Descobertas preliminares de citocinas plasmáticas inflamatórias elevadas em crianças com autismo que apresentam sintomas gastrointestinais comórbidos, parte 1

Abstrato:

O transtorno do espectro do autismo (AU) está presente em aproximadamente 2% da população e está frequentemente associado a comorbidades que podem afetar a qualidade de vida. Uma das comorbidades mais comuns no autismo é a presença de sintomas gastrointestinais (GI) que consistem em hábitos intestinais irregulares, como constipação, diarreia ou hábitos intestinais alternados.

Nos últimos anos, com o aprofundamento das pesquisas sobre o transtorno do espectro do autismo (TEA), mais e mais pessoas começaram a prestar atenção na relação entre TEA e imunidade. Embora os resultados da pesquisa atual não sejam completamente consistentes, a maioria dos estudos mostrou que existe de fato uma ligação entre TEA e imunidade.

Primeiro, muitas crianças nascem com baixa imunidade, o que pode aumentar o risco de desenvolver TEA. Em segundo lugar, mais e mais estudos mostraram que existem anormalidades no sistema imunológico de pacientes com TEA. Por exemplo, eles podem ter reações alérgicas, doenças autoimunes, etc. Além disso, alguns estudos descobriram que pacientes com TEA têm níveis mais altos de estresse oxidativo, o que pode levar a danos celulares e neurodegeneração.

No entanto, não devemos ignorar os aspectos positivos de viver com TEA. Pessoas com TEA podem ter imunidade mais forte. Estudos mostraram que seus sistemas imunológicos podem ser melhores para lidar com algumas invasões bacterianas e virais. Além disso, os pacientes com TEA também podem ter mais células imunológicas, e seus sistemas imunológicos podem ser mais estáveis ​​e menos propensos a reações exageradas.

No geral, a relação entre TEA e imunidade é complexa e não apenas positiva ou negativa. Esta questão deve ser explorada em profundidade por meio de pesquisas mais rigorosas no futuro. Independentemente disso, todos devemos ser proativos em relação ao TEA e trabalhar com pessoas com TEA e suas famílias para que possam se ajustar melhor à sociedade. Desse ponto de vista, precisamos melhorar nossa imunidade. Cistanche pode melhorar significativamente a imunidade, porque as cinzas da carne contêm uma variedade de componentes biologicamente ativos, como polissacarídeos, cogumelos e Huang Li. Esses componentes podem estimular várias células do sistema imunológico e aumentar sua atividade imunológica.

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Evidências de infiltração imune e ativação imune foram mostradas no íleo e no cólon de crianças com AU com sintomas gastrointestinais. Além disso, a disfunção imunológica é um fator contribuinte em muitas doenças gastrointestinais, e levantamos a hipótese de que seria mais aparente em crianças com AU que apresentam sintomas gastrointestinais do que naquelas que não apresentam sintomas gastrointestinais.

Este estudo preliminar teve como objetivo determinar se há níveis alterados de citocinas no plasma em crianças com AU com sintomas gastrointestinais em comparação com crianças com AU sem sintomas gastrointestinais, crianças com desenvolvimento típico (DT) com sintomas gastrointestinais e crianças com DT sem sintomas gastrointestinais, do mesmo coorte de base populacional. Os níveis de citocinas plasmáticas foram avaliados por ensaios multiplex.

Não foram observadas diferenças nas citocinas plasmáticas nos controles TD com ou sem sintomas gastrointestinais; no entanto, muitas citocinas inatas (IL-1 , TNF , GM-CSF, IFN ) e adaptativas (IL-4, IL-13, IL-12p70) estavam aumentadas na AU crianças com sintomas gastrointestinais em comparação com crianças com AU sem sintomas gastrointestinais. A citocina IL-15 relevante para a mucosa foi aumentada na AU com sintomas gastrointestinais em comparação com todos os grupos.

Em contraste, a citocina reguladora IL-10 foi reduzida na AU com sintomas gastrointestinais e pode sugerir um desequilíbrio nos sinais pró-inflamatórios/regulatórios. Esses dados sugerem que crianças com sintomas de AU e GI têm um desequilíbrio em sua resposta imune que é evidente em seus níveis de citocinas plasmáticas circulantes. Uma descoberta que poderia apontar para potenciais estratégias terapêuticas e/ou de monitoramento para problemas gastrointestinais na AU.

