Local de vulnerabilidade no SARS-CoV-2 Spike induz anticorpo amplamente protetor contra subvariantes de ômícrons antigenicamente distintas

A rápida evolução das variantes Omicron do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) enfatizou a necessidade de identificar anticorpos com amplas capacidades de neutralização para informar futuras terapias monoclonais e estratégias de vacinação. Aqui, identificamos S728-1157, um anticorpo amplamente neutralizante (bnAb) direcionado ao local de ligação ao receptor (RBS) que foi derivado de um indivíduo previamente infectado com WT SARS-CoV-2 antes da disseminação de variantes preocupantes (VOCs). S728-1157 demonstrou ampla neutralização cruzada de todas as variantes dominantes, incluindo D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu e Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ B.1/XBB). Além disso, S728-1157 protegeu hamsters contra desafios in vivo com vírus WT, Delta e BA.1. A análise estrutural mostrou que este anticorpo tem como alvo um epítopo de classe 1/RBS-A no domínio de ligação ao receptor através de múltiplas interações hidrofóbicas e polares com a sua região determinante de complementaridade da cadeia pesada 3 (CDR-H3), além de motivos comuns em CDR-H1/ CDR-H2 de anticorpos classe 1/RBS-A. É importante ressaltar que este epítopo era mais facilmente acessível no estado aberto e de pré-fusão, ou nas construções de espícula estabilizadas com hexaprolina (6P), em comparação com as construções de diprolina (2P). No geral, S728-1157 demonstra amplo potencial terapêutico e pode informar projetos de vacinas direcionadas contra futuras variantes do SARS-CoV-2.

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Introdução

Desde o início da pandemia em dezembro de 2019, o vírus da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) levou a mais de 660 milhões de casos de doença por coronavírus 2019 (COVID-19) e mais de 6,5 milhões de mortes em todo o mundo. Embora o rápido desenvolvimento e distribuição de vacinas e terapêuticas tenham restringido em grande medida o efeito da COVID-19, o surgimento de variantes preocupantes circulantes (VOCs) continua a representar uma grande ameaça devido ao potencial de maior evasão imunológica e patogenicidade aumentada. A variante D614G foi a primeira variante a surgir e tornou-se universalmente predominante a partir de então. Em comparação com WT, a variante D614G exibiu maior transmissibilidade em vez de maior patogenicidade e, portanto, era improvável que reduzisse a eficácia das vacinas em ensaios clínicos (1). Entre o surgimento do D614G até outubro de 2021, 4 VOCs adicionais significativos evoluíram em todo o mundo, incluindo Alpha, Beta, Gamma e Delta. Entre estas variantes, a Delta tornou-se uma séria ameaça global devido à sua transmissibilidade, aumento da gravidade da doença e evasão imunitária parcial, como demonstrado pela capacidade reduzida do soro policlonal e dos mAbs para neutralizar esta estirpe (2–6). Pouco depois, em novembro de 2021, a variante Omicron foi identificada e anunciada como um novo VOC. Esta variante possuía o maior número de mutações até à data e parecia espalhar-se mais rapidamente do que as estirpes anteriores (7, 8). Atualmente, há uma ampla gama de sub-linhagens Omicron que levam a novos casos de COVID-19, com BQ.1, BQ.1.1 e XBB.1.5 tornando-se dominantes sobre BA.5 e sendo responsáveis ​​pela maioria dos novos casos em todo o mundo na época da escrita. As variantes Omicron podem escapar do reconhecimento pela imunidade associada à vacina COVID-19 em graus variados, reduzindo significativamente a potência neutralizante dos anticorpos séricos de indivíduos convalescentes, totalmente vacinados com mRNA e indivíduos reforçados com o novo bivalente WT/BA.5 Vacina de mRNA (9, 10). Da mesma forma, as variantes Omicron foram capazes de escapar da ligação de vários mAbs terapêuticos de autorização de uso de emergência (EUA), embora estes tenham demonstrado anteriormente serem eficazes contra VOCs anteriores (10–12). Devido à redução da neutralização contra Omicron e à ameaça contínua de futuros COVs, há uma necessidade urgente de identificar anticorpos neutralizantes amplos e potentes que possam proteger contra diversas linhagens de SARS-CoV{38}} em evolução. Neste estudo, identificamos um potente mAb reativo ao domínio de ligação ao receptor (reativo a RBD) do sangue periférico de um indivíduo convalescente de SARS-CoV-2 que neutralizou efetivamente Alfa, Beta, Kappa, Delta, Mu, e variantes Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 e XBB). Este mAb, S728-1157, reduziu significativamente as cargas virais BA.1 Omicron, Delta e WT nos pulmões e na mucosa nasal após desafio in vivo em hamsters. S728-1157 liga-se ao sítio de ligação do receptor (RBS) que fica totalmente exposto quando o RBD no pico está na conformação ascendente. O mAb usa motivos encontrados em CDR-H1 e CDR-H2 que são comuns aos anticorpos IGHV3-53/3-66 classe 1/RBS-A (13, 14), mas também através de extensos contatos exclusivos com CDR -H3 para contornar mutações nos picos de VOCs. Isto sugere que o desenho racional de futuros reforços de vacinas cobrindo variantes Omicron deve ser modificado para apresentar um pico estabilizado na configuração maioritariamente ascendente para induzir de forma óptima mAbs de classe 1/RBS-A que possuem características semelhantes de CDR-H3.

