Determinação rapidamente simultânea de seis componentes eficazes em Cistanche Tubulosa por espectroscopia de infravermelho próximo

1. Introdução

Cistanche (Hoffmg. Et Link) é um gênero fanerogâmico perene da família de plantas Orobanchaceae. A maioria das espécies pertencentes ao gênero Cistanche tem sido usada como planta medicinal há milênios na China; tem reputação de ser um tônico superior; e são conhecidos como "Ginseng dos Desertos". Cistanche tubulosa é um parasita obrigatório das raízes da planta perene Tamarix chinensis. Foi documentado na Farmacopeia Chinesa como a fonte autêntica deCistanches Herba(Nome chinês: Roucongrong) da edição de 2005. A pesquisa farmacológica moderna sobre espécies Cistanche foi iniciada na década de 1980. Investigações farmacológicas mostraram que os extratos das plantas Cistanche possuem um amplo espectro de atividades, como cura de deficiência renal e constipação senil, avanço na capacidade de aprender e memorizar, anti-doença de Alzheimer, aumento da imunidade, anti-envelhecimento, anti-fadiga, etc. Nas últimas três décadas, estudos farmacológicos abrangentes e sistemáticos foram combinados com investigações fitoquímicas para iluminar a base material dos efeitos benéficos das raízes das plantas Cistanche. Essas pesquisas indicam que os glicosídeos feniletanóides (PhGs) foram os principais componentes eficazes nas plantas Cistanche, desempenhando papéis importantes no tratamento da deficiência renal, impotência, anti-envelhecimento e doença de Alzheimer. O conteúdo de dois PhGs (equinacosídeo e verbascosídeo) era exigido na Farmacopeia Chinesa. Enquanto isso, carboidratos como manitol, sacarose, glicose e frutose nas plantas Cistanche possuem a função laxante e os aglomerados de carboidratos dePlantas cistanchestêm sido usados ​​para o tratamento da constipação.

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Os recursos silvestres de C. tubulosa estão distribuídos principalmente na área ao redor do deserto de Taklamakan, no sul da Região Autônoma de Xinjiang, na China. Semelhante a muitas outras espécies utilizadas como medicamentos tradicionais chineses (MTC), C. tubulosa tem grande valor económico e está quase extinta no seu habitat selvagem devido à recolha excessiva. O cultivo de C. tubulosa começou na década de 1990 na China para garantir o fornecimento de matérias-primas para Cistanches Herba, bem como para proteger os recursos vegetais selvagens. Em 2017, existiam quase 13 mil ha de C. tubulosa cultivada na província de Hotan, em Xinjiang. Avanços na tecnologia de plantio são necessários para ampliar o cultivo e melhorar a qualidade de C. tubulosa.

O objetivo principal do cultivo de C. tubulosa é produzir Cistanches Herba, rico nesses componentes eficazes. No entanto, o conteúdo dos componentes eficazes emCistanches Herba, como PhGs e oligossacarídeos, podem ser significativamente afetados por muitos fatores durante a produção. Um sistema de detecção em tempo real da qualidade de C. tubulosa deve ser explorado. Portanto, é necessário desenvolver um método de alto rendimento para atender ao requisito de analisar um grande número de amostras em um curto período. Tradicionalmente, a determinação desses componentes primários eficazes, como PhGs e carboidratos, em C. tubulosa era geralmente obtida por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Embora seja preciso e confiável, é demorado e trabalhoso para coleta e processamento de dados. Além disso, também é necessário muito tempo e esforço para a preparação de amostras, que geralmente envolve pulverização, extração e filtração de ensaios de HPLC. Portanto, são necessários um princípio claro e uma ferramenta fácil de operar para obter uma quantidade relativamente grande de dados. Felizmente, a espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS) tem sido amplamente utilizada para avaliar produtos agrícolas, alimentos, amostras médicas e produtos farmacêuticos porque é rápida e não destrutiva. Portanto, o NIRS poderia atender exatamente aos requisitos para medições eficientes de TCMs e, sem surpresa, o NIRS foi aplicado para identificação qualitativa e quantificação de compostos em TCMs.