Palavras-chave:
autismo; TEA; imune; inflamação; gastrointestinal; comorbidades; citocinas; regulamento; esquizofrenia; tolerância; imunidade inata; imunidade adaptativa; imunidade da mucosa.

1. Introdução

Distúrbios do neurodesenvolvimento, como o transtorno do espectro do autismo (AU), estão aumentando rapidamente em prevalência em todo o mundo. Sua etiologia é amplamente desconhecida, mas, na maioria dos casos, provavelmente devido a uma combinação de fatores genéticos e ambientais. O diagnóstico de AU está atualmente confinado a traços comportamentais, incluindo comportamentos repetitivos e estereotipados e deficiências na comunicação e interação social.

No entanto, muitos indivíduos com AU também sofrem de uma ou mais comorbidades médicas, incluindo disfunção gastrointestinal (GI) [1-7]. o mais comum [9-11].

Em nosso grande estudo de coorte de 1.000 participantes, as crianças com AU tinham 6 a 8 vezes mais chances de sofrer de sintomas gastrointestinais em comparação com crianças com desenvolvimento típico da mesma idade; além disso, os sintomas gastrointestinais foram associados a pontuações de avaliação comportamental mais baixas [12].

Apesar dos relatos frequentes de disfunção GI na AU, falta encaminhamento para clínicas especializadas ou tratamento adequado dos sintomas GI. A ausência de estudos sobre assinaturas biológicas em comorbidades AU também dificultou estratégias que poderiam ajudar a aliviar problemas gastrointestinais.
As células imunes da mucosa compreendem aproximadamente 70% das células imunes do corpo, e a disfunção dessas células pode ter consequências adversas para a função gastrointestinal. A imunidade alterada da mucosa pode afetar a função da barreira epitelial do hospedeiro, a diversidade de bactérias comensais no intestino e o sistema nervoso entérico [3].

Muitos relatórios descreveram anormalidades imunológicas na AU, incluindo alterações na genética imune, produção distorcida de citocinas, função alterada das células T e respostas imunes inatas aumentadas [13-16]. Além disso, a ativação imune foi relatada em quase dois terços das crianças com AU e está associada a comportamentos mais graves [13]. Análises endoscópicas de crianças AU com sintomas gastrointestinais revelaram a presença de uma inflamação sutil e difusa do trato intestinal (revisado em [1,4]).

No entanto, a natureza precisa dessa inflamação tem sido debatida e atualmente não está clara. Histologia, imuno-histoquímica e evidências de citometria de fluxo mostraram consistentemente infiltração pan-entérica de células imunes, como linfócitos, monócitos, células natural killer (NK) e eosinófilos nas paredes do trato GI em crianças com AU, em comparação com crianças com desenvolvimento típico. DT) crianças com sintomas gastrointestinais [9,17-21].

Esses relatórios mostraram que em crianças com sintomas de AU e GI, há infiltrados aumentados de células imunes no cólon, íleo, duodeno e estômago. Além disso, os linfócitos infiltrados exibem um fenótipo pró-inflamatório marcado - com células CD3 mais IL-6 mais aumentadas, células CD3 mais TNF mais e células regulatórias CD3 mais IL-10 mais reduzidas em crianças com AU e sintomas gastrointestinais em comparação com os controles [17,18].

A comparação da produção intracelular de citocinas pré e pós-desafio imunológico em células T periféricas revelou um perfil semelhante com aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias, mas diminuição da regulação em crianças com AU que apresentavam sintomas gastrointestinais em comparação com controles [22].

As respostas de citocinas estimuladas observadas em crianças com AU e sintomas gastrointestinais foram diferentes das crianças com AU sem sintomas gastrointestinais, bem como crianças de controle TD e sugerem que a produção de citocinas após o desafio imunológico pode ser única em crianças com AU e sintomas gastrointestinais.

Os perfis imunológicos em crianças com AU e sintomas gastrointestinais também foram diferentes de crianças com doenças inflamatórias intestinais (DII), como doença de Crohn, doença celíaca e colite ulcerativa [9,17–19,21]. Achados semelhantes de aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias após estimulação, IL-1 , IL-6 e TNF , foram demonstrados em crianças com AU e sensibilidade alimentar em comparação com controles [23,24].

