Efeitos preventivos de glicosídeos de feniletanol de Cistanche Tubulosa

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You, e outros

Abstrato

Fundo:Cistanchetubulosaé uma medicina tradicional chinesa que é amplamente utilizada para regular a imunidade.Feniletanoildoglicosídeos(CPhGs) desta planta são os materiais principalmente eficazes. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos preventivos e terapêuticos de CPhGs na fibrose hepática induzida por BSA em ratos e mecanismos moleculares relacionados envolvendo células estreladas hepáticas. Biejiaragan (BJRG), outro fitoterápico tradicional chinês, foi usado como controle positivo.

Métodos:Em experimentos in vivo, 75 ratos SD foram divididos aleatoriamente em 6 grupos: normal (tratado com água destilada), modelo (tratado com BSA), droga positiva (tratado com BSA mais BJRG 600 mg/kg/dia) e tratado com BSA mais grupos CPhGs (125, 250 e 500 mg/kg/dia). Os índices de fígado e baço, níveis séricos de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), ácido hexadecenóico (HA), laminina (LN), procolágeno tipo III (PCIII), colágeno tipo IV (IV-C), hidroxiprolina (Hyp ) e fator de transformação de crescimento 1 (TGF- 1) foram medidos em fígados de ratos. Os graus histopatológicos para fibrose hepática foram avaliados para cada grupo usando H&E e coloração tricrômica de Masson. A expressão de TGF- 1, colágeno I (Col-I) e colágeno III (Col-III) foi determinada por um método de coloração imuno-histoquímica. Esses efeitos foram ainda avaliados in vitro determinando os níveis de expressão de NF-κB p65 e Col-I por meio de análises quantitativas de PCR em tempo real. A expressão da proteína Col-I também foi examinada por Western blotting.

Resultados: Todos os grupos de dose (125, 250 e 500 mg/kg/dia) de CPhGs reduziram significativamente o índice do fígado e do baço, diminuíram ALT, AST, HA, LN , PCIII, níveis séricos IV-C, conteúdo de TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0,01="" e="" p="">< 0,01)="" e="" hyp="" contente.="" os="" cphgs="" também="" aliviaram="" marcadamente="" o="" inchaço="" das="" células="" do="" fígado="" e="" preveniram="" efetivamente="" a="" necrose="" dos="" hepatócitos="" e="" a="" infiltração="" de="" células="" inflamatórias.="" os="" resultados="" imuno-histoquímicos="" mostraram="" que="" os="" cphgs="" reduziram="" significativamente="" a="" expressão="" de="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" e="" p="">< 0,01),="" col-i="" e="" col-iii.="" os="" efeitos="" in="" vitro="" de="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" e="" 25="" ug/ml)="" em="" hsc-t6="" mostraram="" que="" cphgs="" reduziram="" significativamente="" a="" expressão="" de="" mrna="" de="" nf-κb="" p65="" e="" col-i,="" e="" cphgs="" também="" reduziram="" a="" expressão="" da="" proteína="">

Conclusões:Os CPhGs têm um efeito anti-fibrose hepática significativo e podem ser usados ​​como agentes hepatoprotetores para o tratamento da fibrose hepática.

Palavras-chave:Fibrose hepática,Cistanche tubulosa,Feniletanoildoglicosídeo,Quimiocina BSA, Prevenção e Terapia

FeniletanoildoglicosídeodentroCistanchetubulosa

Fundo

A fibrose hepática é uma resposta da cicatrização de feridas à lesão hepática grave que ocorre na patogênese da hepatite crônica induzida por vários fatores. Esses fatores são infecção viral, abuso de álcool, colestase e doenças metabólicas e autoimunes [1-3]. O acúmulo progressivo de matriz extracelular (MEC) e a diminuição da remodelação perturbam a arquitetura normal do fígado, resultando em fibrose hepática [4]. A fibrose hepática é crítica na doença hepática crônica e frequentemente evolui para cirrose irreversível e carcinogênese. Atualmente, não existem métodos ou medicamentos eficazes para o tratamento da fibrose hepática. Portanto, é urgente encontrar um fármaco anti-fibrose hepática que atenue a progressão da lesão hepática para fibrose e câncer.

CistanchetubulosaW (da família Orobanchaceae) é uma planta parasita que é amplamente cultivada na região sul de Xinjiang na China [5]. As pessoas costumam usá-lo para revigorar os rins, nutrir o sangue, relaxar o intestino e retardar a senescência. Está oficialmente listado na Farmacopeia Chinesa [6].Cistanchetubulosacontém uma variedade de componentes ativos. Esses incluemFeniletanoildoglicosídeos(CPhGs), iridóides e polissacarídeos. Um dos muitos componentes ativos emCistanchetubulosa, CPhGshave exibiu efeitos antioxidantes, antifadiga, neuroprotetores e anti-inflamatórios convincentes em estudos in vivo e in vitro [7]. Nos últimos anos, foi relatado que os CPhGs têm efeitos hepatoprotetores. Os mecanismos potenciais subjacentes a esses efeitos são a eliminação de radicais livres, proteção das membranas hepáticas, imunorregulação, inibição da apoptose, inibição da expressão de HBsAg e HBeAg, inibição da replicação do DNA do HBV e outros [8-11]. No entanto, poucos estudos na literatura abordam o efeito anti-fibrose hepática das GPhCs. Portanto, este estudo teve como objetivo investigar o efeito anti-fibrose hepática de GPhCs usando um modelo de fibrose hepática induzida por albumina sérica bovina (BSA) em ratos. Mecanismos moleculares relacionados foram investigados em células HSC-T6.

