agregado via hidrólise, que é amplamente aplicado para melhorar e atualizar as propriedades funcionais e nutricionais das proteínas [2,3]. O colágeno também está sendo cada vez mais considerado uma fonte de peptídeos bioativos, que têm se mostrado promissores como compostos benéficos para uso em aplicações nutricionais ou farmacêuticas.benefícios cistanche,Portanto, a hidrólise do colágeno pode desempenhar um papel importante na melhoria de sua biodisponibilidade e adequação para uso em diversos processos comerciais.
Atividades fisiológicas de peptídeos bioativos, que geralmente contêm 2-20 resíduos de aminoácidos (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">colesterol cistancheO grau de hidrólise afeta diretamente o peso molecular e a composição de aminoácidos dos hidrolises [8]. Portanto, o processo de hidrólise pode ser necessário para a produção de novos peptídeos bioativos.
Cistanche pode anti-envelhecimento
A hidrólise proteica, levando ao decote de ligações de peptídeos, pode ser realizada através de processos enzimáticos ou químicos [9]. Processos químicos, incluindo hidrólise alcalina ou ácida usando extrações de solventes, são prejudiciais não só para o meio ambiente, mas também para os seres humanos que consomem os produtos resultantes [4,10]. Processos químicos, de difícil controle, produzem produtos contendo aminoácidos modificados [9]. Em contrapartida, a hidrólise enzimática pode ser realizada em condições leves, evitando ambientes extremos que são exigidos por tratamentos químicos. Além disso, os processos não produzem reações laterais nem diminuem o valor nutricional da fonte proteica [8]. Várias proteases, incluindo Alcalase, pepsina, Protamex, trippsina e Neutrase, são comumente usadas para hidrolisar proteínas, resultando em vários tipos de hidrolisados e peptídeos de proteína com uma variedade de atividades biofuncionais. Um estudo relatou a produção de hidrolicagodos de colágeno com atividade antioxidante da gelatina da pele suína usando hidrólise enzimática por pepsina e pancreatina [11].efeitos colaterais cistanche deserticolaOs subprodutos do salmão foram hidrolisados para produzir hidrolisados pepticos utilizando vários proteases, onde os peptídeos finais apresentaram excelentes propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias [12].
O objetivo da pesquisa foi:(a)identificar os hidrolicados de colágeno mais ativos produzidos pela hidrólise enzimática utilizando diferentes proteases disponíveis comercialmente (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain e Papain);(b) para confirmar o efeito fracionado dos hidrolicagodos de colágeno obtidos a partir da hidrólise enzimática, e (c) para determinar as atividades antioxidantes e anti-envelhecimento in vitro.
2. Resultados e Discussão
2.1.Efeito hidrólise enzimática em hidrolise de colágeno
2.1.1.pH
As propriedades funcionais das proteínas podem ser aprimoradas através da hidrólise por certas proteases. Neste estudo, seis proteases diferentes (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex e Papain) foram utilizadas para hidrificar colágeno da pele suína, a fim de obter hidrolisados ativos de colágeno com baixos pesos moleculares.dose cistanche redditA mudança do pH nos hidrolicados de colágeno (CH) é mostrada na Figura 1. O pH da suspensão do colágeno (mistura de pele suína de 5%) foi inicialmente 6,39-6,55 (à 0h). CH-Alcalase e CH-Flavorzyme alcançaram pH ótimo (pH 8.0) a 12 h de incubação. CH- Protamex, CH-Bromelain e CH-Papain alcançaram o pH (pH7.0) ótimo às 6h de incubação, enquanto ch-flavorzyme continuou a diminuir de pH6.39 para pH5.69 para incubação de 24 horas (Figura 1). O pH de um hidrolise proteico é um fator importante que regula as reações de hidrólise enzimática[13]. Portanto, a geração de hidrólises de colágeno em condições de pH diferentes pode ser devido a alterações dependentes de pH na conformação enzimática, o que pode impactar suas propriedades bioativas e físico-químicas.