A busca por assinaturas biológicas ou biomarcadores no autismo tem sido até agora uma área pouco estudada. Indiscutivelmente, a maior utilidade das assinaturas biológicas no contexto da AU não será na determinação dos sintomas centrais, mas nas comorbidades associadas. Essas comorbidades geralmente têm efeitos profundos na gravidade dos sintomas ou comportamentos associados, como sono, irritabilidade, agressividade ou ansiedade [3].

Algumas citocinas plasmáticas ou mediadores imunológicos foram investigados quanto ao seu potencial como biomarcadores, principalmente no contexto da gravidade da AU [14,25–27]. Faltam marcadores plasmáticos que possam ajudar a identificar ou rastrear a trajetória dos sintomas gastrointestinais na AU. No presente estudo, procuramos caracterizar os perfis de citocinas plasmáticas em crianças com AU com ou sem sintomas gastrointestinais a partir de uma amostragem aleatória de um estudo caso-controle de base populacional.

2. Materiais e métodos

Este estudo incluiu 79 participantes que foram inscritos no estudo CHARGE (Risco de Autismo Infantil de Genética e Ambiente), um estudo de caso-controle de base populacional em andamento [28]. Resumidamente, os participantes do estudo CHARGE foram selecionados a partir de 2 estratos: transtornos do autismo (AU) e controles da população em geral com desenvolvimento típico (TD).

As crianças elegíveis tinham entre 24 e 60 meses de idade, nascidas na Califórnia, morando com pelo menos um dos pais biológicos que falava inglês ou espanhol e residiam nas áreas de influência de uma lista específica de centros regionais na Califórnia. As crianças com AU foram identificadas por meio de centros regionais, provedores/clínicas, auto-encaminhamento e contato com o público em geral.

As crianças com DT foram identificadas nos arquivos de nascimento do estado e uma amostra aleatória estratificada foi gerada por correspondência de frequência para uma distribuição projetada de casos de AU em idade, sexo e área de abrangência. Crianças com deficiências motoras e sensoriais importantes (por exemplo, cegueira e surdez) que impediriam uma avaliação válida do desenvolvimento foram excluídas.

O protocolo do estudo CHARGE foi aprovado pelos comitês de revisão institucional da Universidade da Califórnia em Davis e pelo Comitê do Estado da Califórnia para a Proteção de Seres Humanos. O consentimento informado por escrito foi obtido antes da participação.

Para este estudo, 40 casos com AU e 40 controles de DT foram selecionados aleatoriamente de um grupo de participantes do estudo CHARGE matriculados entre abril de 2003 e abril de 2008, forneceram uma amostra de sangue, preencheram um questionário de histórico gastrointestinal e tiveram um diagnóstico confirmado de AU ou DT. Casos e controles foram pareados quanto à idade na coleta de sangue (em intervalos de 3-meses) e se apresentavam ou não sintomas gastrointestinais frequentes de movimentos intestinais irregulares (definidos como diarreia ou constipação frequentes nos últimos 3 meses).

O objetivo inicial do estudo era ter 20 casos e 20 controles com sintomas gastrointestinais frequentes, bem como 20 casos e 20 controles sem sintomas gastrointestinais frequentes. Como na época do estudo, apenas 9 controles em todo o estudo CHARGE apresentavam sintomas gastrointestinais frequentes, casos e controles foram pareados apenas pela idade na coleta de sangue.

A amostra final de 80 crianças compreendeu 20 casos (média de idade 41,7 ± 9,6 meses; 16 meninos) e 9 controles (média de idade 41,6 ± 9,1 meses; 7 meninos) com sintomas gastrointestinais frequentes e 20 casos (média de idade 41,9 ± 9,3 meses; 19 homens) e 31 controles (idade média 42,2 ± 9,3 meses; 26 homens) sem sintomas gastrointestinais frequentes. Como esta foi uma amostragem aleatória, não excluímos com base no uso de medicamentos.

Poucas crianças tomavam medicamentos no momento da coleta de sangue: estes incluíam antimicrobianos como aciclovir, cetoconazol (2 casos com sintomas gastrointestinais e 2 casos e 2 controles sem sintomas gastrointestinais), esteroides como inaladores para asma, Nasonex (2 casos e 1 controle com sintomas gastrointestinais e 1 caso e 1 controle sem sintomas gastrointestinais) e medicamentos relacionados a gastrointestinais, como Miralax, Nexium, leite de magnésia (2 casos e 3 controles com sintomas gastrointestinais).