Métodos

Produtos químicos e reagentes

Um kit de hidroxiprolina (hidrólise alcalina) (Lote: 20140616) foi adquirido do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China). Os kits de sanduíche ELISA de TGF de rato - 1 (Lote: 238240615) foram adquiridos da Lianke Biotech Co., Ltd. (China). Anticorpo anti-colágeno I de coelho (lote: 140619), anticorpo anti-colágeno III de coelho (lote: 980788 W) e anticorpo anti-TGF- 1 de coelho (lote: 140619) foi fornecido pela Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( China). Incluído com soro de ovelha normal (fluido de trabalho) (Lote: WP141214), PV-6000(Lote: WK141225) e kit DAB (Lote: K136621D) foram adquiridos da Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (China). A detecção de anticorpos primários foi realizada usando 2. Solução de anticorpo (Alk-Phos.Conjugated, Anti-rabbit) e 2. Solução de anticorpo (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (lote: 272387) adquirido da Invitrogen Company (EUA) .

A albumina de soro bovino (BSA) (Lote: SLBG8239V) foi adquirida da Sigma (EUA). Antes do uso, o BSA foi preparado a 18 g/L em solução salina normal, as bactérias removidas por filtração e o BSA armazenado a 4 graus. O adjuvante incompleto de Freund contendo 1 g de lipídio de pêlo de ovelha (Lote: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (China)) foi misturado com 2 g de parafina líquida (Lote: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (China), esterilizado em autoclave a vapor e armazenado a 4 graus. O medicamento positivo BJRG foi obtido como comprimidos Biejiaragan da Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (China). Os estoques de medicamentos BJRG foram preparados dissolvendo comprimidos BJRG em água destilada na concentração de 600 mg/kg.

Feniletanoildo glicosídeodentroCistanchetem efeitos preventivos

Materiais vegetais

Cistanche tubulosa(família Orobanchaceae) foi adquirido da região Minfeng de Xinjiang da China. O material foi autenticado pelo pesquisador Jun Zhao, do Laboratório-Chave de Medicina Uigur, do Instituto de Matéria Médica de Xinjiang. Espécimes de comprovante foram depositados no Instituto de Matéria Médica de Xinjiang.

Preparação de CPhGs

Rizomas secos e fatiados deCistanchetubulosa(6,0 kg) foram extraídos consecutivamente sob refluxo três vezes com etanol a 70%, e o solvente foi removido para produzir o extrato etanólico. Extratos etanólicos foram purificados usando resina AB-8 para obter ofeniletanoideglicosídeos(CPhGs). As soluções de estoque de CPhGs usadas para diferentes grupos de dose em estudos com animais (500 mg/kg, 250 mg/kg e 125 mg/kg, respectivamente) foram dissolvidas em 0,5 por cento (5 g/L) de carboximetilcelulose ( Sal de sódio).

Quantificação de CPhGs

O conteúdo de dois componentes (equinacosídeo e acteosídeo) nos CPhGs foi determinado por HPLC usando um método relatado anteriormente (Zhang et al. 2004)[12]. A HPLC foi realizada usando um Shimadzu LC-10AHPLC equipado com um detector de UV. A coluna HPLC era uma coluna Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). A fase móvel isocrática consistiu em metanol-acetonitrila-1 por cento de ácido acético (15:10:75, v/v/v). A eluição foi de 40 min e a vazão foi mantida em 0,6 mL/min. A temperatura da coluna foi mantida constante a 30 graus. A detecção de UV foi a 334 nm.

Animais e linhagem celular HSC-T6

Ratos Sprague-Dawley (SD) machos adultos saudáveis ​​[Grau SPF] (180-220 g) foram adquiridos do Xinjiang Medical University Animal Center, Licença No.: SCXK (Novo) 2011-0004. Os ratos foram alimentados com ração isenta de patógenos específicos (SPF). Todos os procedimentos relacionados aos experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Xinjiang. Os ratos foram alojados em gaiolas sob condições ambientais controladas (25 graus e um ciclo claro/escuro de 12 h) e tiveram acesso livre a ração padrão para ratos e água da torneira. Os ratos foram aclimatados antes do tratamento.

Uma linha celular estrelada hepática de rato imortalizada, HSC-T6, foi obtida de Wuhan Procell Gene BiotechnologyCo., LTD. (Wuhan, China). As células HSC-T6 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (alta glicose) (DMEM, Pequim, China) suplementado com 10 por cento de soro fetalbovino (Gibco, América do Sul), 100 UI/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina (Pequim, China ) em incubadora umidificada a 37 graus com 5 por cento de CO2.

