Análise de qualidade e avaliação abrangente de Cistanche Deserticola de diferentes origens na China

Resumo: O presente estudo visa esclarecer as diferenças de qualidade deCistanche deserticola(CD) de diferentes áreas. Os teores de compostos bioativos extraídos de diferentes partes (raiz, caule médio e topo) e suas atividades antioxidantes foram analisados ​​comparativamente. Os resultados mostraram que os teores e atividades antioxidantes dos componentes bioativos foram significativamente afetados pelas origens e partes. As amostras do sul do deserto de Tengger (D) apresentaram altas concentrações depolifenóis totais(17,66 mg GAE/g DW) everbascoside(6,98 mg/g DW). Esses compostos mostraram alta capacidade de eliminação contra ABTS (IC50=1,48 mg/mL) e DPPH (IC50=0,38 mg/mL). Amostras do deserto de Gurbantunggut (E) apresentaram o maior teor de flavonóides totais (16,58 mg RE/g DW). O maior teor de triterpenóide total apareceu na amostra do deserto de Badangirin (A) (18,63 mg EOA/g DW). Amostras do deserto de gurbantunggut (F) apresentaram polissacarídeos e procianidinas em níveis de 31,18 mg DE/g DW e 4,71 mg PCE/g DW, respectivamente. As amostras do norte do deserto de Tengger (C) tiveram a maiorequinosídeoconteúdo (17,75 mg/g DW) e capacidade de eliminação de radical hidroxila (IC50=3,05 mg/mL). Três componentes principais foram extraídos por análise de componentes principais (PCA) com uma taxa de contribuição de variância acumulada de 85,43%. As amostras foram divididas em três grupos por meio da análise hierárquica de agrupamento (HCA). As quatro áreas produtoras (A, B, C e D) do primeiro e segundo grupos foram distribuídas na Mongólia Interior e Gansu, e sua pontuação abrangente foi as quatro primeiras. Os resultados deste estudo fornecerão uma base teórica para avaliação da qualidade, desenvolvimento de produtos e padronização de Cistanche deserticola na China.

Palavras-chave:Cistanche deserticola; origens; compostos bioativos;atividade antioxidante; avaliação completa

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Cistancheé uma planta perene de raiz obrigatória cheia de Orobanchaceae, também conhecida comoDayun, Goblin, Bambu Douradoetc. [1]. Existem 4 espécies e 1 variante do gêneroCistancheno meu país, incluindoCistanche deserticola, Cistanche tubulosa, sal Cistanche cru, flor branca Cistanche e areia Cistanche.Cistanche deserticolaeCistanche tubulosaincluído na edição 2020 da Farmacopeia Chinesa

Caules carnudos secos de Cistanche deserticola. Cistanche Cistanche é um parasita das raízes da tamargueira do deserto, distribuída principalmente nas áreas desérticas do sul de Xinjiang. Desert Cistanche é parasita nas raízes da planta de fixação de areia e quebra-vento Haloxylon ammonium, e é distribuído principalmente nas áreas desérticas da Mongólia Interior, como Alxa League (Zuoqi, Youqi, Ejina Banner), Gansu e norte de Xinjiang [{{ 1}}]. Cistanche deserticola foi gravada pela primeira vez em "Materia Medica de Shen Nong". Tem sabor doce, natureza quente e tem as funções de "manter cinco trabalhos e sete lesões, nutrir o meio, eliminar dores de frio e calor no caule, nutrir os cinco órgãos internos, fortalecer o yin e beneficiar a essência e sangue", e é conhecido como "ginseng do deserto" [4]. Estudos farmacológicos modernos mostraram que Cistanche deserticola tem as funções de baixar o açúcar no sangue, diminuir os lipídios do sangue[5], melhorar a função óssea[6], umedecer os intestinos e laxantes[7-8], anti-oxidação[9], protegendo o fígado[10-11], e antidepressivo. [12], aliviar a fadiga [13] e outras atividades fisiológicas. A atividade biológica do Cistanche está intimamente relacionada aos vários componentes funcionais que ele contém, como polifenóis, flavonóides, polissacarídeos, equinácea e verbascoside [14]. Estudos têm demonstrado que os glicosídeos feniletanoides como o echinacoside e o verbascoside em Cistanche são as principais substâncias ativas para tonificar o yang do rim, antienvelhecimento e antifadiga [15], podendo promover a proliferação de osteoblastos e a proliferação de células-tronco mesenquimais da medula óssea . Diferenciação de osteoblastos[16-18]; O polissacarídeo Cistanche deserticola possui atividades farmacológicas como regulação da atividade imunológica[19], proteção dos nervos[20] e anti-osteoporose[21].