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Resultados

Isolamento de mAbs reativos a RBD que exibem diversos padrões de neutralização e potência. Antes da disseminação das linhagens Omicron, caracterizamos anteriormente 43 mAbs visando epítopos distintos na proteína spike, incluindo o domínio N-terminal (NTD), RBD e subunidade 2 (S2). Nenhum desses anticorpos foi capaz de neutralizar as variantes do SARS-CoV-2 que circulavam naquela época (15). Neste estudo, um painel adicional de mAbs reativos a RBD foi expresso a partir de 3 indivíduos com alta resposta que montaram respostas robustas de IgG anti-pico, conforme definido anteriormente (16) (Tabelas Suplementares 1 e 3; material suplementar disponível online com este artigo; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Embora a proporção de células B de ligação a RBD de pico tenha sido semelhante em respondedores altos em comparação com respondedores médios e baixos (Figura 1, A-C), as taxas de hipermutação somática de cadeia pesada foram significativamente maiores no grupo de alta resposta (Figura 1 , D e E), sugerindo que esses indivíduos podem ter o maior potencial para gerar mAbs potentes com reação cruzada (16). Estes anticorpos foram investigados adicionalmente contra mutantes RBD para identificar as suas classificações de epítopos (17). Entre 14 mAbs reativos a RBD, identificamos 4 mAbs de classe 2, 2 mAbs de classe 3 e 8 mAbs não classificados que mostraram pouca ou nenhuma redução na ligação contra quaisquer mutantes chave de RBD testados (Figura 1F). Deve-se notar que os anticorpos de classe 2, classe 3 e classe 4 correspondem aproximadamente aos epítopos RBS BD, S309 e CR3022 definidos em estudos anteriores (13, 18). Os mAbs RBD de classe 2 e 3 não reconheceram um mutante RBD multivariante contendo substituições K417N/E484K/L452R/N501Y, um RBD projetado artificialmente para incluir mutações-chave para o escape do vírus (17, 18), nem demonstraram qualquer reatividade cruzada com o RBD de SARS-CoV-1 e síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS)-CoV (Figura 1F). Funcionalmente, os mAbs RBD de classe 2 e 3 neutralizaram potentemente as variantes D614G e Delta, mas a atividade neutralizante foi mais limitada contra Beta, Kappa e Mu (Figura 1G). Nenhum dos anticorpos de classe 2 ou 3 testados neutralizou qualquer variante Omicron testada.

Em contraste, a maioria dos mAbs não classificados ligou-se à multivariante RBD e teve reação cruzada com o RBD SARS-CoV-1 (Figura 1F). Entre estes, identificamos 3 mAbs, S451-1140, S626-161 e S728-1157, que mostraram alta potência de neutralização contra D614G e Beta, Delta, Kappa, Mu e Neutralização cruzada Omicron BA.1 com concentração inibitória de 99% (IC99) na faixa de 20–2.500 ng/mL (Figura 1G). Dada a ampla potência de neutralização destes 3 mAbs, além da plataforma de ensaio de placas, também realizamos a atividade de neutralização contra BA.2.75 autêntico, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, Vírus BA.5 e XBB usando teste de neutralização por redução de foco (FRNT) (Figura 1G). Destes, S728-1157 exibiu altas atividades neutralizantes contra o painel de variantes Omicron incluindo BA.1, BA.2, BA.4 e BA.5, com um IC99 de até 100 ng/mL conforme medido por um ensaio de placa. Um cenário semelhante foi observado usando FRNT, onde S728-1157 manteve sua alta atividade de neutralização contra BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 e XBB com um IC50 na faixa de 8–300 ng /mL (Figura 1G). S451-1140 neutralizou BA.1, BA.2, BA.2.75 e BL.1 de forma potente, mas não BA.4 e BA.5, como observado em ambas as plataformas de ensaio de neutralização. Por outro lado, S626-161 não demonstrou atividade neutralizante contra variantes Omicron além da variante BA.1 (Figura 1G). Embora S626-161 tivesse uma potência de neutralização mais baixa contra os COV testados do que os outros 2 anticorpos, foi o único mAb que mostrou reatividade cruzada não apenas com SARS CoV-1 RBD, mas também foi capaz de neutralizar morcegos coronavírus WIV-1 e RsSHC014 (Figura 1, F e G). Estes dados sugerem que S626-161 reconhece um epítopo conservado que é partilhado entre estas linhagens de arbovírus, mas está ausente em BA.2 e estirpes posteriores. Além disso, comparado com S728-1157 e S451-1140, S626-161 tem um CDR-H3 mais longo que poderia fornecer uma capacidade aprimorada de reconhecer uma mancha altamente conservada de resíduos compartilhados entre arbovírus, conforme descrito em estudo anterior (19) (Figura Suplementar 1). Ao comparar os genes variáveis ​​de imunoglobulina de cadeia pesada (IGHV) e de cadeia leve (IGLV ou IGKV) desses 3 mAbs com o banco de dados de mAbs neutralizantes de SARS-CoV-2 disponível (13, 15, 20–27), descobrimos que a cadeia pesada genes variáveis ​​utilizados por S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) e S626-161 (IGHV4-39) têm foi relatado anteriormente que codifica vários anticorpos potencialmente neutralizantes do SARS-CoV -2 direcionados ao RBD (21, 22, 28, 29). No entanto, apenas S728-1157 teve pares únicos de genes variáveis ​​de cadeia pesada e leve que não foram relatados no banco de dados (Tabela Suplementar 3), indicando que não é um clonótipo público.

Figura 1. Caracterização de mAbs reativos a RBD isolados de indivíduos convalescentes de COVID-19

