A aprendizagem prévia do medo permite a rápida assimilação de novas memórias de medo diretamente nas redes corticais - Parte 3

Design experimental

A reprodutibilidade dos dados foi avaliada com diferentes repetições (Tabela S1). Os primeiros experimentos de inativação de CNQX em Te2 (Fig. 1A-1C) foram realizados em um número maior de repetições porque foram os primeiros experimentos que conduzimos e serviram para testar a hipótese principal do nosso estudo. Os animais foram atribuídos a priori a diferentes grupos comportamentais de maneira equilibrada em termos de peso. Animais machos da mesma ninhada foram distribuídos aleatoriamente em cada grupo experimental. Abordamos primeiro a hipótese principal do nosso estudo, ou seja, a inativação cortical pode afetar de maneira diferente a consolidação de uma nova memória de medo em ratos experimentalmente ingênuos e em animais que aprenderam um evento de medo anterior.

Os animais machos têm memórias extremamente fortes porque têm um instinto de sobrevivência mais forte e um desejo de reprodução. Os animais que sobrevivem na natureza precisam lembrar muitas informações geográficas, tipos de alimentos, rastros de predadores e a localização dos membros do grupo para melhor se adaptarem ao ambiente e protegerem a vida.

Por exemplo, os leões machos precisam lembrar-se do status de todo o território, das relações de associação e da localização dos competidores para proteger o território e seu status. As zebras machos precisam lembrar a localização das fontes de água e alimentos nas pastagens para sobreviver e se reproduzir. Certa vez, uma empresa de refrigerantes publicou um anúncio mostrando que um urso polar macho conseguia se lembrar de um mergulhador e de seu cheiro único, para que pudesse identificá-lo na próxima vez que o visse.

Portanto, os animais machos precisam ter memórias fortes em termos de proteção do seu território, fornecimento de comida suficiente e reprodução da prole. Isto também os torna temas importantes na investigação humana, por exemplo, para explorar doenças como a perda de memória e a doença de Alzheimer.

No mundo humano, também podemos nos inspirar na memória dos animais machos. A exposição contínua a coisas novas, a aprendizagem e o pensamento contínuos podem melhorar a nossa memória e adaptabilidade, e melhorar os nossos padrões de vida e eficiência no trabalho. Portanto, aprendamos com os animais machos, continuemos a acumular conhecimento e experiência, tenhamos fortes instintos de sobrevivência e desejos reprodutivos e criemos um futuro melhor. Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem dos vários ingredientes ativos que ela contém, incluindo ácidos, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro de várias maneiras.

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No caso de diferenças estatísticas entre esses grupos, eventualmente realizamos grupos de controle adicionais através da injeção de solução salina. Uma abordagem semelhante foi aplicada aos experimentos optogenéticos, onde o grupo controle de AAV foi realizado somente após serem detectadas diferenças estatísticas entre ratos ingênuos e previamente treinados. Estes calendários experimentais permitiram-nos evitar grupos de controlo desnecessários e a utilização de animais desnecessários, uma questão fundamental na legislação europeia e italiana sobre experimentação animal (princípio dos 3 Rs).

Procedimentos comportamentais

Todos os experimentos foram conduzidos durante a fase clara do dia (8h às 16h). Os animais foram transportados individualmente das instalações para as salas experimentais em diferentes pequenos baldes transparentes, dependendo das demandas experimentais.

Treinamento auditivo: Primeira sessão comportamental. Animais auditivos condicionados pelo medo (CS1-CS2). Neste grupo, os ratos foram cuidadosamente retirados da sua gaiola e transportados da sala de alojamento para a sala à prova de som. Uma vez lá, os animais foram colocados dentro do aparelho de condicionamento composto por uma gaiola preta retangular (35 x 40 cm) equipada com uma grade de hastes de aço inoxidável (1 cm de diâmetro, espaçadas de 1,5 cm entre si) conectadas a um sistema de aplicação de choque.

