Pesquisa sobre a melhor maneira de tomar extrato de Cistanche-Cistanche, Suprimentos de Saúde, Alimentos Cistanche

Autor:LI Yang,QIN Yadi,BUBIAJIAER Hayilati,YAO Jun,YUAN Jie,YOU Lin

（1. Escola de Farmácia, Universidade Médica de Xinjiang, Urumqi 830011;2. Xinjiang Second Medical College, Klamayi 834000;3. Hotan Dichen Pharmaceuticas & Biotech Co., Ltd., Hotan 848000）

Abstrato:

Objetivo: Estabelecer um método para identificação e determinação de quatro feniletanol glicosídeos （equinacosídeo, tubulosídeo A, acteosideo, isoacteoside） em pedaços de cistanche, seus extratos e alimentos saudáveis ​​relacionados por TLC e QAMS．

Método:

（1）TLC: Quatro fenil etanol glicosídeos foram identificados por TLC com filme de poliamida como fase estacionária e clorofórmio-metanol-ácido acético-água （1,5∶2∶1∶7） como solvente de desenvolvimento. A mancha foi detectada sob luz ultravioleta a 365 nm.

（2）Usando o echinacoside como referência interna, os fatores de correção relativos para tubuloside A, acetonide e isoacteoside foram usados ​​para calcular o conteúdo de cada componente. Os resultados dos cálculos do método QAMS foram comparados com os valores do método padrão externo.

Resultado: Os pontos de TLC de 4 glicosídeos de feniletanol (equinacosídeo, tubulosídeo A, acteosídeo e isoacteosídeo) em pedaços de decocção de cistanche, extratos e alimentos funcionais foram todos claros com boa separação, forte valor específico de Rf moderado. A reprodutibilidade dos fatores de correção relativa do tubulosídeo A, acteosídeo e isoacteosídeo foi boa e não houve diferença óbvia entre os dois métodos.

Conclusão: O método estabelecido neste estudo é simples, preciso e reprodutível. Pode fornecer uma referência para o controle de qualidade de componentes eficazes de peças de decocção de cistanchas, extratos e alimentos funcionais.

Palavras-chave:cistache; pedaços de decocção; produtos relacionados;glicósidos de álcool fenetílico;TLC; QAMS

Cistanche deserticola YC Ma. é uma erva parasita perene da família Orobanchaceae. É usado como remédio com caules carnudos secos com folhas escamosas. Cistanche foi publicado pela primeira vez no "Shenlong Materia Medica" e foi listado como um grau superior. É doce no paladar, quente na natureza, salgado e pertence aos meridianos dos rins e do intestino grosso. Tem os efeitos de umedecer os intestinos e laxantes, revigorar o yang do rim e beneficiar a essência e o sangue. É produzido principalmente em Xinjiang, Ningxia, Mongólia Interior, Qinghai, Gansu e outras regiões áridas do noroeste da China. Os principais componentes químicos do Cistanche são glicosídeos feniletanoides, iridóides, lignanas, alcalóides, monoterpenos, açúcares, óleos voláteis e oligoelementos inorgânicos. Dentre eles, os glicosídeos feniletanoides (Phys) são um dos principais componentes farmacológicos, que possuem atividades farmacológicas como antioxidante, neuroproteção, antiviral, aumento da imunidade, antifadiga, e aumento da memória e aumento da imunidade.

Benefícios do Extrato de Cistanche:

