Potenciais biomarcadores lacrimais para o diagnóstico da doença de Parkinson - um estudo pilotoⅡ
Mar 02, 2023
3. Resultados
3.1. Pacientes e Parâmetros Clínicos
Entre março de 2019 e outubro de 2019, 24 pacientes com iPD, três portadores sintomáticos da mutação E46K-SNCA e 27 indivíduos com TC foram incluídos neste estudo piloto, cujas características gerais são apresentadas na Tabela 1. A duração média da doença dos pacientes com DP foi 9,36 anos, e apresentavam incapacidade motora bilateral leve (escore UPDRS) e escores de Hoehn e Yahr que sugeriam comprometimento motor leve a moderado. Uma característica dos pacientes com DPI era que 40% deles apresentavam blefarite leve a moderada.
3.2. Dados de nLC MS/MS Um total de 560 proteínas lacrimais foram identificadas nas amostras analisadas aqui, por estudos proteômicos anteriores em lágrimas, e várias alterações de proteoma lacrimal específicas do grupo foram evidentes nos pacientes com DP em relação aos CTs. Proteínas com abundância diferente com estudos proteômicos anteriores em lágrimas, e várias alterações de proteoma lacrimal específicas do grupo foram evidentes nos pacientes com DP em relação aos CTs. Proteínas com diferentes abundâncias foram detectadas em ambos os grupos, embora a maioria das proteínas desreguladas no proteoma lacrimal de pacientes com DP estivessem superexpressas. Uma análise da rede STRING PPI foi realizada para avaliar as interações entre as proteínas que diferiram significativamente nos pacientes com DP e CTs (Figura 1). As proteínas que foram superexpressas em pacientes com DP foram implicadas em interações significativamente maiores do que o esperado, indicando que os aumentos nessas proteínas têm alguma conexão biológica (Figura 1A). No entanto, relações mais fracas foram observadas entre as proteínas que foram reguladas negativamente, representando um cluster diferenciado (Figura 1B). A maioria das proteínas expressas diferencialmente pode ser localizada nos compartimentos extracelular ou intracelular.
Para entender melhor o papel potencial das proteínas diferencialmente expressas em um contexto biológico, análises de anotação funcional foram realizadas com diferentes termos de ontologia gênica (GO). Como resultado, proteínas desreguladas foram vistas como envolvidas em diferentes processos biológicos (Figura 2): a resposta imune (lipocalina 2—LCN 2, serpina B3—SPB3, peptídeo secretado por células dendríticas foliculares—FDSCP, caderina—MFGM e gelatinase de neutrófilos- lipocalina associada - NGAL); apoptose (olfactomedin-4—OLFM4, caspase-14—CASPE e gama-glutamil ciclotransferase—GGCT); inflamação (Calprotectin-S100A8, S100A9); degradação do colágeno (mieloblástico—PRTN3 e metaloproteinase 9—MMP9); síntese proteica (ribonucleoproteína nuclear heterogênea A3—ROA3); diferenciação de queratinócitos (proteína 5 semelhante a calmodulina - CALML5); transporte lipídico (apolipoproteína D—APOD, apolipoproteína A2—APOA2 e proteína relacionada à lipoproteína de baixa densidade 2—LRP2); e defesa (mieloperoxidase—MPO, defensina alfa 3—DEFA 3, glutationa peroxidase 3—GPX3, quitinase-3-like protein 2—CH3L2 e lisozima C—LYSC).
Se os pacientes com DP fossem considerados todos juntos e separadamente como pacientes com iPD e pacientes com a mutação E46K-SNCA, as proteínas lacrimais reguladas positivamente eram evidentes em todos esses três grupos, com sua expressão variando em cada um (Figura 3). Deve-se notar que apenas três pacientes portadores da mutação E46K-SNCA foram estudados, e a dispersão dos dados a partir deles foi maior. As mesmas proteínas foram mais fortemente expressas nas lágrimas de pacientes com a mutação E46K-SNCA do que nas lágrimas de pacientes com iPD. Todas essas comparações foram feitas nos valores relativos aos das amostras de lágrima CT.