Esses 3 mAbs (S451-1140, S626-161 e S728-1157) foram caracterizados posteriormente para determinar sua amplitude de ligação contra COVs SARSCoV-2 (Figura 2, A e B) . O pico estabilizado por pré-fusão contendo 2-substituições de prolina na subunidade S2 (2P; diprolina) demonstrou ser um imunógeno superior em comparação com o pico WT e é a base de vários SARS-CoV atuais-2 vacinas, incluindo vacinas baseadas em mRNA (30, 31). Mais recentemente, foi relatado que a proteína spike estabilizada com 6 prolinas (6P; hexaprolina) aumenta a expressão e é ainda mais estável do que a construção original de diprolina; como resultado, foi proposto para uso na próxima geração de vacinas contra COVID-19 (32, 33). Para determinar se existem diferenças de antigenicidade entre as construções de pico de diprolina e hexaprolina, ambos os imunogénios foram incluídos no nosso painel de teste. Conforme medido por ELISA, descobrimos que 3 mAbs ligaram o antígeno do pico 6P-WT em maior extensão em comparação com o pico WT-2P (Figura 2, A e B). Todos os 3 mAbs mostraram ligação comparável aos picos dos vírus Alfa, Beta, Gama e Delta, em relação ao WT-2P (Figura 2, A e B). No entanto, as reactividades de ligação destes 3 mAbs foram substancialmente reduzidas contra um painel de antigénios da família Omicron (Figura 2, B e C). A ligação S451-1140 foi sensível a mutações encontradas em BA.1 e BA.2, resultando em uma grande diminuição na ligação e uma diminuição de 31- vezes na neutralização contra essas variantes em comparação com WT-2 Antígeno P e vírus D614G, respectivamente (Figura 2B). O mAb neutralizante cruzado de sarbecovírus, S626-161, também apresentou ligação reduzida de 1,2- a 3,5-vezes ao antígeno spike BA.1, o que pode ser responsável por um {{45} redução de } vezes na atividade de neutralização contra BA.1 (Figura 1G e Figura 2, B e C). Para o anticorpo amplamente neutralizante mais potente (bnAb), S728-1157, a ligação aos antígenos Omicron foi reduzida em menor extensão (variando de 1,1- a 4,4- vezes) em comparação com WT-2P aumentou e não foi afetado na atividade neutralizante (Figura 1G e Figura 2, B e C). A diminuição substancial na ligação do mAb neutralizante de Omicron ao pico BA.1 pode ser devida a alterações em sua mobilidade e relacionada ao empacotamento apertado das estruturas Omicron 3-RBD-down e preferência por 1- até RBD que auxiliam na evasão de anticorpos, conforme relatado por um estudo anterior (34). As mutações estabilizadoras 2P e 6P também têm efeitos diferenciais nas variantes Omicron, onde todos os 3 mAbs mostraram mais de 2,{67}}vezes maior ligação ao pico BA.1-6P em comparação com o BA.1-2P versão, mas aumentou apenas marginalmente a ligação às versões de pico BA.2 e BA.4/5 6P em comparação com suas versões 2P em 1,2 × a 1,4 ×, sugerindo acessibilidade ligeiramente melhor de mAbs neutralizantes de Omicron às versões hexapolo, especialmente para a construção do pico BA.1. Além do ELISA, a interferometria da biocamada (BLI) foi utilizada para quantificar a taxa de ligação e as constantes de equilíbrio (kon, koff e KD) destes 3 mAbs para um painel de antígenos de espícula (Figura 2 suplementar). As taxas de reconhecimento kon da ligação do antígeno do fragmento (Fab) aos picos de hexaprolina foram de 1,5- a 3,3- vezes mais rápidas quando comparadas com picos de diprolina (Figura Suplementar 2, B e C), mostrando que os anticorpos ligaram-se à construção 6P mais rapidamente do que à construção 2P. Isto poderia ser esperado se os epítopos fossem mais acessíveis no RBD no estado aberto no pico de hexaprolina. Exceto para S626- 161, os Fabs dissociaram-se do pico de hexaprolina mais lentamente (teve um koff mais baixo) do que o pico de diprolina, de modo que o KD geral mostrou que S728-1157 e S451-1140 se ligaram a o pico de hexaprolina com maior afinidade (Figura Suplementar 2, B e C). O aumento na ligação ao pico de hexaprolina foi ainda mais notável para IgG intacta pelo modelo de interação 1:2, como mostrado pelos mAbs S728-1157 e S451- 1140, consistente com a exposição de múltiplos epítopos com estabilização 6P permitindo avidez melhorada (Figura Suplementar 2, A e C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que os epítopos alvo podem ser comparativamente mais acessíveis no pico estabilizado com 6P quando o RBD está no estado aberto. Análises estruturais foram realizadas em seguida para verificar essa conjectura.

Figura 2. Amplitude de ligação de mAbs neutralizantes de Omicron

Análise estrutural de mAbs amplamente neutralizantes. Como uma primeira aproximação dos epítopos ligados, foi utilizado um ensaio de competição ELISA para determinar se estes 3 mAbs amplamente neutralizantes partilhavam alguma sobreposição com o nosso painel atual de mAbs, uma coleção de mAbs com especificidades de epítopos conhecidas de estudos anteriores (15, 25, 35) e 2 outros mAbs atualmente em uso clínico, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) e REGN10933 (Regeneron) (37). Os locais de ligação de S451-1140 e S728-1157 se sobrepuseram parcialmente com CC12.3 (23, 25), um anticorpo neutralizante de classe 1, e a maioria dos anticorpos de classe 2, incluindo LY-CoV555 e REGN10933, mas não com anticorpos de classe 3 e classe 4 (Figura 3A). S626-161 compartilhou uma sobreposição notável na região de ligação com classe 1 CC12.3, vários anticorpos de classe 4, incluindo CR3022, e outros anticorpos não classificados, embora tivesse alguma sobreposição parcial com vários anticorpos de classe 2 e um único anticorpo de classe 3 (Figura 3A). Analogamente, um ensaio de competição BLI revelou que S451-1140 e S728-1157 competiram fortemente entre si pela ligação ao pico WT-6P, enquanto S626-161 não (Figura Suplementar 3). No geral, esses dados sugerem que S451-1140 e S728-1157 reconhecem epítopos semelhantes que são distintos de S626-161.

Figura 3. Mecanismo de ampla neutralização de S728-1157

O anticorpo S728-1157 foi codificado por IGHV3-66 e possuía uma curta região determinante de complementaridade 3 (CDR-H3). Notavelmente, mAbs que se ligam ao RBS no modo de ligação 1 (ou seja, RBS-A ou local de classe 1), tipificados por CC12.1, CC12.3, B38 e C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), tendem a usar IGHV3-53 ou 3-66 e são sensíveis a mutações de VOC (40). No entanto, a região CDR-H3 de S728-1157 é altamente distinta de outros anticorpos desta classe, potencialmente responsável pela sua atividade mais ampla. Para entender a base estrutural da ampla neutralização por S728-1157 neste epítopo, resolvemos uma estrutura de microscopia crioeletrônica (crio-EM) (Figura 3B) de IgG S728-1157 em complexo com pico WT{ {31}}P-Mut7, uma versão do pico WT-6P que possui uma ligação dissulfeto interprotômero em C705 e C883, com resolução global de aproximadamente 3,3 Å (Figura 4E suplementar). Usando expansão de simetria, classificação focada e métodos de refinamento, alcançamos resolução local na interface RBD-Fv para aproximadamente 4 Å (Figura Suplementar 4E e Tabela Suplementar 8). Uma estrutura cristalina de S728-1157 Fab foi determinada com resolução de 3,1 Å e usada para construir o modelo atômico na interface RBD-Fv. Nossas estruturas confirmam que S728-1157 ligou o epítopo RBS-A (ou classe 1) na conformação RBD-up (Figura 3B e Figura Suplementar 4E), semelhante a outro IGHV3-53/{{55} } anticorpos (Figura 3C). O bloqueio estérico do sítio de ligação da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) por S728-1157 explica sua alta potência de neutralização contra SARS-CoV-2. O motivo 32NY33 e o motivo 53SGGS56 (23) em S728-1157 CDR-H1 e -H2 interagem com o RBD quase da mesma maneira que CC12.3 (Figura Suplementar 4, B e C). No entanto, em comparação com VH 98DF99 em CC12.3, VH 98DY99 em S728-1157 CDR-H3 forma interações mais extensas, incluindo interações hidrofóbicas e polares, com o RBD, o que pode ser responsável pela ampla neutralização contra VOCs (Figura Tabelas 3D e Suplementares 6 e 7). A diglicina VH 100GG101 em S728- 1157 CDR-H3 também pode facilitar uma ligação mais extensa em comparação com VH Y100 em CC12.3, provavelmente devido à flexibilidade nos resíduos de glicina que levam a uma conformação diferente da ponta do CDR -H3 loop e uma mudança relativa de resíduos em 98DY99.