2.1.2. Sulfato de sulfato-poliacrilamida de sódio Eletroforese gel (SDS-PAGE)
São mostrados perfis de eletroforese de gel de sulfato de sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) de CHs tratados com vários proteases por 24 horas (Figura2). O perfil do peptídeo da suspensão do colágeno (a 0 h)mostrou uma faixa visível na faixa de baixo a alto peso molecular. Os resultados indicaram hidrólise rápida em CH-Alcalase, CH-Neutrase, CH-Bronneline e CH-Protamex, pois não havia bandas após a incubação de 3 h. As faixas de alto peso molecular de CH-Alcalase, CH-Neutrase e CH-Protamex diminuíram de forma dependente do tempo. No entanto, o CH-Bromeline não variou com o tempo de incubação porque tem cerveja completamente hidrolisada após apenas 1 h de incubação. Curiosamente, os CHs desapareceram completamente quando a amostra reagiu com Alcalase ou Neutrase por 6h, indicando que o colágeno agiu como um substrato adequado para algumas das outras enzimas testadas.benefícios do extrato de cistanche,No entanto, bandas de CH-Flavorzyme e CH-Papain apareceram na faixa de baixo a alto peso molecular após 24 h. As proteínas podem ser parcialmente hidrolisados em peptídeos ou aminoácidos por hidrólise enzimática, dependendo do tipo protease, tempo de incubação e a razão protease-substrato (quantidade de proteína)[14]. O processo de hidrólise enzimática é determinado principalmente se o tipo de protease envolvido é uma endopeptidase ou uma exopeptidase [15,16]. Uma vez que Alcalase, Neutrase e Protamex são endopeptidases, seus processos de hidrólise podem ser esperados para quebrar ligações de peptídeos de aminoácidos não terminais aleatoriamente, facilitando assim mais hidrólise das proteínas. Por outro lado, Flavorzyme é tanto um endo-e exopeptidase, que quebra o não ou N-terminal de cadeias de peptídeos. Neste estudo, a proteína do colágeno continha locais de ligação, mais suscetíveis à atividade exopeptidase do que à atividade endopeptidase da Flavorzyme. Assim, devido à atividade exopeptidase, a hidrólise das proteínas de colágeno pela Flavorzyme envolveu a quebra passo a passo das ligações de peptídeos do N-terminal de aminoácidos, que desaceleraram a hidrólise proteica.
2.1.3. Recuperação de proteínas e Conteúdo gratuito do Grupo Amino
A recuperação proteica dos CHs obtidos através de diferentes proteases comerciais é mostrada (Figura 3A). O controle (suspensão do colágeno) apresentou teor de recuperação de proteínas de 1,19 mg/mL. A recuperação de proteínas é um parâmetro da eficiência da hidrólise enzimática. O baixo teor de recuperação de proteínas de CH é indicativo de aumento da divisão proteica. Além disso, a recuperação de proteínas se correlaciona bem com a solubilidade da proteína. Uma maior atividade hidrolítica pode ser causada pelo aumento das cadeias laterais hidrofóbicas expostas, levando ao aumento das interações hidrofóbicas entre proteínas e/ou peptídeos. Essas cadeias laterais hidrofóbicas podem levar à diminuição da solubilidade da proteína, resultando em aumento da recuperação de proteínas de hidrolicados. Em nosso estudo, o conteúdo de recuperação de proteínas estava bem correlacionado com as mudanças nos padrões de SDS-PAGE. Os menores e mais altos níveis de teor de teor de recuperação de proteínas foram registrados para hidrólise alcalase e flavorzyme, respectivamente. Para a eficiência da hidrólise relacionada ao tempo de incubação, CH-Alcalase, CH-Bromelain e CH-Protamex diminuíram drasticamente dentro de uma hora de incubação em comparação com o controle. A diminuição do teor de recuperação de proteínas resultante da hidrólise proteica mostrou uma relação inversa com o conteúdo do grupo amino. Além disso, a maioria dos CHs, com exceção do CH-Neutrase, exibiu baixo teor de proteína entre 3h e 12 h. Após 24hincubation, seu teor de proteínas aumentou novamente em CH-Alcalase, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-Bromeline, CH-Protamex e CH-Papan da seguinte forma: 0,83 mg/mL,1,29 mg/mL, 0,75 mg/mL, 0,97 mg/mL, 0,77 mg/ml, e 1,11 mg/mL, respectivamente. Alguns relatos indicam que o tempo ideal de hidrólise depende de vários fatores como as espécies selecionadas, a matéria-prima, a enzima utilizada, a taxa de matéria-prima/enzima, a concentração da enzima e o grau de hidrólise perseguido, etc. [16]. Alguns relatórios indicam que a hidrólise enzimática estendida (acima de 24 h) pode levar a uma redução da atividade de protease; assim, a hidrólise enzimática deve ser realizada dentro de 24 h de hidrólise enzimática [17,18].