Os ratos foram deixados em repouso durante 1 minuto. Após esse tempo, foram administrados 7 estímulos condicionados (ECs) constituídos por um tom puro de 15 kHz de frequência (15 s de duração cada, 80 dB, intervalo de tentativas de 36 s). O último 1 s de cada tom foi emparelhado com um US doloroso (0,5 mA, 1 s). No final da sessão de condicionamento, os ratos foram levados de volta à sua gaiola.

Animais apenas com choque (choque-CS2). Neste grupo, os ratos foram colocados de forma semelhante dentro do mesmo aparelho de condicionamento. Imediatamente depois, cada rato foi submetido a 7-choques nas patas (1 s, 0,5 mA), um imediatamente após o outro. Ao final da estimulação, os animais foram levados de volta à sua gaiola. O tempo de permanência na gaiola de condicionamento foi inferior a 9 segundos. Estudos anteriores mostraram que este procedimento permite evitar processos associativos entre estímulos dolorosos e estímulos sensoriais [29,30].

Odor em animais condicionados pelo medo (odor-CS2). Neste grupo, os ratos foram colocados dentro da mesma gaiola retangular preta empregada nos grupos experimentais acima e conectados a uma configuração de aplicação de choque. Os ratos foram deixados em repouso por 2 min. Após esse tempo, foram administrados 7 CSs constituídos por odores de baunilha (10 s de duração cada, intervalo de teste de 24 s). O último 1 s de cada odor foi combinado com um US doloroso (0,5 mA, 1 s). O módulo de condicionamento foi colocado próximo a uma fonte de ventilação para evitar a persistência dos estímulos entregues após o seu deslocamento. A gaiola foi assegurada com uma grade superior. Os odores foram apresentados usando um olfatômetro de diluição de fluxo. O ar limpo (1,5 L/min) foi direcionado para uma válvula solenóide que, quando acionada, passou o ar para um frasco de 15 ml contendo 10 ml de odor de baunilha.

Animais somente com tom (Tone-CS2). Os ratos deste grupo foram colocados dentro da mesma gaiola preta e foram apresentados ao tom 15-kHz (7 estímulos, 15 s de duração, 36 s ITI) emitido na ausência do US.

Animais pré-expostos (Tone-CS1-CS2). Os ratos foram colocados dentro da gaiola de condicionamento e, 1 minuto depois, foram apresentados 20 vezes apenas com o tom 15-kHz, e 24 horas depois o mesmo tom foi pareado com o US tornando-se o CS1.

Animais condicionados pelo medo com ruído branco (WN-CS2). Neste grupo, os ratos foram colocados dentro da gaiola preta retangular e deixados em repouso por 1 minuto. Após esse tempo, foram administrados 7 CSs constituídos por um WN (15 s de duração cada, 75 dB, 36 s de intervalo entre tentativas). O último 1 s de cada tom foi combinado com um US doloroso (0,5 mA, 1 s). No final da sessão de condicionamento, os ratos foram levados de volta à sua gaiola.

Aprendizagem auditiva do medo: segundo treinamento comportamental. Duas semanas após os procedimentos descritos no parágrafo acima, os animais foram treinados em outra tarefa diferente de condicionamento auditivo do medo. Os ratos foram colocados em uma caixa esfoladora padrão, como em nosso trabalho anterior [10], e deixados em repouso por 2 min. Após esse tempo, foram emitidos 7 CSs constituídos por tons puros de 3 kHz de frequência (8 s de duração cada, 80 dB, 22 s de intervalo entre tentativas). O último 1 s de cada tom foi emparelhado com um US doloroso (0,5 mA, 1 s). No final da sessão de condicionamento, os ratos foram levados de volta à sua gaiola.