A Tabela 2 mostra as proteínas que foram suprarreguladas (vezes > 1,5) e infrarreguladas (vezes < 0,5) no grupo de DPI com blefarite quando comparadas com pacientes com DPI sem blefarite. Os pacientes com a mutação E46K-SNCA não desenvolveram blefarite.
Dentre as proteínas lacrimais desreguladas em pacientes com DP, destacou-se um grupo de seis proteínas, cinco das quais superexpressas no grupo DP em relação às CTs (pré-lamina A/C—LMNA, catepsina D—CATD, ceramidase ácida—ASAH1, retículo ATPase—TERA e dineína citoplasmática 1—DYHC1), enquanto um deles foi regulado negativamente (tripeptidil-peptidase 1—TPP1: Tabela 3). Essas proteínas foram associadas a processos neurodegenerativos, principalmente alterações na autofagia lisossômica, apoptose, transporte axonal retrógrado e processos desmielinizantes. Foi interessante notar a relação dessas proteínas com alterações na função lisossômica. Das seis proteínas, três apresentaram boa capacidade de classificar corretamente pacientes com DP e CTs, conforme refletido pelos valores de AUC das curvas ROC, e estavam relacionadas a alterações na função lisossômica: CATD, ASAH1 e DYHC1.
A análise de regressão logística univariada identificou quatro variáveis com significância estatística em=0,05: a idade dos pacientes e a alteração da dobra nas proteínas CATD, ASAH1 e DYHC1 (Tabela 4).
Além disso, as proteínas LMNA e DYHC1 mostraram ter significância estatística em=0.1. Um modelo de regressão logística multivariada foi estabelecido considerando idade e proteínas com qualquer nível de significância. Enquanto o modelo geral só mostrou significância no caso da proteína CATD (Tabela 5), o modelo provavelmente foi afetado pelo pequeno número de amostras disponíveis, e aumentar o número de amostras estudadas pode identificar outras variáveis significativas.
4. Discussão
O presente estudo foi realizado para analisar proteínas por cromatografia nanolíquida–espectrometria de massa (nLC–MS/MS) e selecionar aquelas relacionadas a doenças neurodegenerativas que tiveram maior poder discriminatório entre os grupos DP e CT estudados. Várias buscas por biomarcadores candidatos nas lágrimas de pacientes com DP foram realizadas nos últimos anos; no entanto, a conclusão foi que mais estudos de validação eram necessários para encontrar o melhor candidato a biomarcador diagnóstico ou prognóstico para essa patologia. Atualmente, o diagnóstico da DP é baseado na presença de sintomas motores e não motores, incluindo distúrbios do sono ou déficits olfativos. Os sintomas motores aparecem principalmente quando a perda de neurônios dopaminérgicos atinge cerca de 50 a 60 por cento.
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Portanto, o diagnóstico precoce abrirá caminho para modificar o curso da doença e, espera-se, retardar a grave incapacidade causada por essa patologia. Esta questão tornou-se um aspecto fundamental na investigação da DP, embora a falta de biomarcadores válidos represente um grande obstáculo que impede a identificação de doentes em fases pré-clínicas ou prodrômicas, bem como a monitorização da evolução da doença e dos efeitos dos tratamentos.
Por esse motivo, o presente estudo se propôs a buscar um biomarcador confiável da DP em um fluido não invasivo, como a lágrima. O olho possui muitos elementos neurais e vasculares que também são encontrados no cérebro, tornando-o ideal para a descoberta de novos biomarcadores que possam ser usados para diagnosticar a DP ou outras doenças neurodegenerativas, bem como na descoberta de novos alvos terapêuticos. Aqui, lágrimas de pacientes com DP e TC foram obtidas através de capilares de vidro sem anestesia prévia e sem tocar na superfície ocular. Estudos piloto anteriores sobre lágrimas de pacientes foram realizados com um grupo de lágrimas de pacientes [19], e nossa análise é a primeira análise de lágrima individual que permitirá a identificação de marcadores individuais específicos. Ao usar capilares para obter as amostras de lágrima, evitamos tocar no epitélio conjuntival, discriminando as proteínas encontradas na lágrima das proteínas conjuntivais, como ocorre com o uso de tiras de Schirmer. Em nosso estudo, encontramos proteínas significativamente desreguladas em pacientes com DP.