Lesão hepática induzida por BSA e tratamentos

Setenta e cinco ratos SD foram divididos aleatoriamente em seis grupos: Normal (tratado com água destilada), modelo (tratado com BSA), droga positiva (tratado com BSA mais BJRG 600 mg/kg/dia) , e grupos tratados com BSA mais CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/dia). Os grupos tratados com BSA mais CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/dia) tiveram 13 ratos em cada grupo, e o outro grupo teve 12 ratos em cada grupo. O modelo de lesão hepática induzida por BSA é dividido em sensibilização primária seguida de ataque imunológico) [13]. Com exceção do grupo normal, os demais grupos receberam múltiplas injeções subcutâneas com 0,5 ml (9 mg/ml) de adjuvante incompleto de BSAFreund no dia 1, dia 15, dia 22, dia 29 e dia 36 para sensibilização primária. Sete dias após a quinta injeção, o sangue foi obtido através do plexo da veia retiniana de rato e testado para anticorpos de albumina sérica. O anticorpo BSA em soro de rato foi detectado pelo método de difusão em ágar duplo. A injeção de ataque foi realizada pela administração de 0,4 ml de BSA em solução salina normal pela veia caudal em ratos positivos para anticorpos BSA duas vezes por semana por dez vezes. As concentrações e tempos de injeções foram 5.00, 5,50, 6.00, 6,50,7.00, 7,50, 8,50, 9,00, 9,50 e 10,00 g/L no dia 46 , dia 50, dia 53, dia 57, dia 60, dia 64, dia 67, dia 71, dia 74 e dia 78, respectivamente. No grupo normal, a solução salina normal foi usada para injeções imunológicas primárias (sensibilização) e secundárias (ataque) em vez de BSA, e outras condições foram as mesmas do grupo modelo.

O grupo normal recebeu água destilada por via oral na dose de 10 ml/kg/dia. O grupo modelo foi administrado oralmente a 10 ml/kg/dia de solução de CMC-Na a 0,5 por cento. O grupo de droga positivo foi administrado oralmente a 600 mg/kg/dia de BJRG. Os grupos tratados com BSA mais CPhGs (125.250 e 500 mg/kg/dia) receberam oralmente 125, 250 e 500 mg/kg/dia de CPhGs, respectivamente. Ratos de dosagem diária continuaram por duas semanas após a última injeção.

Após o período experimental, os ratos foram submetidos a jejum de 12 h antes do hidrato de cloral a 10% e imediatamente eutanasiados. Amostras de soro foram coletadas de cada rato e imediatamente utilizadas. Os fígados foram colhidos para duas finalidades: (1) preservação em nitrogênio líquido para Hyp kits e (2) fixação em formaldeído a 10% para exames histológicos e imuno-histoquímicos. A duração total dos estudos em animais foi de 93 dias.

Feniletanoildo glicosídeodentroCistanchetem efeitos preventivos

Índices de fígado e baço

O fígado e o baço foram dissecados por laparotomia e lavados com soro fisiológico 4 graus. Após a absorção do excesso de água com papel de filtro, o fígado e o baço foram pesados ​​para calcular os índices correspondentes: Peso relativo do órgão=massa do órgão (g)/massa corporal individual (g) × 100 por cento [14].

Análise de marcadores de fibrose hepática

O efeito protetor de CPhGs contra lesão hepática induzida por BSA foi avaliado medindo ALT e AST (Mind ray automatic biochemical analyzer, A086A0182). O desenvolvimento de fibrose hepática e os efeitos do tratamento foram determinados examinando HA, LN, PC III e IV-C (Analisador de quimioluminescência, TaiGeKeXin, MP2808).

Conteúdo hyp e análise de TGF- 1

O nível de Hyp no tecido hepático foi determinado por um método espectrofotométrico de acordo com as instruções do kit. O nível de Hyp foi expresso como Hyp (ug)/proteína (mg).Hyp (ug/mg)=(OD medido - OD em branco)/(OD padrão em branco OD)×5 (ug/ml) × 10/peso úmido do tecido (ml/mg). A concentração hepática de TGF- 1 foi detectada por meio de kits ELISA de acordo com as instruções do fabricante. O efeito inibitório dos CPhGs sobre a fibrose foi confirmado pelos níveis de expressão de TGF- 1.

Exame histopatológico

O tecido hepático na mesma parte do lobo esquerdo foi ressecado e fixado em solução de formaldeído a 10%. Os tecidos foram corados com H&E convencional e coloração estricromo de Masson para observar as alterações histopatológicas ao microscópio de luz. A expressão de colágeno tipo I, colágeno tipo III e TGF- 1 em tecidos hepáticos foi analisada por coloração imuno-histoquímica [15].