Medo da retenção de memória. A retenção da memória auditiva do medo recentemente adquirida no CS2 (3 kHz) foi testada 4 dias depois. Para experimentos de optogenética, o teste de memória recente foi realizado com aplicação de laser 24 horas após o aprendizado CS2-US em analogia ao intervalo de tempo em que realizamos a inativação cortical através da administração do CNQX (ou seja, 24 horas após treinamento). Os ratos foram habituados a um aparelho diferente daquele usado para condicionamento e colocados em uma sala diferente para evitar comportamento de medo condicionado a pistas contextuais [10,62].

O novo aparelho consistia em uma gaiola de plástico transparente com a lateral pintada de preto, encerrada em uma caixa atenuadora de som equipada com exaustor, que eliminava o ar odorífero do recinto e proporcionava ruído de fundo de 60 dB. Os animais foram autorizados a explorar a gaiola durante 5 minutos por dia durante a sessão de habituação. No dia do teste de retenção de memória do medo, após 2 min de exploração livre, entregamos 4 CS2 de 3 kHz (8 s – 22 ITI) não seguidos de nenhum US.

Se exigido pela demanda experimental, os ratos foram então testados quanto à retenção da memória remota do medo, adquirida 2 semanas antes do segundo ensaio auditivo de condicionamento do medo. Para tanto, 7 dias após o teste de retenção de memória de medo ao tom 3-kHz, os animais foram colocados em um ambiente novo (uma gaiola listrada em preto e branco) e então apresentados ao tom 15-kHz. Quatro tons foram apresentados em intervalos de 36s.

Treinamento contextual: Primeira sessão comportamental. Grupo contextual de condicionamento do medo (CtxA-CtxB). Neste grupo, os ratos foram cuidadosamente retirados da sua gaiola, colocados num balde e transportados da sala de alojamento para a sala à prova de som. Uma vez ali, os animais foram colocados dentro do aparelho de condicionamento constituído pela referida gaiola retangular preta, equipada com grade de hastes de aço inoxidável conectada a um conjunto de aplicação de choque. Os ratos foram deixados em repouso durante 1 minuto. Após esse tempo, foram administrados 5 US (00,5 mA, 1 s) com intervalos de 51 s. Ao final da sessão, os animais foram levados de volta à sua gaiola.

Grupo somente choque (choque-CtxB). Os ratos, uma vez colocados dentro do aparelho de condicionamento, receberam imediatamente 5-choques nas patas (1 s, 0,5 mA), um imediatamente após o outro. O tempo de permanência na gaiola de condicionamento foi inferior a 7 segundos. Estudos anteriores mostraram que este procedimento permite evitar processos associativos entre estímulos dolorosos e estímulos sensoriais [29,30].

Grupo somente choque (choque-CtxB). Os ratos, uma vez colocados dentro do aparelho de condicionamento, receberam imediatamente 5-choques nas patas (1 s, 0,5 mA), um imediatamente após o outro. O tempo de permanência na gaiola de condicionamento foi inferior a 7 segundos. Estudos anteriores mostraram que este procedimento permite evitar processos associativos entre estímulos dolorosos e estímulos sensoriais [29,30].

Novo condicionamento contextual do medo e retenção recente da memória do medo. Duas semanas após os procedimentos descritos no parágrafo acima, todos os grupos foram treinados para associar um novo ambiente contextual (o módulo skinner box, colocado em uma sala diferente) com um US doloroso (0,5 mA, 1 s) . Cada animal foi colocado dentro da nova câmara e deixado em repouso por 2 min. Em seguida, foi exposto a 5 US separados por intervalos de 30 s.

A retenção da memória contextual do medo foi testada 4 dias após o procedimento de condicionamento do medo, colocando os ratos novamente na câmara de Skinner por 3 min. Para experimentos de optogenética, o teste de memória recente foi realizado com aplicação de laser 24 horas após o aprendizado do CtxB-US em analogia ao intervalo de tempo em que realizamos a inativação cortical através da administração do CNQX (ou seja, 24 horas após o treinamento). Se exigido pela demanda experimental, os ratos foram então testados quanto à retenção da memória remota do medo, colocando os animais no contexto pareados com os EUA 2 semanas antes da nova associação.