A capacidade de aprendizagem e memória tem um certo efeito de melhoria [22].

Os tipos e teores de componentes bioativos em Cistanche deserticola são muito afetados por vários fatores como clima, ambiente geográfico e condições do solo, que trazem dificuldades ao processamento intensivo de Cistanche deserticola e ao controle de qualidade e padronização de seus produtos [23]. Portanto, é de grande importância estudar os tipos, conteúdos e atividades antioxidantes de substâncias bioativas em Cistanche deserticola de diferentes origens para a medicina, segurança alimentar e desenvolvimento abrangente e utilização de Cistanche deserticola.

Neste trabalho, tomou-se como objeto de pesquisa Cistanche deserticola de diferentes áreas produtoras de deserto em meu país, e seus polifenóis totais, flavonóides totais, polissacarídeos totais, triterpenos totais, proantocianidinas totais, echinacoside, verbascoside e outras substâncias biologicamente ativas e suas atividades antioxidantes foram estudados. Análise de componentes principais (PCA) e análise de agrupamento hierárquico (HCA) foram ainda utilizadas para análise estatística multivariada para fornecer base teórica para a avaliação da qualidade de Cistanche deserticola e a padronização de produtos processados.

1 Materiais e métodos

1.1 Materiais, Reagentes e Instrumentos

As amostras das seis áreas de produção (AF) foram todas caules secos e carnosos de Cistanche deserticola (Tabela 1). De acordo com os métodos de amostragem relatados [24-26], a raiz, o meio e o topo foram nomeados 1, 2 e 3, respectivamente (como mostrado na Figura 1). As amostras foram liofilizadas, pulverizadas, peneiradas em 50-peneira de malha, seladas a vácuo e armazenadas em -18 grau para uso posterior.

Tabela 1 Reagentes e padrões do tipo Cistanche deserticola: acetonitrila, ácido fórmico cromatograficamente puro empresa Merck na Alemanha; Verbasina e echinacoside padrão cromatograficamente puro Ambel (Shanghai) Co., Ltd.; carbonato de sódio, ácido gálico, nitrito de sódio, nitrato de alumínio, hidróxido de sódio, etanol, rutina, vanilina, ácido acético glacial, ácido perclórico, acetato de etila, acetona, éter, fenol, ácido sulfúrico, metanol, persulfato de potássio e outros reagentes são todos domésticos grau analítico, adquirido da Beijing Soleil Treasure Technology Co., Ltd.

Instrumentos: FD1A-50 mais liofilizador, Beijing Bo Yikang Company; Centrífuga TGL-20B, Shanghai Anting Scientific Instrument Co., Ltd.; Espectrofotômetro UV-Vis 756, Instrumento Científico Co. de Shanghai Qinghua, Ltd.; LC-20AB High Performance Liquid Chromatógrafo da Shimadzu Corporation of Japan; Leitor de microplacas multifuncional Synergy H1 Porton Instrument Co., Ltd.

1.2 Métodos de determinação de substâncias biologicamente ativas

1.2.1 Determinação do teor total de polifenóis

Consulte o método de Li [27] et al. Pesar 0,50 g da amostra, usar etanol 70% como solvente de extração (relação sólido-líquido 1:40), extrair em um aparelho ultrassônico com potência fixa de 250 W (60 graus, 40 min ), e centrifugar a 4000 r/min por 10 min após resfriamento. Recolher o sobrenadante para o volume (50 mL) para uso.

Adicione a solução de folinfenol (5 mL, 1{11}} por cento) à solução de amostragem (1 mL), agite bem, deixe repousar por 15 min, depois adicione a solução de carbonato de sódio (4 mL, 7,5 por cento), agite bem, deixe permanecer no escuro por 20 min Sua absorbância (765 nm) foi medida, e o resultado foi expresso em equivalente de ácido gálico (mg equivalente de ácido gálico, GAE/g DW), e a equação da curva padrão foi y=0. 0505x mais 0,0347,

R2=0.9991.