Neste estudo, o conteúdo de seis componentes eficazes, incluindoequinacosídeo, verbascosídeo, manitol, sacarose, glicose e frutoseem 116 lotes de amostras de C. tubulosa coletadas na província de Hotan em Xinjiang em 2013–2015 foram determinadas pela primeira vez por HPLC. Posteriormente, os modelos de calibração desses seis componentes foram estabelecidos com o método de regressão de mínimos quadrados parciais (PLSR). Esses modelos foram então validados com os coeficientes de correlação e erros de predição nos conjuntos de calibração. Os resultados demonstraram que o método desenvolvido pode ser empregado como um método confiável para análise quantitativa de C. tubulosa.

2. Resultados

2.1. Análise HPLC

O conteúdo deequinacosídeo e verbascosídeoforam determinados por um método HPLC-UV bem definido na literatura e quatro carboidratos (manitol, sacarose, glicose e frutose) foram determinados por um método HPLC-ELSD bem definido na literatura para todas as 116 amostras. Os métodos de preparação e determinação da amostra foram descritos nas Seções 3.1 e 3.3. A Figura 1 mostra os cromatogramas característicos dos padrões mistos. Pode-se observar que todos os seis componentes eficazes foram separados na linha de base e, portanto, puderam ser quantificados. O método HPLC foi validado antes do teste da amostra. Os principais resultados do método HPLC estão listados na Tabela 1. Uma relação linear favorável (r=0.9998) e recuperação (98,5%) do método de determinação de equinacosídeo são mostradas nos resultados, o mesmo resultado de todos os cinco componentes. Portanto, o conteúdo dos seis componentes eficazes pode ser determinado com precisão. Todas as faixas de conteúdo determinadas estão resumidas na Tabela 1.

2.2. Análise NIRS

A Figura 2 mostra os espectros NIR (4000–10,000 cm-1) das amostras de C. tubulosa. Picos de absorção significativos apareceram de 4.000 cm-1 a 7.500 cm-1 em todas as amostras, enquanto flutuações suaves apareceram de 7.500 cm-1 a 10.000 cm-1. A deriva da linha de base dos espectros NIR ocorreu porque a amostra foi facilmente afetada por fatores como tamanho e cor das partículas (Figura 2A). Pré-tratamentos matemáticos dos espectros foram usados ​​para reduzir até certo ponto a influência de informações desnecessárias. Os pré-tratamentos matemáticos incluíram primeira derivação (1ª derivação), segunda derivação (2ª derivação), variedade normal padrão (SNV) e correção de dispersão multiplicativa (MSC). A Figura 2B mostra a 2ª derivação dos espectros NIR de C. tubulosa, e as variações significativas que ocorreram em três regiões, 4.000–4.500 cm–1, 5.000–5.500 cm–1 e 7.000–7.500 cm–1, são observadas.

2.3. Estabelecimento de Modelos Quantitativos de Calibração

A regressão de mínimos quadrados parciais (PLSR) é um método de modelagem clássico e tem sido amplamente aplicado em modelos quantitativos devido à alta qualidade dos resultados. As vantagens do PLSR incluem a sua boa capacidade de previsão e relativa simplicidade. O PLSR também tem sido amplamente aplicado no estabelecimento de modelos de calibração quantitativa de TCMs [25]. Com base nos espectros NIR pré-tratados, um modelo de análise quantitativa NIR para os seis componentes eficazes em C. tubulosa foi estabelecido usando o método PLSR com dados de análise HPLC como valores verdadeiros. As 116 amostras foram divididas aleatoriamente em conjuntos de calibração e validação com proporção de 3:1. As condições mais adequadas para a calibração foram escolhidas pelo baixo RMSEC e alto coeficiente de correlação.