Os animais foram transportados em 2 baldes diferentes para as câmaras de condicionamento de acordo com os diferentes procedimentos contextuais.

Medida de congelamento. Em todos os procedimentos experimentais, a avaliação da retenção da memória do medo foi determinada como uma resposta de congelamento [10], analisada como a completa ausência de mobilidade somática, exceto para movimentos respiratórios. Para cada animal, a quantidade de tempo (em segundos) gasto no congelamento foi medida off-line por 2 observadores independentes que desconheciam os grupos de animais.

Procedimentos cirúrgicos

Para administrar as substâncias selecionadas nos locais-alvo, os ratos foram anestesiados com isoflurano: A indução foi realizada a 4% [vol/vol] em 2 L/min de ar medicinal e estendida para uma exposição contínua a 2% [vol/vol]) quando os ratos foram montados no aparelho estereotáxico.

Uma incisão no crânio foi feita e pequenos orifícios foram perfurados para permitir a penetração de uma agulha de infusão de calibre 28-. Uma seringa 10-ul Hamilton montada em uma bomba de infusão foi usada para administrar substâncias. Após as infusões, a agulha foi deixada no local por mais 3 minutos. A incisão foi então fechada com clipes de aço inoxidável e o animal recebeu uma injeção subcutânea do analgésico/anti-inflamatório cetoprofeno (2 mg/kg de peso corporal), e o animal foi mantido aquecido e sob observação até a recuperação da anestesia.

Tal como em estudos anteriores [10,32–34], a canulação de animais foi desnecessária, sendo os compostos activos administrados directamente de forma estereotáxica. Este procedimento é vantajoso porque o trauma cirúrgico inerente ao procedimento de canulação permanente é evitado, restringindo assim o trauma à penetração de uma única agulha [10,32–34]. Na verdade, a anestesia geral não afeta significativamente a consolidação da memória [10,32–34]. Para garantir que o momento da administração dos compostos relacionado ao ensaio de aprendizagem fosse preciso, de modo que os ratos recebessem os compostos selecionados cerca de 1 hora e cerca de 1 dia após o treinamento, a anestesia com isoflurano foi induzida 5 minutos antes do momento da injeção planejada, por exemplo, aos 55 minutos. min em ratos tratados 60 min após o treinamento e 23 horas e 55 minutos em animais injetados 24 horas após o treinamento. Cada rato foi condicionado e depois operado separadamente. Os animais pertencentes aos diferentes grupos comportamentais foram manipulados de forma intercalada.

O inibidor seletivo dos receptores AMPA/cainato glutamato CNQX ({{0}}Ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] foi dissolvido em solução salina estéril (NaCl, 00,9%) e ajustado para pH 7,4 com HCl. O inibidor da síntese proteica anisomicina (Merck, 125 ug/ul) foi dissolvido em HCl equimolar, diluído com solução salina estéril e ajustado para pH 7,4 com NaOH. Solução salina estéril (NaCl a 0,9%) foi utilizada como controle de veículo. Essas substâncias foram injetadas bilateralmente a uma taxa de 0,1 ul/min e um volume de 0,5 ul por local nas seguintes coordenadas estereotáxicas retiradas do atlas de Paxinos e Watson [26], com o campo cortical Te2 referenciado ao atlas de Zilles [25]:

Córtex auditivo secundário (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Córtex cingulado anterior (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

O volume de injeção (00,5 ul por local) foi selecionado com base em estudos anteriores onde compostos ativos foram injetados em Te2 [10,34] e ACC [55,63] em ratos adultos.