O Extrato de Cistanche é feito a partir de comprimidos secos de Cistanche inativados por enzimas, que são extraídos e separados. Foi exportado para o Japão, Coréia do Sul, Malásia e outros mercados estrangeiros e é amplamente utilizado em produtos de saúde, cosméticos e indústrias farmacêuticas. O produto de saúde processado a partir deExtrato de Cistanchecomo matéria-prima tem a dupla função de cuidados de saúde dealiviando o cansaço físicoemelhorando a imunidade. Atualmente, há uma falta de padrões de controle correspondentes para a avaliação da qualidade dos ingredientes ativos do extrato de Cistanche e dos produtos de saúde, e é difícil garantir a qualidade e a segurança do processamento e das vendas no mercado. Echinacea e verbascoside são os componentes do índice para identificação e determinação de conteúdo sob o item deCistanche Tubulosana edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa. Além disso,Cistanche Tubulosatambém contém outros glicosídeos feniletanoides, como tuberosina A, salidroside, isoverbasin, cistanchosídeo C, cistanqueosídeo D, aurirosídeo, 2'-acetilverbasina, etc.Diferentes graus de efeitos antioxidantes e neuroprotetores.É difícil avaliar sua qualidade de forma abrangente e precisa usando apenas echinacoside e verbascoside como indicadores de detecção. Foi relatado na literatura que os teores de ductaloside A e isaveraside em Cistanche e Cistanche também foram maiores, atingindo {{0}},29 por cento , 0,21 por cento , 0 0,06 por cento e 0,10 por cento, respectivamente.

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Neste trabalho, foi estabelecida a identificação por TLC de 4 glicosídeos feniletanoides (equinacosídeo, tuberosídeo A, verbascosídeo, isorrascosídeo) em pedaços de decocção de Cistanche Tubulosa e produtos relacionados (extratos, produtos para saúde) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O método de determinação de conteúdo do método de avaliação (HPLC-QAMS) fornece uma referência para melhorar ainda mais o método de avaliação de qualidade de Cistanche Tubulosa.

1 Material e métodos para escolher a melhor maneira de tomar Cistanche

1.1 Instrumentos e Reagentes

Shimadzu LC-20AT Cromatógrafo Líquido de Alto Desempenho; Shimadzu LC-20AB Cromatógrafo Líquido de Alto Desempenho; Cromatógrafo Líquido de Alto Desempenho Agilent1260; Balanço Analítico (AB135-S, Empresa Mettler Toledo1o); KQ-500DE Limpador Ultrassônico

(KQ-500DE, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); Instrumento de detecção semiautomático (CAMAG, Suíça).

(1) Pedaços de decocção de Cistanche disponíveis comercialmente (S1, S2: Cistanche deserticola, origem em Alxa, Xinjiang; S3, S4: CistancheTunulosa, origem Xinjiang): adquiridos deWecistanche Co. Ltd..; Extração de álcool de comprimidos secos de enzimas, S6: extração de água de comprimidos secos inativados por enzimas, S7: extração de álcool de comprimidos secos inativados por enzimas com resina) e produtos de saúde (S8) são fornecidos pela Xinjiang Hetian Dichen Biotechnology Co., Ltd.

(2) Substância de referência de equinácea (número do lote: S-003-01904003, pureza: maior ou igual a 98 por cento), tuberosina A (número do lote: G-066-11812016, pureza: maior ou igual a 98 por cento) ), verbascoside (número do lote: maior ou igual a 98 por cento ) M-011-02103019, pureza: maior ou igual a 98 por cento ), isaveraside (número do lote: Y-073-11803024, pureza: maior que ou igual a 98 por cento): Pequim Yingleike Technology Development Co., Ltd.

(3) Metanol, acetonitrila e ácido fórmico eram cromatograficamente puros; clorofórmio e ácido acético glacial eram analiticamente puros; a água era água ultrapura;

1.2 Método experimental

1.2.1 Identificação por cromatografia em camada fina

1.2.1.1 Preparação da solução teste Pegue o pó teste (0.5g de pedaços de decocção de Cistanche, 0.2g de extrato de Cistanche, 0.5g de produto de saúde), adicione 20mL de 50 por cento de metanol, tratar ultrassonicamente por 15min e filtrar.

O filtrado foi concentrado para 2 mL, passado através de uma membrana microporosa de 0,45 μm e usado como solução de teste.