A imuno-histoquímica semi-quantitativa foi realizada de acordo com os métodos relatados [16, 17]. As seguintes classificações foram usadas para células TGF- 1 positivas: "-" indica quase nenhuma expressão, 20=l; "mais" indica células positivas reunidas individualmente na área da lesão, 21=2; "mais mais" indica células positivas em pequenos grupos reunidos ao redor da área da lesão, 22=4; " plus plus plus " indica células positivas dispersas expressas, como 23=8. Os resultados representam uma integração hierárquica. O grau e escopo cromogênico do colágeno tipo I e do colágeno tipo III foram convertidos em CRI para análise estatística (grau cromogênico × faixa cromogênica). O grau cromogênico é dividido em fraco “mais”, moderado “mais mais”, e forte “mais mais mais”. A faixa cromogênica é dividida em "mais", sua faixa cromogênica < visualização="" 1/4;="" "="" plus="" plus="" ",="" seu="" alcance="" cromogênico="" de="" visão/4-2/4;="" "="" plus="" plus="" plus="" ",="" seu="" alcance="" cromogênico="" de="" visão="" 2/4-3/4;="" "="" plus="" plus="" plus="" plus="" ",="" sua="" faixa="" cromogênica=""> 3/4. Blindedscoring foi realizado por duas pessoas onde "mais" é 1; " mais mais "é 2, " mais mais mais " é 3 e " mais mais mais mais " é 4. Três campos de observação do microscópio (ampliação × 200) foram selecionados aleatoriamente para cada seção, com o nível médio das amostras usado como um nível semiquantitativo.

Experimentos celulares

As células HSC-T6 foram plaqueadas em uma placa de 96-poço. Inicialmente, as células foram cultivadas com DMEM contendo 10 por cento de FBS por 48 h. O meio foi então substituído por DMEM sem FBS para privar as células por 12 h. As células foram então cultivadas com DMEM que continha 5,0 ng/mLTGF- 1 (sem FBS) por 24 h. Finalmente, diferentes concentrações de CPhGs (100ug/ml, 50ug/ml e 25ug/ml), acteosídeo (6 ug/ml, 3 ug/ml e 1,5 ug/ml), andechinacoside (500ug/ml, 250ug/ml, e 125ug/ml) foram realizados na placa em poços quadruplicados e incubados por 48 h.

Análise de PCR em tempo real

O nível de expressão de mRNA de NF-κB, p65 e colágenoI foi determinado por PCR em tempo real. Para determinar as expressões de mRNA em células HSC-T6, as células (4 × 1{31}}5 células) foram semeadas em placas de seis poços com 3 mL de DMEM com 10 por cento de FBS e incubadas durante a noite a 37 graus e 5 por cento de CO2, após o que o os meios de cultura celular foram alterados para DMEM isento de soro. Em seguida, CPhGs (100 ug/ml, 50 ug/ml e 25 ug/ml), acteosídeo (6 ug/ml, 3 ug/ml e 1,5 ug/ml) e echinacoside (500 ug/ml, 250 ug /ml e 125 ug/ml) foram adicionados aos poços. Após 48 h de incubação com CPhGs ou composições monoméricas, o RNA total foi extraído com reagente TRIzol (Invitrogen, EUA) e agitado vigorosamente com clorofórmio por 15 s. Depois de ficar em temperatura ambiente por 3 min, o lisado foi centrifugado a 12,000 × g por 15 min a 4 graus. O RNA na fase aquosa foi precipitado com isopropanol e a fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo de microcentrífuga. O RNA foi precipitado pela adição de etanol a 0,75%, após o que o tubo de microcentrífuga foi centrifugado a 12,000 × g a 4 graus por não mais que 5 min. O sobrenadante foi removido e o RNA foi seco à temperatura ambiente por 5-10 min. Conjuntos específicos de primers (Sangon, Shanghai, China) que foram usados ​​para amplificação de actina de rato [GenBank: NM_031144.3],Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1] e NF- Os genes κB p65[GenBank: NM_199267.2] foram projetados usando Batch Primer 3. Os primers direto (FW) e reverso (RV) foram os seguintes: Colágeno I (FW: GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV: GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-κB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -actina (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Os resultados foram normalizados para o mRNA do gene housekeeping -actina como controle interno e são apresentados como níveis relativos de mRNA

As reações foram realizadas com 8 μL de IQ SYBR GreenSupermix, 1 μL de par de primers 10 pM, 8,5 μL de água destilada e 2,5 μL de cDNA. Cada reação em cadeia da polimerase foi realizada sob as seguintes condições: 95 graus por 3 min, depois 40 ciclos de 10 s a 95 graus, 30 s a 55 graus e 10 s a 55 graus – 95 graus para extensão, seguidos de medição de fluorescência única. Os resultados finais foram descritos com os valores relativos (2-ΔΔCt). O cálculo e a análise foram realizados pelo iQ5 Real-Time PCR Detection System.

Análise de Western Blot

Os níveis de expressão da proteína de colágeno I (Abcam, Cambridge, Reino Unido, Art No: ab34710) foram determinados por Westernblotting [com -actina (Lote: 60008-1-lg; Proteintech, China) como um controle de manutenção. Extratos de células inteiras foram preparados usando tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (Thermo Scientific, EUA) com coquetel de inibidor de Haltprotease a 1 por cento (Thermo Scientific, EUA) e coquetel de inibidor de fosfatase Halt a 1 por cento (Thermo Scientific, EUA). A concentração de proteína foi medida e quantificada pelo método de Bradford [18]. A proteína (10-50 ug) foi separada em um gel SDS-PAGE a 10 por cento e transferida para membranas de PVDF (Millipore, EUA). anticorpo, diluição 1:200 ou mAb de rato de -actina, diluição 1:5000) foram incubados a 4 graus durante a noite. O Alk-Phos correspondente. anticorpos secundários conjugados foram incubados à temperatura ambiente. Finalmente, as membranas foram lavadas três vezes com 1 × Tris-HClsaline com 0,1 por cento de Tween 20, e os sinais foram escaneados e visualizados pelo GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). A análise densitométrica foi realizada nas proteínas de interesse e normalizada para -actina pelo software GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -actina foi utilizada como controle interno.