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2.3.1. Seleção da Banda de Ondas para os Modelos de Calibração

A seleção de uma banda de onda adequada foi um passo importante para a construção do modelo de calibração. Neste estudo, os espectros de intervalo NIR de 4000–7.500 cm−1 (recomendado pelo software analista TQ) e 4000–10.000 cm−1 foram comparados. Observou-se que esta faixa é inadequada para a calibração no intervalo entre 4.000 cm-1 e 7.500 cm-1 da Tabela 2. Assim, no presente estudo, os intervalos espectrais para os seis constituintes químicos foram todos selecionados a partir do intervalo de 4.000 a 10.000 cm−1 comparando o desempenho do RMSEC e do coeficiente de correlação.

2.3.2. Seleção do Número Ideal de Fatores para os Modelos de Calibração

O PLSR explica a quantidade máxima de variabilidade nos dados, reduzindo a dimensionalidade dos dados espectrais pelo cálculo de fatores. O problema da “insuficiência” surgiu devido à insuficiência de informação resultante de um número limitado de factores; entretanto, a escolha de fatores maiores que os valores ótimos introduzidos no modelo provocará o problema de "sobreajuste". Tanto o "ajuste insuficiente" quanto o "ajustamento excessivo" reduzirão o poder preditivo dos modelos estabelecidos [22]. A Figura 3 mostra a relação entre RMSECV e fatores para todos os seis compostos. Portanto, selecionamos os fatores correspondentes aos menores valores de RMSECV. A seleção ideal de fatores para os modelos de calibração está listada na Tabela 3.

2.3.3. Seleção de Pré-tratamento Espectral para os Modelos de Calibração

Outro fator crítico de influência para modelos de calibração é o pré-tratamento espectral, que visa reduzir a influência do espalhamento e do desvio da linha de base, melhorando as relações sinal-ruído e removendo variações irregulares. Métodos de correção de dispersão multiplicativa (MSC) e variação normal padrão (SNV) foram utilizados para eliminar a influência do espalhamento de radiação. Para resolver os efeitos da deriva da linha de base, os espectros da 1ª e da 2ª derivada foram comparados e a 2ª derivação foi selecionada. Para o efeito desejável, suavizamos os espectros com o algoritmo de filtro Savitzky-Golay (SG) antes da derivação para evitar a ampliação do ruído. A Tabela 3 apresenta as informações do pré-tratamento espectral e seus resultados para os modelos de calibração.

2.4. Avaliação dos Modelos Estabelecidos

Um bom modelo de calibração NIRS deve ter valores baixos de RMSEC e RMSEP, bem como alto coeficiente de correlação (r) e pequenas diferenças entre RMSEC e RMSEP. Os modelos de calibração dos seis compostos selecionados foram estabelecidos conforme procedimentos citados acima (Tabela 3). Os valores RMSEC e r para o conjunto de calibração do equinacosídeo foram 27,6 e 0,9808, respectivamente. Os parâmetros de desempenho de outros modelos de compostos químicos estão listados na Tabela 3, a partir da qual podemos concluir que os modelos estabelecidos emergem resultados de predição satisfatórios, podendo ser utilizados para a rápida análise quantitativa de C. tubulosa. Gráficos de dispersão dos seis compostos químicos são mostrados na Figura 4 para tornar os modelos de calibração mais descritivos e observados visualmente. Conforme mostrado na Figura 4, ocorreram pequenas diferenças entre os valores preditivos e medidos, porque a maioria dos pontos foi distribuída em torno da curva regressiva com uma equação como y=x. Portanto, excelentes desempenhos preditivos foram observados na Figura 4.

3. Materiais e Métodos

3.1. Preparação de amostra

Cento e dezesseis amostras de C. tubulosa foram coletadas na província de Hotan, na região autônoma de Xinjiang, de 2013 a 2015. Todas as amostras foram cultivadas, mas foram coletadas em diferentes estágios de crescimento. O peso fresco das amostras variou de 20 ga 1000 g. Após secagem ao sol, as amostras secas foram trituradas e peneiradas em peneira de malha 60-.