1.2.2 Determinação de flavonóides totais

Consulte o método de Xiong Shuangli [28] et al. A preparação da solução de amostra é a mesma de 1.2.1. A solução de amostragem (1 mL) foi colocada em um balão volumétrico marrom de 10 mL, e solução de nitrito de sódio (0,3 mL, 5 por cento) foi adicionada, agitada e agitada, e após repouso por 15 minutos, solução de nitrato de alumínio (0,3 mL, 10 por cento), solução de óxido de sódio de hidrogênio (4 mL, 4 por cento), diluir para 10 mL com etanol (50 por cento), agitar bem e deixar repousar no escuro

Após 20 minutos, a absorbância (510 nm) foi medida e o resultado foi expresso como equivalente de rutina (mg equivalente de rutina, RE/g DW). A equação da curva padrão era y=0,0053x mais 0,0161, R

2=0.9992.

1.2.3 Determinação de triterpenos totais

Consulte o método de He Ce [29] et al. A preparação da solução de amostra é a mesma de 1.2.1. A solução de amostragem (0,4 mL) foi evaporada até a secura em banho-maria, e a solução de vanilina-ácido acético glacial recém-preparada (0,4 mL, 1,5 por cento), ácido perclórico (1,6 mL), banho de água quente (70 graus, 15 min) foram adicionados em sequência e adicionados após resfriamento. Acetato de etila (5L), a absorbância (560 nm) foi medida após repouso por 10 min, e o resultado foi expresso como equivalente de ácido oleanólico (mg

Equivalente de ácido oleanólico, EOA/g DW), a equação da curva padrão é y=16.005x-0.0256, R2=0.9987.

1.2.4 Determinação do teor total de polissacarídeos

Consulte o método de Zhang Yadan et al. [30]. Pesar 1,00 g da amostra, usar água deionizada como solvente de extração (relação sólido-líquido 1:30), extrair em um aparelho ultrassônico com potência fixa de 250 W (60 graus, 50 min), e centrifugar a 4000 r/min por 10 min após o resfriamento. , coletar o sobrenadante e adicionar 4 vezes o volume de etanol (95 por cento), após repouso (4 graus, 12 h), centrifugar a 5000 r/min para coletar o precipitado,

Após repetidas lavagens com acetona, éter e etanol absoluto por 2 vezes seguidas, adicionando uma quantidade adequada de água deionizada para reconstituir, foram realizadas desproteinização (método sevage) e despigmentação (método de carvão ativado), e o volume foi ajustado para 10 mL antes teste.

A solução de amostragem (1 mL) foi sequencialmente adicionada com solução de fenol (0,6 mL, 6 por cento) e ácido sulfúrico concentrado (3 mL), agitada e agitada e depois fervida por 10 min. Após resfriamento, a absorbância (490 nm) foi medida, e o resultado foi expresso como equivalente de glicose (mg) equivalente de dextrose, DE/gDW). A equação da curva padrão é y=0.0146x-0.015, R2=0.9998.

1.2.5 Determinação do teor de proantocianidinas

Consulte o método de Li Caixia [31] e outros. Pesar 0,50 g da amostra, usar 80% de etanol como solvente de extração (relação sólido-líquido 1:30), extrair em um aparelho ultrassônico com potência fixa de 250 W (50 graus, 40 min) e centrifugar a 4000 r/min por 10 min após resfriamento. , colete o sobrenadante até o volume (50 mL) para uso. A solução de amostragem (0,5 mL) foi adicionada com solução de vanilina-metanol (3 mL, 4 por cento) e ácido clorídrico concentrado (1,5 mL), e a absorbância (500 nm) foi medida após 15 min de reação. O resultado foi expresso como equivalente de proantocianidina (mg equivalente de proantocianidina, PCE/g DW), a equação da curva padrão é y=2.1709x-0.0036, R2=0.9979.

1.2.6 Determinação de Verascoside e Echinacea

Consulte o método de Xu Mingjun [32] e outros. Pesar 1,00 g de amostra, usar etanol 80% como solvente de extração (relação sólido-líquido 1:30), extrair em um aparelho ultrassônico com potência fixa de 250 W (60 graus, 40 min ) e centrifugar a 4000 r/min por 10 min após o resfriamento, coletar o sobrenadante até o volume (50 mL) para uso.

Coluna cromatográfica: coluna Alltima C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm); fase móvel: solução de ácido fórmico a 0,4 por cento (A)-acetonitrila

(B); o programa de eluição é: 0~10 min, 90 por cento (A); 10~20 min, 90 por cento ~ 80 por cento (A); 20 ~ 30 min, 80 por cento ~ 75 por cento

(UMA); 30~40 min, 75 por cento ~ 80 por cento (A); 40 ~ 50 min, 80 por cento ~ 90 por cento (A), temperatura da coluna 25 graus, taxa de fluxo 1.00 mL/min;

O comprimento de onda de detecção foi de 330 nm; o volume de injeção foi de 1{{10}} μL. Tomando a concentração como a abcissa e a área do pico correspondente como a ordenada, desenhe a curva padrão do echinacoside y=15311296.40x-119140.61, R2=0. 9996, a faixa linear é de 0,04~0,48 mg/mL; a curva padrão de verbascoside y=21780400.45x- 121356.95, R2=0.9994, intervalo linear 0,04~0,08 mg/mL.

