A progressão da doença renal crônica não diabética estabelecida é interrompida pelo tratamento com metformina em ratos

Estratégias de tratamento atuaisparadoença renal crônica (DRC)focar principalmente emcontrolando fatores de risco. A metformina, um medicamento de primeira linha para diabetes tipo 2, exerce ações pleiotrópicas benéficas além do uso prescrito e dados incipientes revelaram efeitos protetores contra o desenvolvimento de insuficiência renal. Este estudo avaliou a eficácia terapêutica da metformina e da canagliflozina, um inibidor do cotransportador de sódio-glicose-2 (SGLT2) recentemente aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para tratar a nefropatia diabética, em retardar a progressão da DRC não diabética estabelecida. . Ratos com DRC induzida por adenina foram divididos em diferentes grupos de tratamento para receber 200 mg/kg de metformina, quatro ou cinco semanas após o início da dieta de adenina (DRC leve a moderada estabelecida), ou 25 mg/kg de canagliflozina quatro semanas após o início da dieta com adenina. início da dieta, por gavagem oral diária administrada durante quatro semanas. Cada grupo de tratamento foi comparado com um grupo de veículo. A dosagem crónica de adenina resultou em DRC grave em ratos tratados com veículo, conforme indicado por um aumento acentuado nos níveis séricos de creatinina, uma diminuição acentuada na depuração da creatinina e um metabolismo mineral perturbado. A metformina, mas não a canagliflozina, interrompeu o declínio funcional dos rins. Além disso, os rins dos animais tratados com metformina apresentaram menos área intersticial e inflamação em comparação com o grupo do veículo. Análises proteômicas revelaram que o efeito protetor renal da metformina estava associado à ativação da via de sinalização Hippo. Esta cascata multiproteína quinase altamente conservada controla o desenvolvimento dos tecidos, o tamanho dos órgãos, a proliferação celular e a apoptose. Assim, a metformina demonstrou eficácia terapêutica ao interromper a progressão da DRC estabelecida num modelo de rato. Rim Internacional (2022) 101, 929–944; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2022.01.037

PALAVRAS-CHAVE:canagliflozina; doença renal crônica; Via de sinalização de hipopótamo; função renal;metformina; proteômica

NOVA FORMULAÇÃO HERBAL PARADOENÇA RENAL CRÔNICA (DRC)

Declaração Translacional

Estratégias de tratamento paradoença renal crônica (DRC)idealmente, (i) visar diretamente o rim e (ii) ser capaz de interromper a progressão da DRC já estabelecida. Estudos recentes sobre medicamentos antidiabéticos, como a metformina e a canagliflozina, apontam para um suposto efeito benéfico no declínio da função renal. Este artigo relata os resultados de um estudo em ratos que investigou a eficácia terapêutica da metformina e da canagliflozina em um cenário de DRC não diabética já estabelecida. Nossos dados mostram que a metformina tem potencial renoprotetor e mantém perspectiva de ser usada como terapêutica para retardar ou mesmo interromper a progressão da DRC.

Doença renal crônica(DRC) é caracterizada poruma diminuição da função renaldurando mais de 3 meses. Atualmente é reconhecida como um problema de saúde pública mundial, com uma prevalência global estimada de 3% a 16%.1–3 As principais causas de DRC nos países desenvolvidos são diabetes e hipertensão.1 Além disso, a DRC também contribui para a carga global de doenças cardiovasculares. doenças.1,4 A insuficiência renal pode evoluir para insuficiência renal, o que inevitavelmente requer diálise ou transplante renal e, consequentemente, reduz significativamente a qualidade de vida.5 As estratégias atuais de tratamento para a DRC concentram-se principalmente no controle dos fatores de risco e no alívio dos sintomas.

A metformina, um medicamento biguanida, é o agente antidiabético oral de primeira linha usado por 200 milhões de pacientes que sofrem de diabetes mellitus tipo 2.6,7 Embora a metformina já seja usada há 6 décadas, as vias moleculares pelas quais a metformina reduz a glicemia ainda são não totalmente elucidado.8,9 Dados de vários grupos de pesquisa, entretanto, mostraram que a metformina exerce muitos efeitos pleiotrópicos benignos além do uso inicial prescrito. Independentemente do estado diabético do paciente, o uso de metformina tem se mostrado promissor no tratamento de doenças cardiovasculares10 e síndrome dos ovários policísticos11 e tem demonstrado eficácia substancial em diferentes tipos de câncer (próstata12 e mama13).