3.2. Coleta de dados espectroscópicos NIR

Os espectros NIR das amostras foram coletados em um intervalo de 8 cm-1 na região espectral de 4000–10.000 cm-1 com um sistema Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, EUA) equipado com um adaptador portátil de refletância de fibra óptica. Cada espectro foi obtido com uma média de 64 varreduras. Todas as amostras foram deixadas em equilíbrio até a temperatura ambiente (25 ◦C) antes da varredura do espectro NIR para garantir que as amostras fossem analisadas na mesma temperatura. A umidade no laboratório foi mantida em nível ambiente.

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3.3. Coleta de dados de HPLC

3.3.1. Preparação de Extração

Um grama de pó de C. tubulosa foi extraído com 50 mL de metanol a 50% em frasco cônico com ultra-sonicação (500 W, 40 KHz) por 30 min. O extrato foi armazenado a 4 ◦C. O sobrenadante do extrato foi filtrado para obtenção de amostra para análise por HPLC.

3.3.2. Determinação Simultânea de Equinacósido e Verbascósido com HPLC-UV

A análise cromatográfica líquida foi conduzida em um sistema Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japão) que consiste em duas unidades de entrega de solvente LC-20ADXR, uma bomba LC-20AD, uma bomba automática SIL-20ACXR amostrador, um forno de coluna CTO-20AC, um detector DAD SPD-M20A, desgaseificador DGU-20A3R e um controlador CBM-20A.

Uma coluna Grace Prevail Carbohydrato ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) usada para as separações cromatográficas foi mantida a 35 ◦C. A fase móvel consistia em acetonitrila (A) e 0,1% de ácido fórmico aquoso (B) e foi entregue seguindo o programa de gradiente como segue: 0–7 min, gradiente linear de 10–20% A; 7–15 min, 20% A; e 15–20 min, gradiente linear de 20–10% A. A vazão da fase móvel foi de 0,4 mL/min. O monitoramento UV foi realizado a 330 nm.

3.3.3. Determinação Simultânea de Manitol, Sacarose, Glicose e Frutose com HPLC-ELSD

A HPLC foi realizada em um sistema LC Agilent série 1100 (Palo Alto, CA, EUA) consistindo de um desgaseificador G1322A, uma bomba quaternária G1311A, um amostrador automático G1311A, um controlador de temperatura de coluna G1316A e um detector DAD G1315B.

Uma coluna Sigma Prevail Carbohydrato ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) foi empregada para separações cromatográficas e mantida a uma temperatura de coluna de 25 ◦C. A fase móvel foi composta por acetonitrila e água (77:23, v/v) e aliado isocrático fornecido com vazão de 0,7 mL/min. O efluente foi monitorado utilizando um detector evaporativo de espalhamento de luz (ELSD) com parâmetros padronizados.

3.4. Processamento de dados

O TQ Analyst (versão 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, EUA) foi utilizado para realizar a divisão dos conjuntos de calibração e validação, pré-tratamento matemático dos espectros, estabelecimento dos modelos de calibração e outros cálculos . O Origin (versão 9.1) foi utilizado para fazer as figuras.

4. Conclusões

Neste estudo propusemos um método rápido e não destrutivo para a análise simultânea deequinacosídeo, verbascosídeo, manitol, sacarose, glicose e frutoseemC. tubulosapelo NIRS. As análises dos valores de RMSEC, coeficiente de correlação, RMSEP e Rp demonstraram que os modelos quantitativos NIR estabelecidos poderiam ser usados ​​para prever com precisão o conteúdo dos seis componentes efetivos selecionados emC. tubulosa. Em comparação com HPLC, o método NIRS relatado neste estudo pode economizar trabalho e tempo significativos, mantendo ao mesmo tempo uma capacidade de análise quantitativa satisfatória. Portanto, o método aqui relatado tem potencial para ser utilizado no controle de qualidade deC. tubulosae, assim, orientar o desenvolvimento da tecnologia de cultivo e processamento paraC. tubulosa.

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