1.2.1.2 Preparação da solução de substância de referência Pesar com precisão 10 mg de substância de referência de echinacoside, vasoside A, verbascoside e isorrascoside, adicionar 50% de metanol para dissolver e diluir para um volume de 10 mL

frasco, como uma solução estoque padrão único padrão de referência. Meça com precisão cerca de 2 mL da solução padrão única de cada substância de referência, adicione 50 por cento de metanol ao mesmo balão volumétrico de 10 mL e passe por uma membrana microporosa de 0,45 μm como uma solução de referência mista.

1.2.1.3 Preparação da solução de amostra negativa Pesar outros medicamentos que não Cistanche de acordo com a prescrição do produto de saúde e operar de acordo com o mesmo método de preparação da solução de teste para preparar a solução de amostra negativa.

1.2.2 Determinação de Conteúdo pelo Método de Um Teste-Múltiplo-Avaliação

1.2.2.1 Condições cromatográficas Coluna: INERTSIL ODS-3 (250mm×4,6mm, 5μm); fase móvel: acetonitrila (A)-0,1 por cento de solução de ácido fórmico (B), eluição de gradiente (0 ~ 12 min, 17 por cento ~ 20 por cento A; 12 ~ 30 min, 20 por cento ~ 22 por cento A ; 30 ~ 35 min, 22 por cento ~ 17 por cento A); Comprimento de onda de detecção: 330nm; Taxa de fluxo: 1,0mL · min-1; Temperatura da coluna: 30 graus; Volume de injeção: 10μL .

1.2.2.2 Preparação da solução da substância de referência Pegue cerca de 10 mg da substância de referência echinacoside, tuberosin A, verbascoside e isorrascoside cada, pese-os com precisão e coloque-os em frascos volumétricos de 10 mL, respectivamente, usando 50 por cento

Dissolva o metanol e complete até a marca, agite bem para obter a solução padrão única da substância de referência com concentrações de 1.008, 1,011, 1,012 e 1,012 mg·mL-1, respectivamente. Meça com precisão uma quantidade apropriada da solução estoque padrão único de cada substância de referência, coloque-a no mesmo balão volumétrico de 10mL, adicione 50% de metanol até a marca, agite bem e prepare uma mistura com concentração de 201,60, 50,55, 101,20 , 50,60ug·mL-1 A solução de referência foi passada através de uma membrana microporosa de 0,45μm.

1.2.2.3 Preparação da solução de teste

① Solução de teste de pedaços de decocção de Cistanche: pese cerca de 1,0g de pó de pedaços de decocção de Cistanche (passou por uma peneira nº 4), pese com precisão, adicione com precisão 25mL de 50 por cento de metanol, agite bem , pesar e ultrassonicamente (potência 250w, frequência 35kHz) 40min, deixar esfriar, pesar novamente, complementar o peso reduzido com 50% de metanol, agitar bem, filtrar em papel de filtro e levar o filtrado para passar por uma membrana microporosa de 0,45 μm .

②A solução de extrato de Cistanche para teste: pegue o pó de extrato de Cistanche (S5: flocos secos inativados com enzimas extraídas com álcool, S6: flocos secos inativados com enzimas extraídas com água, S7: flocos secos inativados com enzimas extraídas com álcool com resina) cerca de 0,2 g. Pesar com precisão e preparar a solução de teste de extrato de Cistanche de acordo com o método em "①". ③Solução de teste de produtos de saúde: pegue 10 produtos de saúde, pese-os com precisão, triture-os finamente, calcule o peso médio do comprimido, pese com precisão 1 comprimido (cerca de 0,5 g) e prepare os produtos de saúde de acordo com o método em "①". Solução de teste.

2 Resultados e Análise da escolha do melhor Cistanche

1.1 Instrumentos e Reagentes

2.1 Identificação por cromatografia em camada fina

De acordo com o teste de cromatografia em camada fina (Regra Geral 0502), desenhe 2 μL da solução padrão única de substância de referência, solução de substância de referência mista, solução de teste e solução de amostra negativa, respectivamente, e aponte-as na mesma solução de poliacrilamida.