Além disso, dados recentes de estudos pré-clínicos em vários modelos de doença renal também apontaram para um suposto efeito protetor da metformina nos rins.14–19 Em um estudo experimental anterior, demonstramos que o tratamento preventivo com metformina foi capaz de atenuar fortemente o desenvolvimento de DRC grave.14 Nesse cenário, descobrimos que a metformina preservou a função renal, reduziu a inflamação renal e preveniu a fibrose excessiva.14 Infelizmente, a maioria dos pacientes com DRC é diagnosticada quando a TFG já está reduzida (categoria TFG G2–G3a ou mesmo G3b–G4) , portanto, o tratamento da DRC já estabelecida é um paradigma clinicamente mais relevante para estudar. A explicação potencial do uso clínico da metformina durante a DRC tem sido dificultada pelo medo histórico do desenvolvimento de acidose láctica.20,21 No entanto, as diretrizes revisadas afirmam que a metformina pode agora ser usada em pacientes com insuficiência renal leve a moderada.22 Além disso , um estudo clínico recente realizado por Lalau et al.23 indicou que o tratamento com metformina também pareceu ser seguro e ainda farmacologicamente eficaz na DRC moderada a grave (categoria TFG G3a-b a G4), desde que a dose seja ajustada ao grau de doença renal. falha.

Foi demonstrado que os inibidores do cotransportador de sódio e glicose (SGLT2) reduzem o risco de insuficiência renal em pacientes com diabetes e, portanto, foram aprovados para tratar a nefropatia diabética.24 Os inibidores do SGLT2 são uma nova classe de medicamentos antidiabéticos orais. que visam a reabsorção tubular renal de glicose.25,26 Além disso, em um recente ensaio clínico randomizado (ensaio Dapagliflozina e Prevenção de Resultados Adversos na Doença Renal Crônica [DAPA-CKD]), o inibidor de SGLT2, dapagliflozina, demonstrou retardar a progressão da DRC independente da presença de diabetes tipo 2.27

Por esse motivo, a Food and Drug Administration dos EUA aprovou muito recentemente o uso de dapagliflozina para pacientes com DRC, independentemente do estado de diabetes.28,29 Para ajudar a esclarecer estes dados relativos às intervenções para DRC estabelecida, o nosso presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia terapêutica de metformina e canagliflozina na progressão da DRC estabelecida no modelo de rato não diabético com DRC induzida por adenina.

MÉTODOS

Preparação de medicamentos

Metformina (Merck KGaA) e canagliflozina (Janssen) foram dissolvidas em carboximetilcelulose a 1% na concentração de 20 e 2,5 mg/ml, respectivamente, antes da gavagem oral diária. Foi utilizado um volume de dose de 10 ml/kg.

Desenho do estudo Noventa e quatro (94) ratos Wistar machos (Iffa, Credo) foram alojados 2 por gaiola, expostos a um ciclo claro-escuro de 12-12 horas, com acesso ad libitum à água e à dieta fornecida. A DRC foi induzida pela administração de uma dieta enriquecida com adenina (com baixo teor de vitamina K, 00,25% de adenina, 00,2 mg/kg K, 1% Ca, 1% P, 1 UI /g de vitamina D e 6% de proteína; SSNIFF Spezialdiäten), conforme descrito em outro lugar,30 durante todos os períodos de estudo de 8 e 9 semanas.

Ratos com DRC foram distribuídos aleatoriamente em 6 grupos diferentes para receber um tratamento de 4-semanas de 200 mg/kg de metformina, 25 mg/kg de canagliflozina ou veículo (1% de carboximetilcelulose) que começou 4 ou 5 semanas em regime de DRC induzida por adenina. Os pontos de início do tratamento de 4- e 5-semana foram incluídos para avaliar se a eficácia terapêutica dependia da gravidade inicial da DRC. Para avaliar a histologia e função renal nestes respectivos pontos de partida, 2 grupos adicionais receberam dieta de adenina a 0,25% durante 4 e 5 semanas, respectivamente, após o que foram sacrificados. Como referência do estudo, também foi incluído um grupo de ratos controle com função renal normal (Figura 1). Os animais foram alojados em gaiolas metabólicas durante 24 horas para coleta de amostras de urina seguida de coleta de sangue através da veia da cauda em estado contido e consciente. As diretrizes recomendam uma redução da dose de metformina em pacientes comfunção renal prejudicadapara evitar acidose láctica.23,31,32 Portanto, o ajuste da dose foi baseado na avaliação dos níveis séricos de lactato e pH como indicadores de acidose láctica (Tabela Suplementar S1). No grupo que recebeu tratamento por minutos após 4 semanas de DRC induzida por adenina, uma redução da dose para 150 mg/kg foi implementada na semana 7 até o final do estudo. Quando o tratamento foi iniciado após 5 semanas de DRC induzida por adenina, a dose de metformina foi reduzida para 150 mg/kg no início da semana 7 e posteriormente para 100 mg/kg no final da semana 8. Após 4 semanas de tratamento com metformina ou canagliflozina (experimentando 8 e 9 semanas de DRC induzida por adenina), os animais foram mortos por exsanguinação através do plexo retro-orbital após anestesia através da administração ip de 80 mg/kg de cetamina (Ketalar; Pfizer) e 16 mg/kg de xilazina (Rompun; Bayer ). Os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 85-23 (1996) e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Antuérpia (número de licença 2017-56).