Análise estatística

O teste de normalidade de Shapiro-Wilk e o teste de homogeneidade de variância de Levene foram aplicados para verificar a normalidade e homogeneidade de variância. A análise de variância (ANOVA) seguida do teste post hoc de Tukey foi utilizada para identificar diferenças estatísticas em dados não homogêneos com distribuição normal. O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi utilizado para analisar dados não distribuídos normalmente ou homogêneos. Os resultados foram expressos como média ± DP. A significância foi estabelecida em P < 0.05.="" todos="" os="" dados="" foram="" analisados="" ​​pelo="" software="" spss="" 16.0="" (xinjiang="" medical="">

Resultados

Determinação quantitativa de CPhGsCPhGs emCistanchetubulosacontém doisFeniletanoildoglicosídeos, echinacoside e acteoside, e seus conteúdos nos CPhGs foram determinados por análise de HPLC (Fig. 1) como 42,71 ± 0,42 por cento e 14,27 ± 0,18 por cento, respectivamente.

Índices de fígado e baço

Conforme mostrado na Tabela 1, os índices de fígado e baço do grupo modelo foram elevados significativamente [P < 0.01,p="">< 0,05].="" os="" índices="" de="" fígado="" e="" baço="" da="" droga="" positiva="" bjrg="" e="" cphgs="" em="" diferentes="" grupos="" de="" dose="" foram="" significativamente="" reduzidos="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" modelo="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024,PSpleen=0.070," respectivamente].="" os="" índices="" de="" fígado="" e="" baço="" foram="" inferiores="" aos="" do="" grupo="">

Efeitos dos CPhGs nas atividades de ALT, AST e marcadores de fibrose hepática

No presente estudo, os níveis séricos das enzimas hepáticas AST e ALT estavam significativamente aumentados no grupo modelo, refletindo danos hepatocelulares em ratos com fibrose hepática induzida por BSA. No entanto, os experimentos mostraram que o tratamento com BJRG (600 mg/kg) e CPhGs (125, 250 e 500 mg/kg) reduziu significativamente AST[PAST < 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" respectivamente]="" e="" alt="" [palt="0,117," palt="0,139," palt="0,189" ,="" níveis="" de="" palt="0.255," respectivamente]="" em="" ratos="" com="" fibrose="" hepática.="" (mesa="">

Os níveis de HA, LN, PC e IV-C em ratos modelo foram significativamente aumentados [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" respectivamente].="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" de="" modelos,="" os="" níveis="" de="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," respectivamente],="" ln),="" ln="" [pln="0.011," pln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," respectivamente),="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26]="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectivamente]="" e="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" respectivamente]="" em="" ratos="" foram="" marcadamente="" diminuídos="" por="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" e="" cphgs="" em="" diferentes="" grupos="" de="" dose="" (125,="" 250="" e="" 500="" mg/kg="" )="" (tabela="">

Conteúdo sensacional e TGF- 1

O conteúdo de colágeno também foi detectado medindo os níveis de Hyp no tecido do fígado. Conforme mostrado na Tabela 4, o nível médio de Hyp no grupo modelo foi significativamente maior do que o grupo normal, mas foi marcadamente diminuído no grupo BJRG e nos diferentes grupos de dosagem de CPhGs.

A concentração hepática de TGF{{0}} do grupo modelo em ratos foi significativamente aumentada [P < 0.001].="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" modelo,="" os="" níveis="" de="" tgf-="" 1="" da="" droga="" positiva="" e="" os="" diferentes="" grupos="" de="" dose="" de="" cphgs="" estavam="" marcadamente="" diminuídos="" [p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,p="" tgf{{10)="" }}="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" respectivamente].="" os="" resultados="" estão="" resumidos="" na="" tabela="">

Exame histopatológico

Observações de cortes de tecido hepático normal corados com H&E e tricrômio de Masson exibem lóbulos hepáticos e sinusóides hepáticos distintos. A estrutura do tecido hepático nos ratos modelo estava desordenada, e o tecido hepático e os sinusóides hepáticos foram substituídos por uma grande quantidade de tecido conjuntivo. No entanto, mais citoarquitetura normal e menos tecido conjuntivo foram detectados no grupo de tratamento do que no grupo modelo.

Coloração H&E

No grupo normal, observou-se integridade estrutural do lóbulo hepático sem áreas portais anormais e sinusóides hepáticos. Os cordões hepáticos estavam dispostos de forma ordenada, com o núcleo redondo e claro. Os núcleos estão localizados no centro da célula, com citoplasma abundante. Apenas a área portal apresenta uma pequena quantidade de tecido fibroso (Fig. 2a).

No grupo modelo, a estrutura lobular foi severamente danificada. As células hepáticas apresentaram degeneração aquosa leve, principalmente degeneração balonizante e/ou degeneração gordurosa. A formação de infiltração de células inflamatórias, hiperplasia extensa de tecido fibroso, a formação de grande número de septo fibroso, lóbulos divididos e proliferação significativa de células hepáticas também foram observadas. Essas observações confirmaram o sucesso do estabelecimento do modelo animal de lesão imune em ratos de fibrose hepática (Fig. 2b).