Para inativar o hipocampo dorsal, os compostos ativos foram injetados em um volume de 0,6 ul por local nas seguintes coordenadas estereotáxicas:

Hipocampo dorsal: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

As lesões irreversíveis do hipocampo dorsal foram induzidas pela administração de NMDA (Tocris, 18 ug/ul, dissolvido em solução salina estéril, 0,4 ul por local) a uma taxa de 0,1 ul/ min em pontos nas coordenadas acima mencionadas. As mesmas coordenadas foram utilizadas para controles injetados com solução salina e animais operados de forma simulada.

Red Retrobeads (Lumafluor, diluição 1:2 em solução salina, 0,6 ul) foram injetados em BLA de acordo com as seguintes coordenadas: AP: −2,8; L: ±5,4; VD: −8,3.

Ao final dos experimentos, os traços da agulha no caso de injeções de CNQX, anisomicina ou solução salina ou a extensão das lesões no caso de injeções de NMDA foram verificados histologicamente. Os ratos foram profundamente anestesiados e perfundidos intracardialmente com formaldeído a 4%. Seus cérebros foram seccionados a 30 μm em um criostato. Cortes seriados corados com Nissl foram preparados usando o procedimento convencional e os cortes foram verificados histologicamente sob um microscópio ampliado em 2,5×.

Experimentos optogenéticos

Injeção de vírus. O vírus adeno-associado AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry e o vetor de controle AAV5:CaMKII -cherry foram obtidos do Vector Core da Universidade da Carolina do Norte (Chapel Hill, Carolina do Norte, Estados Unidos da América). A sentença Viraltiter foi 5:8. O título viral foi 5,8 × 10^12 vg/ml para ambos os vírus. O uso do promotor CaMKII permite a expressão do transgene favorecendo os neurônios piramidais. Os vírus foram alojados em um freezer a −80˚C. Infusões virais direcionadas ao Te2 ou ao ACC foram realizadas nas coordenadas estereotáxicas acima nos volumes de 0,5 ul para cada orifício. O vírus foi injetado a uma taxa de 0,1 ul/min e a agulha foi deixada no local por mais 5 min. As injeções virais foram realizadas 4 semanas antes dos experimentos optogenéticos.

Iluminação.

As fibras ópticas (Plexon, núcleo 200/230 μm; 10 mm de comprimento) foram implantadas bilateralmente no BLA (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm de bregma). A inibição optogenética das projeções Te2 para BLA ou das projeções ACC para BLA foi obtida usando o Sistema de Estimulação Optogenética PlexBright acoplado a um diodo laser (Laserglow Technologies). A luz amarela (589 nm) é gerada e passada através de uma fibra óptica. A densidade de potência estimada na ponta da fibra óptica foi de 10 a 15 mW para iluminação dos locais de projeção. Durante a retenção da memória de medo, a emissão de luz foi iniciada 4 s antes do início do tom, persistiu durante todo o tom e foi interrompida 4 s após o deslocamento do tom. Os animais pertencentes a grupos de condicionamento de medo contextual receberam estimulação luminosa durante toda a exploração do contexto (3 min). Os ratos foram familiarizados com o patch cord durante 2 dias antes do ensaio de retenção de memória.

Imunohistoquímica. Após a conclusão das experiências de optogenética, os ratos foram profundamente anestesiados e perfundidos intracardialmente com PAF a 4% para examinar a difusão do vírus. Os cérebros foram dissecados, armazenados durante a noite a 4˚C e finalmente transferidos para sacarose a 30%. Secções coronais (30 μm) foram cortadas em criostato e coletadas em PBS. Secções flutuantes foram incubadas numa solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, eles foram incubados em anticorpo monoclonal primário de camundongo anti mCherry (diluição 1:500, Abcam) na solução de bloqueio durante a noite à temperatura ambiente. Posteriormente, as secções foram lavadas com PBS e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo anti-murganho fluorescente secundário AlexaFluor-568 (1:600, Invitrogen) diluído em PBS. As seções foram lavadas em PBS, montadas com meio de montagem contendo DAPI (Vector) e as lamínulas.