Essas proteínas estão envolvidas principalmente em processos inflamatórios e neurodegenerativos, apoptose e respostas imunes. A inflamação é onipresente em doenças neurodegenerativas, incluindo a DP, e estudos recentes identificaram que epítopos de células T derivadas de sin-sin são preferencialmente reconhecidos em pacientes com DP, bem como células T em regiões-alvo da DP, possivelmente sugerindo um componente autoimune da DP [20 ]. Acreditava-se que os neurônios estivessem protegidos do ataque autoimune, mas os neurônios dopaminérgicos são vulneráveis porque possuem proteínas em sua superfície celular que ajudam o sistema imunológico a reconhecer substâncias estranhas [21]. As células T podem potencialmente confundir neurônios danificados por doenças com substâncias estranhas e, como resultado, Sulzer et al. propuseram um modelo no qual as células T -syn-específicas causam morte neuronal em doenças neurodegenerativas associadas ao dobramento incorreto específico dessa proteína. Em nosso estudo, grupos de proteínas desreguladas relacionadas à resposta imune, como LCN2, SPB3 e FDSCP, entre outras, foram observados em amostras de lágrimas. No entanto, algumas imunoglobulinas envolvidas na resposta imune, como a IgA2, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre o grupo DP e o grupo CT.
Mais estudos são necessários para elucidar se essa relação entre a resposta imune e as proteínas encontradas nas lágrimas está diretamente relacionada à DP. A neuroinflamação pode ser definida como um evento inflamatório não específico no cérebro, e todo o SNC possui um componente neuroinflamatório, que é evidente em doenças como Esclerose Múltipla (EM), aneurismas cerebrais e acidentes vasculares cerebrais, epilepsia, DA e DP e em que a atividade de enzimas degradadoras da matriz extracelular (ECM) ou metaloproteases (MMPs) foi implicada. As MMPs participam de muitos processos fisiológicos e patológicos no cérebro e no sangue. A barreira hematoencefálica (BHE) é formada pelos capilares endoteliais que separam o suprimento sanguíneo para o cérebro, e sua função reside em três estruturas que são críticas para sua integridade: as células endoteliais dos capilares cerebrais, as junções apertadas (TJs ) entre essas células e a membrana basal. O endotélio é uma barreira para pequenos compostos hidrofílicos, pois os TJs selam as lacunas entre as células endoteliais adjacentes, impedindo a passagem descontrolada de solutos entre essas células e convertendo o endotélio cerebral em uma barreira relativamente impermeável [22,23].
No entanto, a membrana basal conecta essas células endoteliais aos pericitos e astrócitos para formar a unidade neurovascular que facilita a comunicação entre as células. Essa membrana é fundamental para o bom funcionamento da BHE e, como tal, para a homeostase do cérebro e sua saúde geral. Foi proposto que as MMPs perturbam especificamente as TJs e digerem a membrana basal do endotélio, contribuindo assim para certas doenças cerebrais [24]. Embora seja tecnicamente difícil demonstrar a atividade de MMP in vivo, uma atividade mais forte de MMP foi associada a uma maior permeabilidade da BHE após um acidente vascular cerebral e durante a reperfusão in vivo [25]. Um aumento na atividade e mRNA de MMP-2 e MMP-9 foi descrito após a reperfusão em ratos hipertensos com oclusão da artéria cerebral medial (MCAO) [26]. Além disso, o vazamento de BBB também foi detectado no córtex piriforme desses ratos, em conjunto com a ruptura das TJs, indicando que essas MMPs alteram a integridade da BBB degradando as proteínas TJ [26]. Como tal, e apesar dos desafios técnicos, há alguma evidência de que as MMPs digerem as proteínas TJ e ECM in vivo.