Comparado com o grupo modelo, houve redução da infiltração de células inflamatórias nos diferentes CPhGs. Também foram observadas menos necrose e degeneração gordurosa das células hepáticas, bem como alívio da fibrose. CPhGs atenuou significativamente a patologia da fibrose hepática induzida por BSA em ratos, aliviou o inchaço das células hepáticas e preveniu efetivamente a necrose de hepatócitos e a infiltração de células inflamatórias, sugerindo que o CPhGsex exerce um efeito protetor na fibrose hepática de rato induzida por BSA. (Fig. 2c–f).

Coloração tricrômica de Masson

No grupo normal, o tecido hepático era normal. A área portal hepática apresentava um pequeno número de fibras de colágeno azul, e o tecido hepático estava normalmente estruturado (Fig. 3a). Comparado com o tecido hepático do grupo normal, o tecido fibroso proliferou pelo folheto central e expandiu-se para o parênquima hepático. As fibras de colágeno se estendiam e se ligavam e envolviam todo o lóbulo e circundavam a veia central. Esses efeitos, juntamente com fibrose de hepatócitos, dano estrutural lobular, fibrose periportal e formação de pseudolóbulos (Fig. 3b) forneceram evidências de que o modelo foi estabelecido.

Em comparação com o grupo modelo, as fibras de colágeno no grupo controle positivo da droga foram levemente estendidas para fora da área portal periférica (Fig. 3c). Em comparação com o grupo modelo, as fibras de colágeno nos diferentes grupos de dosagem de CPhGs foram significativamente reduzidas, a proliferação de fibras foi inibida e a proliferação de tecido fibroso dentro do parênquima hepático foi significativamente reduzida. Esses resultados sugeriram que os CPhGs protegeram os ratos da fibrose hepática induzida pela BSA (Fig. 3d-f).

Coloração imuno-histoquímica

É importante ressaltar que a expressão de colágeno tipo I e colágeno tipo III desempenham papéis essenciais no desenvolvimento da fibrose hepática, e sua geração e deposição no tecido hepático podem servir como um importante determinante da eficácia anti-fibrose hepática. Os resultados estão resumidos na Tabela 5.

Colágeno tipo I

O grupo normal expressou colágeno tipo I principalmente nos vasos sanguíneos e na área portal. O grupo modelo expressou fibrose vascular de colágeno tipo I em áreas portais. No espaço de Disse, a coloração do colágeno tipo I foi observada como estrias ou distribuição irregular. Fibrousseptos envoltos em colágeno para formar pseudolóbulos. Nesses experimentos, menos septos fibrosos foram formados para BJRJ (600 mg/kg) e diferentes grupos de dose de CPhGs s (125, 250 e 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023 e PCol I=0.044, respectivamente]. Os resultados semiquantitativos revelaram que a expressão do colágeno tipo I foi significativamente menor em comparação com o grupo modelo (fig. 4).

Colágeno tipo III

O colágeno tipo III foi fracamente expresso no grupo normal, e as áreas periféricas ao redor das veias porta e hepática apresentaram pequena quantidade de fibras finas amarelas em vez de contínuas (Fig. 5a). No grupo modelo, as fibras de colágeno apresentaram cordões largos e espessos, indicando forte expressão, localizados principalmente nas áreas portal e de tecido fibroso (Fig. 5b).

As fibras de colágeno do BJRJ (600 mg/kg) e diferentes grupos de dosagem de CPhGs (125, 250 e 500 mg/kg) eram filamentosas e distribuídas ao redor da veia central e áreas portais. Em comparação com o grupo modelo, as fibras de colágeno foram significativamente reduzidas, a coloração era pálida e fina e a coloração imuno-histoquímica foi fracamente positiva (Fig. 5c–f). Esses resultados semiquantitativos mostram que as células expressas positivamente nos grupos de dose positiva e diferente [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 e PCol III=0.037, respectivamente] eram diferentes daqueles do grupo de modelos.

TGF- 1

Houve pouca expressão de TGIF- 1 em células hepáticas normais de ratos. A expressão foi limitada a um pequeno número de células intersticiais (Fig. 6a). No grupo modelo, a expressão de TGF- 1 foi amplamente distribuída na área portal, espaços fibrosos, células estreladas hepáticas, células inflamatórias, parede sinusoidal e citoplasma. Uma determinada área portal exibiu uma expressão fortemente positiva com coloração amarelo-acastanhada (Fig. 6b)

Houve pequena expressão na área portal e septos fibrosos do BJRJ (600 mg/kg) e diferentes grupos de dose de CPhGs (125, 250 e 500 mg/kg). A extensão da coloração positiva nesses grupos foi significativamente reduzida em comparação com a do grupo modelo. A coloração nas células intersticiais nos septos fibrosos e no citoplasma das células inflamatórias estava diminuída (Fig. 6c–f). Resultados semiquantitativos revelaram que BJRJ e diferentes grupos de dosagem de CPhGs [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0,001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0)." 004,="" respectivamente]="" foram="" significativos="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="">

Conforme mencionado anteriormente no artigo, o TGF- 1 é uma citocina importante na fisiopatologia da fibrose hepática, estimulando a produção de matriz extracelular [19]. Mostramos que o nível de TGF- 1 aumentou no grupo modelo de maneira consistente com a gravidade da fibrose hepática. Os níveis de expressão de TGF- 1 no fígado foram consistentes com os níveis séricos de TGF- 1. Isso indica que os CPhGs podem reduzir significativamente a fibrose hepática devido à expressão de TGF- 1 participando da síntese e degradação da MEC.