Análises bioquímicas

Secções de tecido desparafinizadas foram coradas para avaliação de inflamação (CD45, marcador pan-leucocitário) utilizando o método do complexo avidina-biotina. Após bloqueio com soro de cabra e incubação durante a noite com anticorpo primário policlonal de coelho anti-CD45 (1:1000, ab10558, Abcam), subsequente incubação com anticorpo IgG de cabra anti-coelho biotinilado (PK-

4001, Vector Laboratories), seguido por um complexo de avidina-biotina peroxidase (complexo AB, Vector Laboratories) permitiu a detecção visual de uma cor marrom escura na adição de diaminobenzidina. A positividade do CD45 (porcentagem de área) foi quantificada de forma cega (ampliação original 100) usando o software de análise de imagem Axiovision (Carl Zeiss).

Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real O mRNA total de uma seção renal congelada foi extraído usando o PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen) e transcrito reversamente em cDNA pelo kit de arquivo de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems). A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real foi realizada utilizando o QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific). A sonda TaqMan e os iniciadores foram adquiridos à Thermo Fisher Scientific (Supplementary Methods). O nível de expressão de cada gene testado foi analisado em triplicado para cada amostra e normalizado para a expressão do gene de referência Gapdh. Análises proteômicas O rim esquerdo de ratos com DRC tratados com metformina ou veículo após 5 semanas de dieta com adenina foi coletado e preparado para espectrometria de massa e proteômica quantitativa conforme descrito nos Métodos Suplementares. Análises bioinformáticas As proteínas significativamente alteradas dos conjuntos de dados adquiridos foram anotadas funcionalmente usando a Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) e a análise da via WikiPathways usando o conjunto Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/).33,34 Para fornecer uma interpretação funcional dessas proteínas, foi utilizada a Base de Dados para Anotação, Visualização e Descoberta Integrada (DAVID Bio informatic Recourses 6.8: https://david.ncifcrf.gov/). Detalhes sobre as análises bioinformáticas adicionais estão descritos nos Métodos Suplementares. Os resultados estatísticos são expressos como médias SEM. Análises estatísticas não paramétricas foram realizadas utilizando Prism (GraphPad Software). P < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Modelo de rato com DRC induzida por adenina Detalhes sobre peso corporal, ingestão alimentar e débito urinário de todos os grupos de estudo são apresentados nas Figuras Suplementares S1 e S2. Os níveis de glicose no sangue neste modelo de DRC não diabético não foram, em comparação com o tratamento com veículo, alterados pela metformina ou canagliflozina (Tabela 1). A metformina interrompe o declínio funcional renal A dosagem crônica de adenina resultou em DRC grave em ratos tratados com veículo, conforme indicado pelo aumento nos níveis séricos de creatinina (Figuras 2a e b). Este aumento foi significativamente diferente após 4 e 5 semanas de DRC induzida por adenina, indicando 2 pontos de início de tratamento com diferentes gravidades de DRC (P < {{10}}.0001 ; Figura Suplementar S3). O declínio progressivo da função renal foi quase completamente interrompido pela administração de metformina a partir das semanas 4 e 5, conforme indicado pela estabilização dos níveis séricos de creatinina às 8 e 9 semanas (P <0,0001 vs. veículo), respectivamente (Figura 2a eb). A depuração da creatinina, como medida da taxa de filtração glomerular, revelou uma diminuição ao longo do tempo nos ratos com DRC tratados com veículo, enquanto a dosagem de metformina atenuou esta diminuição (P <0,05 vs. veículo; Figura 2c e d). Também aqui, a diferença na gravidade da DRC nos 2 pontos iniciais foi demonstrada por uma depuração de creatinina significativamente reduzida após 5 semanas em comparação com 4 semanas de indução da DRC (P <0,001; Figura Suplementar S3). Em consonância com a disfunção renal, um metabolismo mineral perturbado tornou-se aparente em ratos com DRC tratados com veículo. Os níveis séricos de fósforo aumentaram significativamente a partir das semanas 6 e 7, enquanto o cálcio diminuiu, particularmente nos últimos momentos. O tratamento com metformina também anulou esses distúrbios (Tabela 2).