Na placa de filme de amina, use clorofórmio-metanol-ácido acético glacial-água (1,5:2:1:7) como agente de revelação, revelar, retirar, secar e inspecionar sob luz ultravioleta (365 nm). Resultados A substância teste apresentou manchas fluorescentes da mesma cor na posição correspondente no cromatograma da substância de referência, não havendo interferência quando negativa, como mostra a Figura 1.

Figura 1 Cromatogramas TLC de pedaços de cistanche, extrato, produtos de saúde

Nota: Da esquerda para a direita são echinacoside, tuberoside A, verbascoside, isaveraside, substância de referência mista, pedaços de decocção de Cistanche (S1 ~ S4), extrato de Cistanche (S5 ~ S7), produtos de saúde (S8), amostras negativas de saúde produtos (S8)

2.2 Determinação de Conteúdo pelo Método de Um Teste-Múltiplo-Avaliação

2.2.1 Teste de especificidade

Pegue 10 μL de cada solução de referência mista e solução de teste e injete e analise de acordo com as condições cromatográficas em 1.2.2.1. A resolução entre o pico alvo e os componentes adjacentes na solução de referência e na solução de teste é superior a 1,5 e a especificidade é boa. , e o cromatograma é mostrado na Figura 2.

2.2.2 Investigação da Relação Linear

Desenhe com precisão 0.5, 1, 2,5, 5 e 10 mL da solução de referência mista em "1.2.1.2", coloque-os em frascos volumétricos de 10 mL, complete até a marca com 50 por cento de metanol e agite bem para obter uma série de misturas de concentração.

Combine a solução de referência, pipete com precisão 10 μL, respectivamente, e injete as amostras de acordo com as condições cromatográficas em "1.2.2.1" para medir a área do pico. por

Sente-se verticalmente, desenhe uma curva de regressão e calcule uma regressão linear. Os resultados mostraram que r eram todos maiores que 0.9993, e os quatro glicosídeos fenetil mostraram uma boa relação linear com a área do pico dentro do intervalo linear correspondente, conforme mostrado na Tabela 1.

Figura 2 Espectro de HPLC de substância de referência e substância de amostra

1. equinacósido;2. Tubuloside A;3. Acteosídeo; 4. Isoacteoside

Observação:

A. Cromatograma da substância de referência mista;

B. Cromatograma de peças de Cistanche Docation;

C. Cromatograma do extrato de Cistanche;

D. Cromatograma do suplemento de saúde

Tabela 1 Resultados da relação linear de 4 componentes

2.2.3 Teste de precisão

Pipete com precisão 1{{10}} μL da solução de referência mista em "1.2.1.2", injete e meça 6 vezes continuamente de acordo com as condições cromatográficas em "1.2.2.1", registre a área do pico e calcule seu RSD. Resultados Os RSDs das áreas de pico de echinacoside, tuberosin A, verbascoside e isoverascoside foram 0,79 por cento , 1,24 por cento , 0,59 por cento e 0,42 por cento , respectivamente (n=6), indicando que o precisão do instrumento foi boa.

2.2.4 Teste de repetibilidade

Pegue 6 cópias do mesmo lote de pós de teste (S3, S6, S8), pese-os com precisão, prepare a solução de teste de acordo com "1.2.1.3", meça de acordo com as condições cromatográficas em "1.2.2.1" e registre o Pico área, o conteúdo dos 4 componentes e seus RSDs foram calculados. Os resultados são apresentados na Tabela 2, indicando que o método apresenta boa reprodutibilidade.

Tabela 2 Testes repetitivos

2.2.5 Teste de estabilidade

Extraia com precisão 10 μL da solução de teste (S3, S6, S8), meça de acordo com as condições cromatográficas em "1.2.2.1" e injete amostras em 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24h respectivamente para medição. Resultados Os RSDs (n=7) das áreas de pico de echinacoside, analoside A, verascoside e isaveraside na amostra (S3) foram 1,28%, 1,82%, 1,52% e 1,56%, respectivamente. Os RSDs (n=7) das áreas de pico dos quatro componentes da amostra (S8) foram 1,38%, 1,57%, 1,73% e 2,49%, respectivamente, e os RSDs (n=7) das áreas de pico dos quatro componentes na amostra (S8) foram 1,63 por cento, 0,92 por cento, 1,85 por cento e 2,24 por cento, indicando que a solução de teste é estável em 24h.