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Embora os VOCs Omicron tenham extensas mutações no RBD, a maioria desses resíduos não interage com S728-1157, pois a ligação ainda é observada (Figura 4A suplementar). Do nosso modelo de pico WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157, prevê-se que Y505 a VL Q31 e E484 a VH Y99 façam ligações de hidrogênio (Figura 4D suplementar e Tabela 6 suplementar ), que têm potencial para serem interrompidos pelas mutações Omicron Y505H e E484A. No entanto, uma mutação Y505H ainda permitiria uma ligação de hidrogénio com VL Q31, e uma mutação E484A adicionaria outra cadeia lateral hidrofóbica perto dos resíduos hidrofóbicos VL Y99, F456 e Y489. Esses contatos podem explicar, em parte, o mecanismo que permite que S728-1157 retenha atividade neutralizante, embora reduzida, contra o antígeno spike BA.1 (Figura 1G e Figura 2B). O antígeno BA.1, por sua vez, está possivelmente relacionado às mutações Omicron que alteram a paisagem conformacional da proteína spike (34). No entanto, vários resíduos somaticamente mutados, ou seja, VH L27, L28, R31, F58 e VL V28 e Q31, em S728-1157 estão envolvidos na interação com SARS-CoV-2 RBD (Figura Suplementar 1 e Tabela Suplementar 7), o que também pode contribuir para sua ampla reatividade em comparação com CC12.3. No geral, nossos estudos estruturais revelaram a base de uma ampla neutralização de S728-1157 que pode acomodar a maioria das mutações nos COVs do SARS-CoV-2.

Figura 4. Eficácia protetora de bnAbs contra infecção por SARS-CoV-2 em hamsters.

S728-1157 reduz a replicação de SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta e WT SARS-CoV-2 em hamsters sírios. Para avaliar a eficácia protetora de nossos mAbs amplamente neutralizantes, utilizamos um modelo de infecção de hamster sírio dourado que tem sido amplamente utilizado para SARS-CoV-2. Hamsters receberam 5 mg/kg de nossos mAbs de teste ou um controle de isotipo direcionado a um antígeno irrelevante (glicoproteína de ebolavírus) por meio de injeção intraperitoneal 1 dia após a infecção com vírus SARS CoV-2. Os tecidos pulmonares e nasais foram coletados 4 dias após a infecção (Figura 4A). A administração terapêutica de S728-1157 resultou em títulos reduzidos de variantes WT, BA.1 Omicron e Delta nas conchas nasais e nos pulmões de hamsters infectados (Figura 4, B – D). Curiosamente, o efeito de S728-1157 nos pulmões foi dramático, reduzindo as cargas virais de WT e BA.1 Omicron em aproximadamente 104PFU, com os títulos virais da variante BA.1 Omicron sendo completamente abolidos (Figura 4C). Em contraste com a neutralização in vitro (Figura 1G), S451-1140 não reduziu a replicação viral BA.1 Omicron no pulmão e nas conchas nasais, indicando uma desconexão entre a neutralização in vitro e a proteção in vivo para este clone (Figura 4E) . Em comparação, a administração de S626-161 resultou em reduções marginalmente significativas nos títulos virais pulmonares após o desafio WT e BA.1 (Figura 4, F e G). Estes dados sublinham que, para definir com precisão mAbs amplamente protectores, é necessária a avaliação da eficácia da protecção em paralelo com a actividade de neutralização. Seguindo em frente, será interessante examinar até que ponto a capacidade de proteção de S728-1157 é dependente de Fc. No geral, S728-1157 representa um mAb promissor com ampla eficácia de neutralização contra variantes do SARS CoV-2 que são capazes de reduzir drasticamente a replicação de WT, Delta e BA.1 in vivo.

A infecção por SARS-CoV-2 raramente provoca mAbs potentes de neutralização cruzada semelhantes a S728-1157. Dada a neutralização cruzada e o potencial profilático de S728-1157, procuramos avaliar se anticorpos semelhantes a S728-1157 são comumente induzidos entre respostas policlonais em pacientes com SARS-CoV-2. Para avaliar isso, realizamos ELISAs de competição usando soro convalescente para detectar títulos de anticorpos anti-RBD que poderiam competir pela ligação com S728-1157 (Figura 5A). Os indivíduos foram divididos em 3 grupos com base na magnitude das respostas de anticorpos, conforme definido anteriormente (15, 16). Embora os respondedores altos e moderados tivessem títulos mais elevados de anticorpos séricos S728-1157-competitivos em comparação com os respondedores baixos (Figura 5B), os títulos foram bastante baixos em todos os grupos, sugerindo que é incomum adquirir níveis elevados de S{{ Anticorpos semelhantes a 18}} em soro policlonal após infecção por WT SARS-CoV-2. Além de S728-1157, testamos a competição do soro convalescente com outros mAbs, incluindo S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 e CC12.3. Semelhante a S728-1157, observamos títulos relativamente baixos de anticorpos competindo com S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 e CC12.3 em soro policlonal da maioria dos convalescentes indivíduos (Figura 5, C – F e H). No entanto, os respondedores altos tendem a ter títulos significativamente mais elevados contra os mAbs neutralizantes do que os respondedores baixos (Figura 5, B – F e H). Em contraste, os anticorpos direcionados ao sítio do epítopo CR3022 foram mais pronunciados em indivíduos convalescentes, sugerindo o enriquecimento de anticorpos RBD de classe 4 em soro policlonal (Figura 5G). Notavelmente, não houve diferença significativa nos títulos de CR3022 entre os três grupos respondedores, sugerindo que os anticorpos no local 3022-de CR foram induzidos consistentemente durante a infecção por WT SARS-CoV-2 na maioria dos indivíduos. Curiosamente, em comparação com CC12.3, S728-1157 foi detectado em níveis 4- vezes mais baixos no soro de pacientes com alta resposta. Assim, apesar dos anticorpos da classe 1 serem frequentemente induzidos por infecção natural e vacinação (14, 20, 28, 29, 41-43), os nossos dados sugerem que os anticorpos semelhantes a S728-1157 que representam um subconjunto desta classe são comparativamente raros.