O conteúdo gratuito do grupo amino de CH, que é um indicador de eficiência da hidrólise enzimática, foi estimado (Figura 3B). O resultado esperado da quebra da proteína é que a proteína pode ser hidrolisada em produtos de peptídeos mais curtos. O conteúdo gratuito do grupo amino do controle foi inicialmente de 0,14 mg/mL. O conteúdo gratuito do grupo amino de todos os CHs aumentou drasticamente com o aumento do tempo de incubação. Após a incubação de 24 horas, o conteúdo gratuito do grupo amino por ordem descendente foi: CH-Alcalase (1,00 mg/mL)>CH-Protamex(0,70 mg/mL)> CH-Neutrase(0,68 mg/mL)>CH-Bromeline (0,67 mg/mL)>CH-Flavorzyme (0,53 mg/mL)>CH-Papain(0,40 mg/mL). Diferenças comuns na proteína total ou no teor livre de amino group de amostras enzimáticas hidrolisada podem estar relacionadas à especificidade da enzima. Depende das propriedades de uma enzima durante o processo de hidrólise enzimática [16,17]. Por exemplo, proteases alcalinas (como Alcalase) apresentam atividades hidrolíticas mais elevadas em comparação com proteases ácidas ou neutras.
2.2. Efeito de ultrafiltração nas propriedades de hidrolise de colágeno
Um processo de ultrafiltração pode ser um método útil e industrialmente vantajoso para produzir pequenas frações de peptídeos com tamanho molecular desejado e alta bioatividade, dependendo da composição do hidrolise inicial e da atividade que está sendo estudada [19]. Solubilidade, conteúdo de grupo amino gratuito e o rendimento de CHs após a liofilização é mostrado (Tabela 1). O teor de solubilidade e grupo amino livre do controle foi de 11,95% e 0,79%, respectivamente. Após hidrólise enzimática e ultrafiltração com corte de peso molecular de 3 kDa, foram observados o maior teor de solubilidade (21,17%) e o teor livre de grupo de amino (14,17%) em CH-Alcalase<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">
O peso molecular médio dos hidrolicados de proteína é um fator importante que determina suas propriedades biológicas [19]. Geralmente, uma fração média com MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa representa gelatina, e uma fração média com MW> 300 kDa representa colágeno [20,21]. A distribuição relativa do peso molecular do controle (amostra de pré-tratamento), CH-Alcalase e CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">
A composição do aminoácido nos CHs é mostrada (Tabela 2). O CHS por diferentes proteases tinha diferentes composições de aminoácidos e propriedades antioxidantes [23]. A composição de aminoácidos de colágeno era rica em glicina(Gly), prolina(Pro) e ácido glutamico(Glu). O teor de aminoácidos de CHs (CH-Alcalase e ch-alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">
Este artigo é extraído de Moléculas 2019, 24, 1104; doi:10.3390/moléculas24061104 www.mdpi.com/journal/molecules