Os cérebros de ratos que foram submetidos a injeções de NMDA foram coletados de forma semelhante. Secções flutuantes, após vários enxaguamentos, foram incubadas com anticorpo monoclonal primário anti-Neun de ratinho (diluição 1:1, 000, Merck) na solução de bloqueio durante a noite à temperatura ambiente. Subsequentemente, as secções foram lavadas com PBS e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpo anti-murganho de cavalo biotinilado (diluição 1:200, Vector). O complexo avidina-biotina (complexo ABC 1:100, Vector, 2 horas e meia de incubação) foi acoplado a diaminobenzidina (0,03%, Merck) para corar Neun. As seções foram então enxaguadas em PBS e transferidas para lâminas revestidas de gelatina, desidratadas e cobertas com lamínula.

Seções Te2 de ratos injetados com retroesferas foram submetidas a incubação com anticorpo policlonal primário anti-Fos de coelho (1:2, 000, Sinalização Celular) na solução de bloqueio durante a noite à temperatura ambiente. Posteriormente, as fatias foram lavadas com PBS e incubadas por 1 h em temperatura ambiente com Alexa 488 anti-coelho (1:1,000, Invitrogen, em PBS). Finalmente, as secções imunomarcadas foram lavadas em PBS, montadas em lâminas revestidas de gelatina e cobertas com meio de montagem suplementado com DAPI.

Microscopia

A rotulagem mCherry foi examinada usando um microscópio confocal Zeiss Airyscan: Dois lasers foram usados ​​(405 e 561 nm), cada um correspondendo ao espectro de emissão de pico para DAPI (coloração Nissl para núcleos celulares) e Alexa 568 (mCherry ), respectivamente. Para analisar a difusão do vírus nos locais de injeção, micrografias de Te2 e ACC foram adquiridas como imagens em mosaico (cada uma delas foi adquirida usando uma objetiva de 10x). Os terminais axônicos no BLA foram analisados ​​​​usando uma objetiva de 40 × como uma pilha z de 10 seções, espaçadas de 1 μm (quadrado de 159 μm; fração de zoom, 1,0).

Para animais injetados com retroesferas que foram submetidos à imunomarcação com cFos, as imagens foram adquiridas com uma ampliação de 40× (159 μm quadrado; fração de zoom, 1.0) com 3 lasers diferentes, correspondendo ao espectro de emissão de pico para DAPI (coloração Nissl para núcleos celulares), AlexaFluor 488 (cFos) e Texas Red (Retrobeads), respectivamente. Seções de 0,7 μm foram adquiridas ao longo de uma pilha z de 10-μm. O número de núcleos que expressam cFos, marcados com esferas e duplo-positivos (esferas cFos + marcadas) foi quantificado para cada animal na região Te2 nas coordenadas ântero-posteriores de 6,7 a 7,3 mm do bregma [10]. Os dados foram então calculados para produzir a média de cada animal e os resultados foram comparados estatisticamente. Imagens de cortes com coloração DAB de Neun foram analisadas usando o software Neurolucida conectado a um microscópio por meio de uma câmera CCD colorida [10].

Análise de dados e critérios de exclusão

O n para cada grupo foi estabelecido a priori de acordo com nossos estudos anteriores [10,16,17], trabalhos publicados anteriormente na área (ver como referências para ACC [6,22,55] e Te2 [10,59]), e através de estimativas de potência G, conforme tabela a seguir (Tabela 1):

Para cada análise estimou-se um número médio final de 8 a 10 animais para cada grupo. Os grupos foram executados com controles internos na mesma sessão experimental (Tabela S1). Dada a variabilidade dos procedimentos cirúrgicos e comportamentais, incluímos a priori um maior número de sujeitos experimentais (até 15% a mais) que em alguns casos atendiam aos critérios experimentais e foram incluídos, evitando assim uma exclusão arbitrária. No caso dos estudos do hipocampo, para avaliar os efeitos das injeções de NMDA e CNQX em intervalos de tempo distintos, equilibramos o número total de animais controle entre ratos operados com veículo e simulados entre os diferentes grupos.