A expressão de colágeno tipo I, colágeno tipo III e TGF- 1 pode detectar o processo patológico da fibrose hepática. Seus níveis de expressão nos grupos de tratamento foram significativamente diminuídos e mostraram que os CPhGs podem melhorar a atividade da colagenase, mantendo o equilíbrio dinâmico da síntese e degradação da MEC hepática, retardando e prevenindo a formação de fibrose hepática.

Expressão de NF-κB p65 e colágeno I após intervenção medicamentosa em células HSC-T6

A fim de caracterizar os sinais de fibrose hepática, dois genes reguladores chave no fígado foram determinados por meio de ensaio de RT-PCR. Os dados mostraram que as células tHSC-T6 do grupo controle apresentaram níveis mais baixos de NF κB e mRNA de colágeno tipo I. Por outro lado, TGF- 1 induziu células HSC-T6 a regular positivamente NF-κB (P < 0.01)="" e="" col-i="" (p="">< 0,01)="" mrna,="" com="" níveis="" superiores="" a="" os="" do="" grupo="" controle.="" na="" presença="" de="" diferentes="" concentrações="" de="" cphgs,="" os="" resultados="" de="" nf-κb="" p65="" [p="" nf-κb="0.001" para="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-κb="0.002" para="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-κb="0.007" para="" 50="" ug/ml,="" e="" p="" nf-κb="0.012" para="" 25="" ug/ml,="" respectivamente]="" e="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," respectivamente]="" mostraram="" expressões="" reduzidas="" desses="" mrnas="" (="" fig.="">

Análise de Western blot do nível de colágeno I após intervenção medicamentosa em células HSC-T6

A Figura 8 mostra os níveis de expressão da proteína de colágeno I nas células HSC-T6 dos diferentes grupos experimentais. O nível de expressão da proteína de colágeno I foi significativamente diminuído nos vários grupos de dose de CPhGs (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, e 25 ug/ml) em comparação com o grupo TGF- 1.

Discussão

CPhGs é um glicosídeo feniletanoide isolado e purificado do rizoma de Cistanche, que é usado como um fitoterápico tradicional chinês. Nos últimos anos, foi demonstrado que CPhGs possui uma poderosa capacidade de prevenir lesões hepáticas [20]. Portanto, nosso objetivo foi investigar se CPhGs têm efeitos inibitórios na fibrose da hepatite por fibrose hepática induzida por BSA em ratos. BJRG é comumente usado como medicamento terapêutico para fibrose hepática na China. É feito de cascos de tartaruga. Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis, etc. têm os efeitos de reabastecer o Qi e o sangue, aliviando a fadiga, suavizando os nós. Além disso, estudos anteriores mostram que tem a função óbvia de bloquear a fibrose hepática precoce, inibir a proliferação de células armazenadoras de gordura e reduzir a síntese de colágeno [21]. Portanto, BJRG foi utilizado como droga positiva neste estudo.

As alterações patológicas da fibrose hepática em ratos induzidas por injeções de BSA são semelhantes às da cirrose portal humana [22]. Os CPhGs aliviaram de forma dose-dependente o grau de fibrose hepática e inibiram a transformação de HSC em células semelhantes a miofibroblastos, reduziram os níveis séricos elevados de ALT, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 e o índice hepático e suprimiram marcadamente a expressão de colágeno I, colágeno III e TGF- 1 no tecido hepático.

Os estágios da fibrose hepática estão correlacionados com os níveis séricos de HA, LN e IV-C, que como marcadores podem desempenhar um papel na detecção do grau de fibrose hepática [23]. Tem sido relatado que o HA é o principal recurso da matriz extracelular. IV-C como o elemento essencial da membrana basal será sintetizado abundantemente e depositado pesadamente nas fases iniciais da cirrose hepática. Os níveis séricos de LN e IV-C são os índices da taxa de renovação da membrana basal e mostram o grau de fibrose na área portal e capilares sinusoidais [24]. PC III é um marcador no diagnóstico de fibrose hepática e cirrose precoce, mas sua sensibilidade e especificidade não são altas, e não há diferença significativa entre os vários estágios da fibrose em muitas referências [24, 25]. Este estudo obteve resultado semelhante.

Além disso, as observações do corte corado com tricrômio de H&E e Masson exibem tecidos hepáticos normais com lóbulos hepáticos distintos e sinusóides hepáticos. A estrutura do tecido hepático no grupo modelo estava desordenada, e o tecido hepático e o sinusóide hepático foram substituídos por uma grande quantidade de tecido conjuntivo. No entanto, foi observada melhora significativa nos grupos de tratamento em comparação com o grupo modelo.