Tabela 1|Glicemia no modelo de rato não diabético com DRC induzida por adenina tratado com metformina, canagliflozina ou veículo, 4 ou 5 semanas após a indução da DRC por 4 semanas

A metformina interrompe a progressão histológica da DRC Ratos com DRC alimentados com adenina apresentaram perda da borda em escova tubular, espessamento da membrana basal e dilatação tubular, todos atenuados no tratamento com metformina (Figura 3a). Em comparação com animais controle com função renal normal, a porcentagem da área intersticial aumentou 2- e 23- vezes nas semanas 4 e 5, respectivamente, após a indução da DRC (Figura 3b e 3c). Por estes resultados, a expressão de ARNm do marcador fibrótico Col1a1 foi marcadamente aumentada nos últimos momentos (Figura 3d e e). Em contraste com o tratamento com veículo, não houve aumento significativo na percentagem de área intersticial entre o início do tratamento com metformina (semana 4 e semana 5, respectivamente) e o final do estudo (semana 8 e semana 9, respectivamente), fornecendo evidência para o capacidade da metformina de atenuar o aumento adicional do intersticial e a deterioração histopatológica. Estas descobertas foram reforçadas pela medição da expressão da principal citocina profibrótica, TGFb, que foi significativamente menor nos animais tratados com metformina em comparação com os animais tratados com veículo (Figura 3f e g).

No que diz respeito à inflamação, 4 semanas de tratamento com veículo resultaram num aumento significativo da expressão de Cd45 no final do estudo (isto é, semanas 8 e 9) em comparação com ratos de controlo com função renal normal (Figura 4a). Este incremento de expressão de Cd45 foi significativamente (P <{6}}.01) interrompido quando a metformina foi administrada após 5 semanas de DRC induzida por adenina (Figura 4c). Da mesma forma, o tratamento com metformina, iniciado após 5 semanas de DRC induzida por adenina, levou a uma expressão significativamente menor da citocina inflamatória Tnfa no final do estudo em comparação com os animais tratados com veículo no mesmo momento (P <0,01; Figura 4d e e). Resultados semelhantes foram observados com a expressão de Cd68, o que sugeriu a supressão da infiltração de macrófagos (Figura 4f e g).

Tabela 2|Parâmetros séricos do metabolismo mineral no modelo de rato não diabético com DRC induzida por adenina tratado com metformina ou veículo, 4 ou 5 semanas após a indução da DRC por 4 semanas

No que diz respeito à inflamação, 4 semanas de tratamento com veículo resultaram num aumento significativo da expressão de Cd45 no final do estudo (isto é, semanas 8 e 9) em comparação com ratos de controlo com função renal normal (Figura 4a). Este incremento de expressão de Cd45 foi significativamente (P <{6}}.01) interrompido quando a metformina foi administrada após 5 semanas de DRC induzida por adenina (Figura 4c). Da mesma forma, o tratamento com metformina, iniciado após 5 semanas de DRC induzida por adenina, levou a uma expressão significativamente menor da citocina inflamatória Tnfa no final do estudo em comparação com os animais tratados com veículo no mesmo momento (P <0,01; Figura 4d e e). Resultados semelhantes foram observados com a expressão de Cd68, o que sugeriu a supressão da infiltração de macrófagos (Figura 4f e g). O risco de acidose láctica é controlável durante o tratamento com metformina na DRC estabelecida. Embora o tratamento com metformina tenha demonstrado a capacidade de retardar a progressão da DRC já estabelecida, deve notar-se que foi encontrada uma mortalidade mais elevada nos animais tratados com metformina (Figura 5). Porém, para combater e mitigar o risco de acidose láctica, ou seja, aumento dos níveis de lactato, foi realizado ajuste de dose de metformina (ver Métodos), o que resultou em diminuição dos valores ao final do estudo (Figura 6).