2.2.6 Teste de recuperação

Pesar 9 pós do produto de teste (S3, S6, S8) com conteúdo conhecido, pesar com precisão e preparar a solução de teste de acordo com o método em "1.2.2.3". Adicione proporcionalmente uma certa quantidade da solução de referência dos quatro componentes, injete e meça de acordo com as condições cromatográficas em "1.2.2.1", registre a área do pico, calcule a taxa de recuperação e seu RSD, e os resultados são mostrados na Tabela 3 .

Tabela 3 Resultados das taxas de recuperação da amostra（n=3）

2.2.7 Cálculo do fator de correção relativo

O fator de correção relativo é calculado pelo método de correção multiponto, de acordo com a fórmula fi/s=fi/fs=(Wi×AS)/(WS×Ai), onde fi/s é o fator de correção relativo entre o componente a ser testado e a referência interna, Ai, AS são as áreas de pico do componente a ser medido e a referência interna, respectivamente, e Wi e WS são as quantidades do componente a ser medido e a referência interna, respectivamente.

Usando echinacoside como referência interna, pegue 1, 2, 5, 10, 15, 20 e 30 μL da solução de referência mista para converter no volume de injeção e injete e meça de acordo com as condições cromatográficas em "1.2.2.1" . Meça o fator de correção relativo (fi/s) do ductosídeo A (B), verbascoside (C), isaveraside (D) e echinacoside de referência interna (A), e tome o valor médio como a correção relativa para quantificação O RSD do relativo fator de correção calculado em 7 pontos foi investigado. Os resultados mostraram que o RSD do fator de correção relativo dos três componentes testados e o echinacoside de referência interna foram todos inferiores a 3%, conforme mostrado na Tabela 4.

Tabela 4 Fatores de correção relativos （fi/s） de 3 componentes e referência interna de echinacoside

Nota: A: Echinacea, B: Tuberoside A, C: Verbasin, D: Isaveraside

2.2.8 Reprodutibilidade dos fatores de correção relativos

Três cromatógrafos líquidos de alto desempenho, Shimadzu LC-20AT, Shimadzu LC-20AB, Agilent1260 e INERTSILODS-3 (250mm×4,6mm, 5μm), XBridgeC18 foram investigados respectivamente.

Os efeitos de três colunas cromatográficas (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) e Agilent C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) no fator de correção relativo e no cálculo do RSD, os resultados são todos inferiores a 3%, indicando que o valor relativo estabelecido fator de correção em diferentes líquidos de alta eficiência. O cromatógrafo de fase e as diferentes colunas cromatográficas foram reprodutíveis, os resultados são mostrados na Tabela 5

Tabela 5 Fatores de correção relativos（fi/s）de 3 componentes e echinacoside por diferentes instrumentos e diferentes colunas de HPLC

Nota: A: Echinacea, B: Tuberoside A, C: Verbasin, D: Isaveraside

2.2.9 Posicionamento dos picos cromatográficos dos componentes a serem medidos

De acordo com o tempo de retenção obtido em "2.2.8", calcule o valor de retenção relativo do componente a ser testado e a referência interna echinacoside (ri/s= tRi/tRs, onde tRi e tRs são o tempo de retenção ) e seu RSD. Resultados Os RSDs dos valores de retenção relativa dos componentes a serem testados foram todos inferiores a 5 por cento, indicando que os valores de retenção relativa eram estáveis ​​e poderiam ser usados ​​para a localização dos picos cromatográficos dos componentes a serem testados. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