É importante ressaltar que a expressão do colágeno tipo I e do colágeno tipo III desempenham papéis essenciais no desenvolvimento da fibrose hepática, cujo bloqueio pode prevenir e tratar a fibrose hepática. Portanto, a geração e deposição no tecido hepático de colágeno tipo I e colágeno tipo III podem servir como um importante determinante da eficácia anti-fibrose hepática. O TGF- 1 também é uma importante citocina pró-fibrogênica na lesão hepática e é biologicamente ativo com múltiplas ações farmacológicas[26]. Um equilíbrio entre essas ações é necessário para manter a homeostase tecidual. A expressão aberrante de TGF 1 está envolvida na patogênese de doenças hepáticas [27, 28]. Sabe-se que TGF- 1 é uma citocina crucial que está envolvida nos estágios iniciais da fibrose hepática. Estresse oxidativo desencadeia TGF- 1, resultando neste último estimulando a produção e deposição de ECM [29]. Portanto, uma das estratégias eficazes para a produção de drogas anti-fibrose hepática é a identificação de agentes anti-TGF- 1. A análise imuno-histoquímica mostrou que as expressões de colágeno tipo I, colágeno tipo III e TGF- 1 puderam detectar o processo patológico da fibrose hepática. As expressões do colágeno tipo I, colágeno tipo III e TGF- 1 nos grupos de tratamento estão diminuídas, que foram significativamente menores no grupo de tratamento com altas doses de CPhGs em particular, e sugeriu que CPhGs é um colágeno tipo I eficaz, colágeno tipo III , e inibidor de TGF- 1. Presumivelmente, os CPhGs podem melhorar a atividade da colagenase, mantendo o equilíbrio dinâmico da síntese e degradação da MEC, retardando e prevenindo a formação de fibrose hepática.

Os CPhGs não só podem melhorar a fibrose hepática induzida por BSA em ratos, mas também podem estar associados à inibição da ativação de HSC in vitro. Acredita-se que a ativação de HSC represente o passo crucial da fibrogênese. Neste estudo, os resultados ilustraram que a administração de CPhGs de 25 a 100 ug/ml atenuou notavelmente a diminuição de NF-κB p65, expressão de mRNA de colágeno I e expressão de proteína de colágeno I em HSC.

O NF-κB desempenha um papel importante na modulação da resposta imune à infecção ou estímulos [30]. O acúmulo de NF-κB nas células hepáticas pode resultar no recrutamento de citocinas/mediadores inflamatórios, induzindo assim o desenvolvimento de fibrose [31, 32]. Além disso, o colágeno também é um índice sensível que reflete o nível de fibrose e representa cerca de 50% da proteína total no fígado fibroso [33]. Como resultado, postulamos que o mecanismo molecular contra a fibrose hepática está ligado à inativação da expressão de NF-κB mediada por CPhGs, cujo benefício contribui para papéis sinérgicos de atenuar a imunotoxicidade e o estresse inflamatório no tecido hepático lesionado com BSA, corrigindo ainda mais o dismetabolismo para melhorar as funções hepáticas.

Conclusões

Em conclusão, nossos estudos indicam que CPhGs atenuam significativamente a extensão da fibrose hepática induzida por BSA em ratos. Seu mecanismo pode ser pelo menos parcialmente devido ao efeito inibitório dos CPhGs na composição da MEC e estimulação da degradação da MEC e/ou pela inibição direta da síntese de colágeno tipo I, colágeno tipo III e a expressão de TGF{{0 }}. Portanto, esperávamos que os CPhGs pudessem ser usados ​​em produtos de saúde ou em medicamentos clínicos para a prevenção da fibrose hepática humana. Estudos futuros são necessários para estabelecer a eficácia dos CPhGs como um potente fármaco anti-fibrose hepática.

Abreviaturas

CPhGs: glicosídeos de anol de cistancha;

BSA: albumina de soro bovino;

HSC-T6: Células estreladas hepáticas;

Hip: Hidroxiprolina;

BJRG: Comprimidos de Biejiaragangan;

TGF- 1: fator de crescimento transformador 1;

ALT: Alaninaaminotransferase;

AST: Aspartato aminotransferase;

HA: Ácido hialurônico;

LN: Laminina; PC III: Procolágeno tipo III;

IV-C: colágeno tipo IV;

NF-κB: Intensificador de cadeia leve de fator nuclear kappa de células B ativadas;

RT-PCR: Reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa;

SDS-PAGE: Eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida.

Interesses competitivos

Os autores declaram não ter interesses conflitantes

Contribuições dos autores

TL, JZ, SPY, LM, MT e SLZ conceberam e projetaram os experimentos. SPY, TL e JZ analisaram os dados. SPY e JZ escreveram o manuscrito. TL,LM e JZ revisaram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Reconhecimento

Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81260624). Os autores gostariam de expressar seus sinceros agradecimentos ao Professor Tao Liu pelas melhorias sugeridas para a redação deste artigo.

Detalhes do autor

1Departamento de Toxicologia, Escola de Saúde Pública, Xinjiang Medical University, No. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011Xinjiang Uyghur AutonomousRegion, China. 2Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of MateriaMedica of Xinjiang, Urumqi 830004, China. 3Nº 140 Xinhua South Road, Tianshan District, Urumqi 830000Xinjiang Uyghur Região Autônoma, China.

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