1.2.7 Ensaio de atividade antioxidante in vitro

Preparação da solução da amostra: Pesar 1,20 g de amostra, usar etanol 60% como solvente de extração (relação sólido-líquido 1:25) e extrair em um aparelho ultrassônico com potência fixa de 250 W (60 graus, 40 min), e resfrie por 4500 r. Centrifugue a /min por 15 min, colete o sobrenadante, pegue uma quantidade adequada de sobrenadante e dilua com 60% de etanol, de modo que a concentração da solução da amostra seja 1, 3, 5, 10, 20, 30 e 40 mg /mL a ser testado.

1.2.7.1 Capacidade de eliminação de radicais livres do ABTS

Referindo-se ao método de Roberta et al. [33] com uma ligeira modificação: a solução mãe ABTS é água desionizada para preparar uma solução mista com uma concentração final de persulfato de potássio de 2,45 mmol/L e uma concentração final de ABTS de 7 mmol/L, e deixar repousar no escuro (25 mmol/L). grau, 12h). Diluir com água desionizada antes de usar para fazer a absorbância a 734 nm 0.70±0.05, que é a solução de trabalho ABTS. Adicione 10 μL de solução de amostra (1-40 mg/mL) à placa de microtitulação, adicione a solução de trabalho ABTS (200 μL), proteja da luz à temperatura ambiente por 30 min, meça sua absorbância (734 nm) com 60 por cento etanol como controle, de acordo com a Equação (1) calcula o ABTS mais a taxa de eliminação de radicais livres. ABTS mais taxa de eliminação de radicais livres ( por cento )=(1-

A1−A2A0) × 100 (1) Na fórmula: A0 é a absorbância de 60 por cento de etanol em vez da solução da amostra (em branco); A1 é a absorbância da solução da amostra misturada com a solução ABTS; A2 é a absorbância da água deionizada em vez do valor da solução ABTS.

1.2.7.2 Capacidade de eliminação de radicais livres de DPPH

Referindo-se ao método de Zhong Wenxiu et al. [34] com uma ligeira modificação: a solução de amostragem (10 μL) foi adicionada com solução de DPPH (250 μL), bem misturada e depois adicionada à placa de ELISA, e a absorbância foi medido com 60 por cento de etanol como controle no escuro por 25 min. (517 nm), e a taxa de eliminação de DPPH·radical foi calculada de acordo com a fórmula (2). DPPH·taxa de eliminação de radicais ( percent )=(1-A1−A2A0)×100 (2) Entre eles: A0 é o valor de absorbância de 60 por cento de etanol em vez da amostra (em branco); A1 é o valor de absorbância da solução amostra após a mistura com a solução DPPH; A2 é o valor de absorbância do etanol anidro em vez da solução DPPH.

1.2.7.3 Capacidade de eliminação de radicais OH

Referindo-se ao método de Smirnoff et al. [35] com uma pequena modificação: adicione 50 μL da solução de amostra a 50 μL de solução de sulfato ferroso (6.0 mmol/L), adicione 50 μL de hidrogênio solução de peróxido (6 mmol/L), misture bem e reaja 15 min, em seguida, adicione 50 μL de solução de etanol absoluto de ácido salicílico 6 mmol/L, reaja a 37 graus por 30 min, meça a absorbância em 510 nm e calcule a Taxa de eliminação de radical OH de acordo com a fórmula (3). taxa de eliminação do radical OH ( percent )=(1-A1−A2A0) × 100 (3) Entre eles: A0: valor de absorbância da amostra em branco (água destilada em vez da amostra); A1: o valor de absorbância do sistema de revelação de cor e da amostra; A2: A água destilada substitui a absorbância da solução de peróxido de hidrogênio.

1.3 Análise de Dados

Todos os dados foram determinados em triplicata e os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). O software Origin 2019 foi usado para análise de componentes principais e análise de cluster; O software SPSS Statistics 26.0 foi usado para análise de variância, e P<0.05 indicated="" a="" significant="">

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