Além disso, examinamos a diferença na reatividade ao pico estabilizado com 2P versus 6P em nossos soros de coorte convalescentes (Figura 5, I – K). Descobrimos que todos os três grupos respondedores montaram anticorpos reativos anti-spike contra spike WT estabilizado com 6P em maior extensão do que spike WT estabilizado com 2P, por um fator de 6 a 11 vezes (Figura 5J), indicando que o os principais epítopos antigênicos foram melhor exibidos ou estabilizados no antígeno estabilizado com 6P. Usando as mesmas amostras, os respondedores altos e moderados também apresentaram títulos mais baixos de anticorpos anti-spike contra BA.1-2P do que BA.1-6P, em 4 a 5 vezes (Figura 5K). É digno de nota que os respondedores baixos tiveram uma alteração menor na reatividade de ligação contra o pico BA.1 Omicron-2P e 6P (redução de 2- vezes) em comparação com o pico WT-2P e 6P ({ {28}}redução de vezes) (Figura 5, J e K), sugerindo que o anticorpo sérico contra epítopos reativos a BA.1 Omicron pode ser mais limitado em indivíduos com baixa resposta. No geral, estes dados sugerem que há uma ligação policlonal melhorada induzida pela infecção natural ao pico estabilizado com 6P, tanto para os vírus WT como para o Omicron.

Anticorpos semelhantes a S728-1157 são induzidos de forma ideal no contexto da imunidade híbrida. A infecção primária por SARS-CoV-2 sem vacinação tornou-se rara no cenário global atual, e vários estudos relataram que a imunidade ao SARS-CoV-2 difere entre indivíduos com históricos específicos de vacinação/infecção. Como resultado, em seguida, procuramos investigar quais exposições comuns, além da infecção por WT apenas com SARS-CoV ancestral-2, induziriam efetivamente anticorpos semelhantes a S728-1157 no plasma de vacinados monovalentes baseados em mRNA com e sem infecção. Obtivemos a bioespécime necessária da coorte do estudo Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARIS), que acompanhou longitudinalmente os profissionais de saúde desde o início da pandemia (44). Selecionamos amostras de plasma de participantes do estudo totalmente imunizados (2 × vacinados) com e sem infecção, bem como de participantes reforçados (3 × vacinados) com e sem infecção. Além disso, também incluímos amostras de participantes do estudo que receberam a vacina bivalente de mRNA (WA1/2020 ancestral mais Omicron BA.5) (Figura 6A e Tabela Suplementar 2). As infecções revolucionárias em participantes que receberam vacinações de reforço ocorreram num momento em que as linhagens Omicron substituíram todas as outras linhagens SARS-CoV-2 na área metropolitana de Nova Iorque. Descobrimos que os indivíduos duplamente vacinados apresentaram os títulos mais baixos de anticorpos séricos competitivos S728-1157 entre os 5 grupos de amostras testadas (Figura 6B). Notavelmente, estes níveis foram semelhantes aos observados na nossa coorte convalescente não vacinada (todos os respondedores; Figura 5B). Em comparação, indivíduos com histórico de infecção natural, incluindo indivíduos convalescentes com 2 de 3 doses de vacina, e indivíduos que tiveram uma infecção disruptiva e receberam um reforço bivalente, apresentaram níveis significativamente mais elevados de elicitação de S728-1157 em comparação com não infectados. mas indivíduos vacinados (Figura 6B). Embora o grupo de dose 3-não infectado tenha apresentado apenas um aumento não significativo em comparação com o grupo de dose 2-, a divisão pareada por tipo de vacina indicou que terceiras doses homólogas de BNT162b2 e mRNA-1273 aumentaram significativamente S{{ 38}}títulos de anticorpos neutralizantes em 2,72 × e 2,85 ×, respectivamente (Figura 6, C e D). Para observar, entre os participantes com 3 contatos totais com pico por qualquer meio, os títulos de anticorpos semelhantes a S728-1157- foram 3 × maiores em vacinados duplos convalescentes em comparação com vacinados triplos virgens de infecção, sugerindo que SARS-CoV{{ 51}} a infecção induz de forma mais otimizada esse clonótipo. Entre os grupos de imunidade híbrida, notamos que a maioria dos indivíduos reforçados com avanço que receberam a dose da vacina de reforço bivalente tinham títulos de anticorpos S728-1157 apenas marginalmente mais altos em comparação com grupos vacinados convalescentes pré-ómicron, sugerindo que o S{{53 }} o título provavelmente estava se aproximando de um platô após 3 exposições. Também investigamos os títulos de anticorpos policlonais que competiram com CC12.3 e CR3022 além de S728-1157. Todos os indivíduos exibiram títulos relativamente altos de anticorpos semelhantes a CC12.3- e CR3022-, independentemente do número e tipo de exposições (Figura 5 suplementar), ao contrário do que observamos para S728-1157- como anticorpos. No geral, esses dados indicam que a infecção por SARS-CoV-2 e a vacinação com mRNA contribuem para a indução de anticorpos semelhantes a S728-1157-, com a infecção desempenhando um papel mais dominante em indivíduos vacinados.