2.2.10 Comparação de resultados de medição entre um teste e método de avaliação múltipla e método padrão externo

Pesar com precisão cada lote de amostras, preparar a solução de teste de acordo com o item "1.2.1.3", extrair com precisão 10 μL da solução de referência mista e da solução de teste e injetar as amostras de acordo com as condições cromatográficas sob "1.2.2.1". , registre as áreas de pico dos quatro componentes e use o método padrão externo e o método estabelecido de uma medição-múltipla avaliação (Wi=fi/s×Ws×Ai/As) para calcular o conteúdo do quatro componentes respectivamente. Os resultados são apresentados na Tabela 7. O software SPSS 26.0 foi utilizado para analisar os resultados dos dois métodos pelo teste t, P > 0,05, indicando que não houve diferença significativa entre o conteúdo medido pelo padrão externo e o conteúdo calculado pelo método de teste único e avaliação múltipla, indicando que o método de medida e avaliação múltipla pode ser usado para peças de decocção de Cistanche deserticola, pesquisa de controle de qualidade de ingredientes ativos em extratos e produtos para saúde.

Tabela 6 Os valores de retenção relativos（ri/s）de 3 componentes e echinacoside por diferentes instrumentos e diferentes colunas de HPLC

Nota: A: Echinacea, B: Tuberoside A, C: Verbasin, D: Isaveraside

3 Conclusão da escolhaa melhor maneira de tomar Cistanche

A fim de melhorar a eficiência de identificação e a diversidade de métodos de identificação, este teste adicionou dois componentes, ductosídeo A e isaveraside, com base no teste de identificação sob o item Cistanche deserticola na edição 2020 da Farmacopeia Chinesa. Foram utilizadas as condições de desenvolvimento da Farmacopeia: metanol. - Ácido acético glacial - água=2:1:7, verificou-se que o grau de separação de echinacoside e tuberoside A não atendeu aos requisitos, e foi realizado o teste de triagem de fase estacionária e agente revelador, respectivamente.

Usando placa de filme de poliamida, placa de camada fina de gel de sílica G, placa de camada fina de gel de sílica H como fase estacionária, acetona-metanol-ácido acético glacial-água=1:2:1:7, metanol-ácido acético glacial -água=4:1: 5. Acetato de etila:etanol=6:4, n-butanol-etanol-água=4:1:5, triclorometano-metanol-ácido acético glacial-água =1.5:2:1:7 Resultados Usando placa de filme de poliamida como fase estacionária, clorofórmio-metanol-ácido acético glacial-água=1.5∶2∶1∶7, as manchas eram claras , a separação foi boa, o valor de Rf foi moderado e a repetibilidade foi boa. Caracterização rápida e precisa dos ingredientes. O método de avaliação de uma medição-múltipla é um método de controle de qualidade síncrono de vários índices, que é usado principalmente na determinação de componentes estruturais semelhantes em uma única medicina tradicional chinesa. Os quatro componentes medidos neste experimento têm estruturas semelhantes e comprimentos de onda de absorção máxima semelhantes (glicosídeos de Echinacea em 330nm, tuberoside A331nm, verbascoside 330nm, isorrascoside 327nm), então este método pode ser usado. Utilizando o echinacoside como referência interna, o fator de calibração estabelecido tem boa reprodutibilidade em diferentes sistemas cromatográficos e colunas cromatográficas, e não há diferença significativa entre os resultados de conteúdo do método de uma medição-múltipla avaliação e o método padrão externo, indicando que o método é factível e preciso, podendo ser utilizado na substância de referência. Se for difícil de obter ou caro, pode atingir vários indicadores de Cistanche deserticola

Os ingredientes são determinados simultaneamente.

Tabela 7 Conteúdo de cada componente（por cento,n=3）

Em conclusão, o estabelecimento de um método para a identificação de quatro glicosídeos feniletanoides em Cistanche porTLCe a determinação do conteúdo em um teste com múltiplas avaliações é precisa, confiável, simples, rápida e altamente viável. Tem significado científico prático e valor de aplicação.