Análise comportamental, inspeções histológicas e contagens de células foram realizadas às cegas. Animais com localização inadequada do trajeto da agulha ou da lesão no caso de lesões irreversíveis por NMDA foram excluídos da análise dos dados (Tabela S1). Em estudos farmacológicos, excluímos 57 animais de um total de 465 animais devido ao posicionamento incorreto da agulha (22/255 para Te2, 31/179 para ACC e 4/31 para hipocampo). Em estudos de rastreamento, em 21 animais, eliminamos 3 indivíduos nos quais a injeção de retroesferas não atingiu o BLA. Nos estudos de optogenética Te2, num total de 30 animais, excluímos 1 rato porque a colocação das fibras ópticas não estava acima da região alvo, 1 rato. Afinal, o vírus estava ausente em Te2 e em 2 ratos porque a difusão do vírus foi respectivamente inferior a 4,7% e 5,3% da área de Te2 nos locais de injeção. Nos ratos incluídos na análise estatística, a difusão mínima do vírus foi de 39,6% na coordenada estereotáxica mais anterior e 50,2% na coordenada estereotáxica mais posterior.

Da mesma forma, nas experiências de optogenética ACC, num total de 32 animais, 2 ratos foram eliminados porque a colocação das fibras ópticas não estava acima da região alvo. Dois ratos foram excluídos porque o vírus no ACC estava ausente, 1 animal porque o vírus estava no córtex motor secundário adjacente e 1 rato porque a difusão do vírus foi inferior a 2,3% da área do ACC nos locais de injeção. Nos demais ratos, a difusão mínima do vírus foi de 33,3% na coordenada estereotáxica mais anterior e 42,2% na coordenada mais posterior.

Nos estudos de lesões NMDA, as lesões atingiram principalmente a região CA1 do hipocampo dorsal. A extensão mínima (vermelho) e máxima (rosa) das lesões do hipocampo sobre toda a área do hipocampo dorsal foram respectivamente 23,2% e 53,5% na coordenada estereotáxica mais anterior e 28,3% e 62,3% na coordenada mais posterior. Num total de 73 animais, 4 ratos foram eliminados porque a lesão estava ausente, enquanto outros 3 animais foram descartados porque a extensão das lesões era inferior a 5,0% (nomeadamente 4,8%, 4,3%, 3,1 %) referente à área do hipocampo nas 2 coordenadas.

A análise do contorno da área foi realizada através de inspeção visual e quantificação manual utilizando a ferramenta região-contorno do software ZEN 3.0. Os valores da área foram então normalizados na área total da região. As coordenadas estereotáxicas de Te2, ACC e hipocampo foram baseadas no atlas de Paxinos [26] e, no caso de Te2, com campo cortical referido ao atlas de Zilles [25].

Análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± SEM. Todos os dados passaram no teste de Levene para igualdade de variâncias. Assim, estatísticas paramétricas foram empregadas ao longo de todos os experimentos. Os dados de 2 grupos foram comparados usando 2-testes t de Student não pareados. As comparações entre múltiplos grupos foram avaliadas usando um teste ANOVA 1-way com teste post hoc de Tukey. Para abordar as diferenças entre e dentro dos grupos, calculamos um modelo ANOVA de design misto 3 × 2 com um grupo (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) como o entre- variável dos sujeitos e condição (antes e depois do condicionamento + injeção recente) como a variável dentro dos sujeitos. Onde a interação grupo × condição foi significativa, realizamos uma análise simples de efeitos principais e ajustamos cada valor de p com a correção de Bonferroni. Para cada modelo ANOVA misto, avaliamos a suposição de esfericidade através do Teste de Esfericidade de Mauchly.