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Finalmente, ao comparar as respostas contra o pico estabilizado por 2P versus 6P na coorte de vacinação com mRNA, descobrimos que a maioria dos grupos provocou níveis semelhantes de anticorpos contra ambas as construções. A exceção a isso foi o grupo triplamente vacinado não infectado, que demonstrou reatividade estatisticamente maior, embora apenas ligeiramente aumentada, ao 2P em comparação com o pico estabilizado por 6P (Figura 6E). Esses dados sugerem que, em contraste com a infecção natural (Figura 5, J e K), a vacinação por si só produz uma resposta policlonal que é mais restrita aos epítopos na construção Spike-2P, em linha com a construção Spike{{12 }}P formulação das vacinas atuais. Em última análise, essas descobertas apoiam a ideia de que a estabilização 6P de futuras vacinas contra SARS-CoV-2 poderia ser de grande benefício na indução de clonótipos de anticorpos amplamente protetores como S728-1157.

Figura 5. Competição de anticorpos séricos convalescentes com mAbs amplamente neutralizantes reativos a RBD e comparação da resposta de anticorpos séricos contra picos estabilizados com 6P versus 2P

Figura 6. Competição de anticorpos séricos vacinados com mRNA com mAbs reativos a RBD neutralizantes S728-1157 e comparação da resposta de anticorpos séricos contra picos estabilizados com 6P versus 2P.

Discussão

Neste estudo, identificamos um bnAb potente isolado de uma célula B de memória de um indivíduo que se recuperou da infecção por SARS-CoV-2 durante a onda inicial da pandemia de COVID-19. Este bnAb, S728- 1157, manteve reatividade de ligação substancial e teve atividade neutralizante consistente contra todos os COV SARS-CoV-2 testados, incluindo Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 e XBB, e foi capaz de reduzir substancialmente os títulos virais infecciosos após infecção por Delta e BA.1 em hamsters.

Descobrimos que o soro convalescente de nossa coorte continha baixas concentrações de anticorpos que competem com S728-1157 (um anticorpo de classe 1/RBS-A) e mAbs de epítopo de classe 2. Isto sugere que S728-1157 é algo único em relação a outros anticorpos que têm como alvo epítopos de classe 1 e é raramente induzido no conjunto de células B de memória específicas de RBD. Em vez disso, a nossa coorte de infecção natural pareceu induzir anticorpos direcionados ao epítopo CR3022 (classe 4); os anticorpos desta especificidade são frequentemente reativos de forma cruzada, mas neutralizam de forma menos potente do que os anticorpos direcionados ao RBS (14, 17). Estes dados são complementares às nossas descobertas anteriores, demonstrando que uma abundância de anticorpos de classe 3/S309 em soros convalescentes pode contribuir para a atividade neutralizante contra variantes Alfa e Gama, enquanto a falta de anticorpos de classe 2 pode ser responsável pela capacidade de neutralização reduzida contra Delta (15) . Não obstante, a amplitude de atividade da maioria desses anticorpos direcionados a RBS (RBS-A/classe 1, RBS-B, C/classe 2 e RBS-D, S309/classe 3) contra variantes Omicron é relatada como altamente limitada (11, 40, 45).

O principal desafio no futuro será determinar como melhorar a elicitação de anticorpos amplamente reativos cruzados para epítopos RBS conservados. A esse respeito, observamos aqui que indivíduos com imunidade híbrida apresentaram títulos significativamente mais elevados de anticorpos semelhantes a S728-1157-do que indivíduos vacinados sem infecção prévia. É importante ressaltar que este fenômeno foi observado mesmo quando o número de exposições foi controlado (isto é, em vacinados duplos convalescentes versus vacinados triplos não infectados), sugerindo que algum elemento de imunidade associada à infecção (ou uma formulação de vacina que possa imitar este tipo de imunidade) é importante para a elicitação deste clonótipo. Isto é consistente com evidências experimentais que documentam que indivíduos com imunidade híbrida têm perfis de reatividade de anticorpos mais amplos em comparação com aqueles que têm apenas respostas imunes induzidas por vacinação ou induzidas por infecção primária (9).

As estruturas aqui ilustradas que S728-1157 ligam o epítopo RBS-A/classe 1 no RBD de conformação ascendente. Este epítopo parece ser mais facilmente acessível em pontas estabilizadas com 6P, que foram relatadas como apresentando 2 RBDs no norte do estado, em comparação com pontas 2P, que apresentam apenas 1 (30, 33, 46, 47), e para as quais nossos anticorpos específico para pico de conformação ascendente mostra ligação melhorada. S728-1157 foi isolado após infecção natural; em tais contextos, as chances de induzir clones semelhantes a S728-1157 são provavelmente maiores, uma vez que o RBD deve ser capaz de adotar uma conformação ascendente, mesmo transitoriamente, para se ligar a ACE2, expondo assim este epítopo. Ao contrário da maioria dos anticorpos IGHV3-53/3-66 RBS-A/classe 1, S728-1157 pode acomodar mutações chave em picos de VOC usando extensas interações entre CDR-H3 e o RBD (29, 48–50). S728-1157 também usa uma cadeia leve diferente (IGLV3-9) em comparação com outros anticorpos menos amplos, como CC12.3 (IGKV3-20), o que pode afetar as interações de ligação gerais; no entanto, nossa análise indica que há menos ligações de hidrogênio entre a cadeia leve S728-1157 e o RBD em comparação com CC12.3 (Tabela Suplementar 7). Embora a maioria dos resíduos de contato CDR-H3 críticos para a reatividade cruzada de VOC nesta interação sejam codificados pela linha germinativa e não introduzidos por mutações somáticas, vários resíduos somaticamente mutados em regiões estruturais ou CDR-H1, CDR-H2 e CDR-L1 são envolvido na interação com SARS-CoV-2 RBD. Por um lado, isto sugere que as células B de memória que codificam anticorpos da classe IGHV3-53/66 poderiam adquirir um grau semelhante de reatividade cruzada por maior maturação de afinidade. Por outro lado, isso também indica a possibilidade de projetar imunógenos direcionados à linha germinativa que tenham como alvo células B virgens do tipo S728-1157-. Embora possa ser um desafio projetar vacinas que possam provocar especificamente anticorpos do tipo S728-1157 com CDR-H3 selecionados capazes de superar as mutações de VOC, é encorajador que a restrição do gene IGHV seja observada em outros SARS-CoV potentes{ {58}} estudos de mAbs neutralizantes (13, 15, 20–27). Alternativamente, isto também pode ser viável através da imunização iterativa com imunógenos RBD otimizados, como foi relatado anteriormente para outros patógenos (51–55).