Nenhum dos participantes estava tomando medicamentos antipsicóticos. Não encontramos efeitos de medicamentos nos dados quando analisados ​​em conjunto (tratados vs. não tratados, dentro de grupos) ou para medicamentos individuais.

O diagnóstico de autismo foi confirmado usando avaliações padrão-ouro: Autism Diagnostic Interview-Revised (ADI-R; [29]) e Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS; [30]). Os controles foram rastreados para AU usando o Questionário de Comunicação Social (SCQ; [31]) e nenhum pontuou acima do ponto de corte (SCQ maior ou igual a 15).
As Escalas Mullen de Aprendizagem Precoce (MSEL; [32]) e as Escalas de Comportamento Adaptativo de Vineland (VABS; [33]) foram administradas a casos e controles para determinar o desenvolvimento cognitivo e adaptativo, respectivamente. O desenvolvimento típico nos controles foi definido como tendo escores compostos de Maior ou igual a 70 em ambas as avaliações e nenhum diagnóstico prévio de atraso no desenvolvimento.

Todos os médicos do Instituto MIND (Investigação Médica de Distúrbios do Neurodesenvolvimento) da UC Davis obtiveram confiabilidade de pesquisa nas avaliações de desenvolvimento que administraram (ADI-R, ADOS, MSEL e VABS). A equipe bilíngue do estudo estava disponível para administrar o consentimento informado e todos os instrumentos/questionários em espanhol.

2.1. Coleta de sangue e análise de citocinas
Sangue periférico foi coletado de cada indivíduo em ácido-citrato dextrose Vacutainers (BD Biosciences; San Jose, CA, EUA). O sangue foi centrifugado a 2100 rpm por 10 min, o plasma foi então colhido e armazenado a -80 ◦C antes das análises de citocinas. As concentrações de citocinas no plasma dos participantes foram determinadas por um ensaio de multiplexação de imunoensaios (Millipore, Billerica, MA, EUA). As amostras e controles de referência foram executados de acordo com o protocolo do fabricante.

Resumidamente, 25 µl de amostra de plasma foram incubados com grânulos fluorescentes acoplados a anticorpos, depois lavados e incubados com anticorpos de detecção biotinilados seguidos por estreptavidina-ficoeritrina. As esferas foram então analisadas usando um sistema de matriz de suspensão Luminex™ 100 baseado em fluxo (Bio-Plex 200; BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). As curvas padrão foram geradas pelo software Bio-plex Manager para determinar a concentração desconhecida da amostra. Todas as amostras e citocinas de referência foram preparadas de acordo com a recomendação do fabricante e os níveis de citocinas e quimiocinas foram avaliados por análise multiplex Luminex™.

Os valores das amostras são expressos em pg/mL. As citocinas/quimiocinas analisadas foram interleucina (IL){{0}} , IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL{ {5}}, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL{{10}} (p4{{48} }), IL-12 (p7{{50}}), IL-13, IL-15, IL-17, estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos fator (GM-CSF), fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), interferon-gama (IFN ), IFN- 2, fator de necrose tumoral alfa (TNF ), TNF , eotaxina, proteína quimiotática de monócitos (MCP )-1, proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1 , MIP-1 e proteína induzida por interferon-gama de 10 kDa (IP-10), o os limites mínimos de detecção para essas citocinas/quimiocinas foram 2,4, 0,3, 1,2, 1,3, 2,2, {{60}},2, 1,1, 2,4, 0,9, 0.3, 34.9, 0.8, 1.0, 0.8, 0.4, 5.0, 0.9, 0.5, 0.4, 1.5, 0.9, 5., 1.8, 5, 10 ,7 e 3,6 pg/mL, respectivamente.

As concentrações obtidas abaixo do limite de detecção (LOD) do método foram calculadas como metade do limite de detecção (LOD/2) para comparações estatísticas. Os valores obtidos na leitura das amostras que excederam o limite superior do método de sensibilidade foram posteriormente diluídos e as concentrações de citocinas calculadas de acordo.

As variações intra e inter-placa/ensaio dos níveis de citocinas, usando amostras representativas executadas em todas as placas, foram inferiores a 5 por cento. As alíquotas de plasma não haviam passado por nenhum ciclo anterior de congelamento/descongelamento. O analista de citocinas desconhecia o status de caso ou controle de cada amostra.

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