Os parâmetros estatísticos (ou seja, o valor exato de n para cada grupo, SEM, o teste estatístico, o tamanho do efeito e o valor p exato) são relatados nas legendas. Para tamanhos amostrais iguais, os tamanhos de efeito para testes t não pareados foram determinados calculando-se o d de Cohen ou o d de Glass de acordo com a similaridade dos SDs, enquanto, para tamanhos de amostra diferentes, o g de Hedges. As correlações entre a contagem de células e o congelamento foram calculadas utilizando o coeficiente de Pearson. Para determinar se os dados atendiam aos pressupostos da abordagem estatística, rejeitamos a hipótese nula no nível P <{2}},05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS Statistics 22 (IBM).

Informações de Apoio

S1 Fig. Ampliação dos traços da agulha do córtex Te2 (A) e ACC (B) injetados com CNQX, selecionados como exemplos. (C) Quando representados com o mesmo contexto 2 semanas após o procedimento, os animais apenas com choque mostraram uma resposta de medo baixa, demonstrando que o procedimento não provocou congelamento condicionado no contexto onde o choque foi aplicado. (D) Resultados semelhantes aos da Figura 1 foram obtidos contrabalançando os 2 tons empregados como CSs (CS1, 3 kHz e CS2, 15 kHz) (teste t de Student, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, vidro d=4.14). (E) Nos ratos condicionados com odor-CS, o congelamento ao odor, 2 semanas após o condicionamento, foi alto, mesmo se testado em um ambiente diferente em relação ao contexto de condicionamento, mostrando assim que o medo estava especificamente associado a essa entrega de sugestão. Barras de escala, 300 μm. ��P < 0,01. Todos os dados são médios e SEM. Os dados resumidos para S1 Fig podem ser encontrados nas informações de suporte no arquivo denominado S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Fig. A injeção de CNQX prejudicou a retenção de memórias auditivas recentes de medo em ratos onde a generalização do medo foi reduzida por um tom sozinho pré-exposição ou pelo emprego de um tom de ruído branco como CS1. Uma ANOVA de design misto 3 × 2 (efeito principal do grupo: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, efeito principal da condição: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grupo × interação de condição F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) mostrou que o congelamento para o tom de 3 kHz antes de sua associação aos EUA era menor em animais que receberam o tom de 15 kHz pré-exposição antes do emparelhamento 15 kHz-US (n=10, p=0.001) ou em ratos condicionados a um ruído branco (n=13 , p=0.008) em comparação com animais CS1-CS2 (n=22) que mostraram uma resposta variável de generalização do medo. No entanto, após o aprendizado CS-US e injeções de cnqx no córtex Te2, a memória recente do medo foi prejudicada em todos os grupos (p > 0,05). Efeito principal simples dentro dos grupos (antes e depois do aprendizado CS-US seguido de injeção cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Tom-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Todos os dados são médios e SEM. Os dados resumidos para S2 Fig podem ser encontrados em Informações de suporte no arquivo denominado S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Fig. (A) Exemplo aleatório de injeção de retroesferas visando BLA. (B e C) Exemplos de posicionamentos de fibra óptica acima do BLA de animais injetados com vetores AAV em Te2 (B) e córtex ACC (C). Barras de escala, 500 μm.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. E. Manassero por seu apoio e aconselhamento contínuos.

Contribuições do autor

Conceituação: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Curadoria de dados: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Análise formal: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Aquisição de financiamento: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Investigação: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologia: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Supervisão: Benedetto Sacchetti.

Validação: Benedetto Sacchetti.

Redação – rascunho original: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Redação – revisão e edição: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Referências
1. Frankland PW, Bontempi B. A organização de memórias recentes e remotas. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

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4. Alvarez P, Escudeiro LR. Consolidação da memória e lobo temporal medial: um modelo de rede simples. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Por que existem sistemas de aprendizagem complementares no hipocampo e no neocórtex: percepções dos sucessos e fracassos dos modelos conexionistas de aprendizagem e memória. Psicol Rev. 1995; 102:419–457.

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