Embora muitas mutações tenham sido observadas no sítio antigênico RBS-A/classe 1 (18), em relação ao epítopo S728-1157, 13 dos 15 resíduos de contato RBD totais e 2 dos 3 CDR-H{{9} Os resíduos de contato de RBD ligados são conservados no Omicron e em todos os outros VOCs. Isto sugere que a região RBD onde o epítopo S728-1157 é encontrado pode incluir resíduos críticos para sua função dinâmica e aptidão viral e seria, portanto, menos tolerante a mutações e deriva antigênica do que os resíduos do local RBS-A/classe 1 circundante. Se for este o caso, a tendência de perda deste epítopo específico à medida que as variantes virais evoluem deve ser reduzida, tornando a caracterização de S728-1157 e anticorpos e epítopos semelhantes importantes para vacinas resistentes a variantes ou desenvolvimento terapêutico de mAb. Em resumo, nosso estudo identifica bnAbs que podem informar o projeto de imunógenos para vacinas contra o coronavírus à prova de variantes de próxima geração ou servir como terapêutica mAb que são resistentes à evolução do SARS CoV-2. Em particular, em termos de potência e amplitude combinadas, S728-1157 parece ser o melhor anticorpo isolado até o momento. Dado que este anticorpo se liga mais facilmente à estabilização 6P, prevê-se que seja preferencialmente induzido por proteínas spike recombinantes estabilizadas por 6P ou vírus inteiro, o que sugere que a modificação da hexaprolina poderia beneficiar futuras construções de vacinas, a fim de proteger de forma ideal contra futuros SARS-CoV -2 variantes e outros arbovírus.

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Métodos

Isolamento de anticorpos monoclonais. As PBMCs foram isoladas de filtros de leucorredução e congeladas como descrito anteriormente (24). As células B foram enriquecidas a partir de PBMCs via FACS. As células foram coradas com CD19, CD3 e sondas de antígeno conjugadas com oligo-fluoroforo; as células de interesse foram identificadas como CD3–CD19+ Antígeno+. Todos os mAbs foram gerados a partir de células classificadas como iscas de antígeno marcadas com oligo, identificadas através de RNA-Seq unicelular, conforme descrito anteriormente (15, 24). Os dados de células B únicas gerados neste estudo foram depositados no Gene Expression Omnibus: GSE171703 e GSM5231088 – GSM5231123.

Células B específicas do antígeno foram selecionadas para gerar mAbs com base na intensidade da sonda de antígeno analisada pelo JMP Pro 15. Os genes da cadeia pesada e leve do anticorpo foram sintetizados pela Integrated DNA Technologies (IDT) e clonados em IgG1 humana e cadeia leve κ ou λ humana. vetores de expressão por montagem de Gibson, como descrito anteriormente (56). As cadeias pesada e leve do mAb correspondente foram cotransfectadas transitoriamente em células HEK293T (ATCC). Após transfecção durante 18 horas, as células transfectadas foram suplementadas com sobrenadante de meio de hibridoma isento de proteínas (PFHM-II, Gibco). O sobrenadante contendo mAb secretado foi colhido no dia 4 e purificado utilizando esferas de proteína A-agarose (Thermo Fisher Scientific) conforme detalhado anteriormente (56). Sequências de cadeias pesadas e leves dos anticorpos bem caracterizados foram derivadas do Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) e REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) e foram sintetizados conforme descrito acima. O mAb CC12.3 (PDB ID: 6XC4) foi fornecido por Meng Yuan no Scripps Research Institute (San Diego, Califórnia, EUA). Expressão da proteína spike recombinante. O pico de comprimento total (FL) recombinante D614G SARS-CoV-2, BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, mutantes RBD únicos (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493A, Q493N, N501Y, Y505A e Y505F), combinação de mutante RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD e MERS-CoV RBD foram gerados internamente. Resumidamente, os antigénios recombinantes foram expressos utilizando células Expi293F (Thermo Fisher Scientific). O gene de interesse foi clonado num vector de expressão de mamífero (AbVec modificado internamente) e transfectado utilizando o kit ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. O sobrenadante foi colhido no dia 4 após a transfecção e incubado com ácido Ni-nitrilotriacético (Ni-NTA) agarose (Qiagen). A purificação foi realizada utilizando uma coluna de fluxo gravitacional e eluída com tampão contendo imidazol como descrito anteriormente (57, 58). O eluato foi tamponado e trocado com PBS utilizando uma unidade centrífuga Amicon (Millipore). Os picos FL recombinantes estabilizados por mutações 2P das variantes B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 e BA.4 Omicron e foram produzido no Laboratório Sather do Seattle Children's Research Institute. Os RBDs K417V, N439K e E484K e o pico FL recombinante WT-2P e 6P foram produzidos no laboratório Krammer na Icahn School of Medicine em Mount Sinai. O SARS-CoV-2-6P-Mut7 e o spike BA.1-6P foram projetados e produzidos conforme descrito em um estudo anterior (59). As sequências proteicas e recursos para cada antígeno estão listados na Tabela Suplementar 4. ELISA. Proteínas spike/RBD recombinantes de SARS-CoV-2 foram revestidas em placas de microtitulação de alta ligação a proteínas (Costar) a 2 ug/mL em PBS a 50 μL/poço e mantidas durante a noite a 4 graus. As placas foram lavadas com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T) e bloqueadas com 150 μL de PBS contendo 20% de FBS por 1 hora a 37 graus. Os anticorpos monoclonais foram diluídos em série 3- vezes a partir de 10 ug/mL em PBS e incubados nos poços por 1 hora a 37 graus. As placas foram então lavadas e incubadas com anticorpo IgG de cabra anti-humano conjugado com HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1, 000) durante 1 hora a 37 graus. Após a lavagem, foram adicionados 100 μL de substrato Super AquaBlue ELISA (eBioscience) por poço. A absorvância foi medida a 405 nm num espectrofotómetro de microplacas (Bio-Rad). Os ensaios foram padronizados utilizando o anticorpo controle S144-509 (15), com características de ligação conhecidas em cada placa, e as placas foram reveladas até que a absorbância do controle atingisse uma DO de 3,0. Todos os mAbs foram testados em duplicado e cada experiência foi realizada duas vezes.

ELISA sérico. Placas de microtitulação de alta ligação a proteínas foram revestidas com antígenos spike recombinantes de SARS-CoV-2 a 2 ug/mL em PBS durante a noite a 4 graus. As placas foram lavadas com PBS 0.05% de Tween e bloqueadas com 200 μL de PBS 0.1% de Tween + 3% leite em pó desnatado por 1 hora em temperatura ambiente (TA). As amostras de plasma foram inativadas pelo calor durante 1 hora a 56 graus antes de realizar o experimento sorológico. O plasma foi diluído em série 2- vezes em PBS 0,1% Tween + 1% de leite em pó desnatado. As placas foram incubadas com diluições de soro durante 2 horas à temperatura ambiente. O anticorpo secundário de cabra anti-Ig humana conjugado com HRP diluído a 1:3,000 com PBS 0,1% Tween + 1% de leite em pó desnatado foi usado para detectar a ligação de anticorpos. Após 1 hora de incubação, as placas foram reveladas com 100 μL de solução SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) por 10 minutos. Em seguida, 50 μL de HCl 3M foram usados ​​para interromper a reação de desenvolvimento. A absorvância foi medida a 490 nm num espectrofotómetro de microplacas (Bio-Rad). Os títulos finais foram extrapolados a partir da curva padrão sigmoidal 4PL (onde x é log da concentração) para cada amostra. O limite de detecção (LOD) é definido como a média + 3 SD do sinal OD registrado usando plasma de indivíduos pré-SARS-CoV-2. Todos os cálculos foram realizados no software GraphPad Prism (versão 9.0).

ELISA de competição. Para determinar a classificação do epítopo alvo de mAbs reativos a RBD, foram realizados ELISAs de competição utilizando outros mAbs com características de ligação a epítopos conhecidas como mAbs concorrentes. Os mAbs concorrentes foram biotinilados utilizando EZ-Link sulfo-NHS-biotina (Thermo Fisher Scientific) durante 2 horas à temperatura ambiente. O excesso de biotina dos mAbs biotinilados foi removido com colunas de dessalinização Zeba com corte de peso molecular de 7k (MWCO) (Thermo Fisher Scientific). As placas foram revestidas com 2 ug/mL de antígeno RBD durante a noite a 4 graus. As placas foram bloqueadas com PBS – 20% de FBS por 2 horas em temperatura ambiente, e a diluição 2- vezes maior dos mAbs de uma classe ou soro indeterminado foi adicionada, começando em 20 ug/mL de mAbs e uma diluição de 1:10 de soro. Após incubação do anticorpo durante 2 horas à temperatura ambiente, o mAb concorrente biotinilado foi adicionado a uma concentração duas vezes superior à da sua constante de dissociação (KD) e incubado durante mais 2 horas à temperatura ambiente juntamente com o mAb ou soro que foi previamente adicionado. As placas foram lavadas e incubadas com 100 μL de estreptavidina conjugada com HRP (Southern Biotech) a uma diluição de 1:1, 000 durante 1 hora a 37 graus. As placas foram desenvolvidas com o substrato Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Para normalizar os ensaios, o mAb biotinilado concorrente foi adicionado a um poço sem quaisquer mAbs concorrentes ou soro como controlo. Os dados foram registrados quando a absorvância do poço de controle atingiu uma DO de 1,0 a 1,5. A percentagem de competição entre mAbs foi então calculada dividindo a DO observada de uma amostra pela DO alcançada pelo controlo positivo, subtraindo este valor de 1 e multiplicando por 100. Para o soro, as DOs foram transformadas em log10 e analisadas por regressão não linear para determinar os 50 % de valores de concentração de inibição (IC50) usando o software GraphPad Prism (versão 9.0). Os dados foram transformados em Log1P e plotados em um gráfico representativo da diluição sérica recíproca do IC50 da diluição sérica que pode atingir 50% de competição com o mAb concorrente de interesse. Todos os mAbs foram testados em duplicado, cada experiência foi realizada 2 vezes de forma independente e foi calculada a média dos valores de 2 experiências independentes.

Ensaios de placa Os ensaios de placas foram realizados com vírus variantes do SARS-CoV-2 em células Vero E6/TMPRSS2 (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)) (Tabela Suplementar 5). As células foram cultivadas para atingir 90% de confluência antes de serem tripsinizadas e semeadas a uma densidade de 3 × 104 células/poço em 96-placas de poços. No dia seguinte, 102 PFUs da variante SARS-CoV-2 foram incubadas com mAbs 2-diluídos vezes por 1 hora. A mistura anticorpo-vírus foi incubada com células Vero E6/TMPRSS2 durante 3 dias a 37 graus. As placas foram fixadas com metanol a 20% e depois coradas com solução cristal violeta. As concentrações inibitórias completas (IC99) foram calculadas utilizando o log (inibidor) versus resposta normalizada (declive variável), realizado no GraphPad Prism (versão 9.0). Todos os mAbs foram testados em duplicado e cada experiência foi realizada duas vezes. Teste de neutralização de redução de foco. Testes de neutralização por redução de foco (FRNTs) foram usados ​​para determinar atividades de neutralização como uma plataforma adicional além do ensaio de placa. Diluições em série de soro começando com uma concentração final de 1:20 foram misturadas com 103 unidades formadoras de foco de vírus por poço e incubadas durante 1 hora a 37 graus. Uma amostra combinada de soro pré-pandêmico serviu como controle. A mistura anticorpo-vírus foi inoculada em células Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) em placas de 96-poços e incubada durante 1 hora a 37 graus. Um volume igual de solução de metilcelulose foi adicionado a cada poço. As células foram incubadas durante 16 horas a 37 graus e depois fixadas com formalina. Após a remoção da formalina, as células foram imunocoradas com um mAb de camundongo contra a nucleoproteína SARS-CoV-1/2 [clone 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], seguido por uma imunoglobulina anti-camundongo de cabra marcada com HRP (Sigma- Aldrich; A8924). As células infectadas foram coradas com substrato TrueBlue (SeraCare Life Sciences) e depois lavadas com água destilada. Após a secagem, os números dos focos foram quantificados usando um analisador ImmunoSpot S6, software ImmunoCapture e software BioSpot (Cellular Technology). O IC50 foi calculado a partir do valor interpolado do log (inibidor) versus resposta normalizada, utilizando regressão não linear de inclinação variável (4 parâmetros) realizada no GraphPad Prism (versão 9.0).

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