A expressão e a atividade de MMP-1, -2 e -9 foram determinadas em tecido cerebral pós-morte de pacientes com DP e, embora nenhuma alteração tenha sido observada em MMP-1 e MMP -9 em relação aos controles da mesma idade, uma redução de 50% na atividade de MMP-2 foi evidente no SN dos pacientes com DP [27]. Foi proposto que a atividade mais fraca da MMP 2 poderia ajudar os neurônios dopaminérgicos e seus neuritos a sobreviver no SN [27]. Além disso, MMP-3 também foi estudado sobre PD, o que poderia estar implicado na clivagem de -syn. MMP-3 cliva purificado -syn in vitro e a agregação de -syn aumenta na presença de MMP-3 agregados que seriam particularmente prejudiciais para células dopaminérgicas na DP. Significativamente, MMP-1, -2 e -9, e MT1-MMP também clivam -syn purificado, embora menos eficientemente que MMP-3 [28]. MMP-3 parece estar envolvido na neurodegeneração dopaminérgica, neuroinflamação e integridade da BHE na DP; no entanto, mais estudos serão necessários para esclarecer o papel de todas essas MMPs na DP e se sua inibição específica pode representar uma estratégia terapêutica válida. Aqui, os níveis de MMP-9 foram maiores na lágrima de pacientes com DP, tanto pacientes com iPD (2.8-vezes) quanto aqueles que carregam a mutação E46K-SNCA (3-vezes).
Os últimos pacientes com DP não desenvolveram blefarite, sugerindo assim que o aumento nas concentrações de MMP-9 não está tão fortemente associado à blefarite quanto à patologia da DP. No entanto, analisando os grupos de iPD separadamente, vemos que há uma superexpressão de MMP-9 mais forte em pacientes com DPI com blefarite, 3,08 vezes maior que em pacientes com DPI sem blefarite. Estudamos previamente a contribuição desta MMP para a rotura em pacientes com patologias da superfície ocular [29,30]. No entanto, mais estudos serão necessários para determinar se o aumento de MMP-9 está diretamente relacionado à DP ou a patologias da superfície ocular que podem alterar a análise lacrimal.
Evidências estão se acumulando sobre o importante papel do metabolismo energético em doenças neurodegenerativas, incluindo a DP. Frações lipídicas anormais e peroxidação lipídica foram avaliadas em pacientes com DP [31] e, como resultado, as frações lipídicas foram propostas como possíveis biomarcadores protetores da DP. Estudos epidemiológicos recentes em uma coorte prospectiva ou com desenhos de caso-controle tentaram avaliar as associações entre as frações lipídicas e o risco de DP [32-35]. Alguns desses estudos tinham tamanhos de amostra pequenos, enquanto outros examinavam apenas frações lipídicas específicas, principalmente colesterol, ou controlavam um número limitado de possíveis fatores de confusão. Embora uma associação consistente tenha sido observada entre níveis mais altos de colesterol e um menor risco de DP, a causa subjacente é desconhecida e se resultados semelhantes são observados para outras frações lipídicas devem ser avaliados. Nas amostras de lágrimas testadas aqui, os membros da família da apolipoproteína (APO) parecem estar desregulados, uma família de proteínas implicada em muitos distúrbios neurodegenerativos. A proteína APOE participa de vários distúrbios cerebrais, incluindo DA, EM, lesões cerebrais traumáticas e doença de Creutzfeldt-Jakob [36-38], levantando a possibilidade de que a ApoE também possa desempenhar um papel significativo no desenvolvimento da DP. Além disso, níveis mais altos de colesterol foram detectados no cérebro de um modelo de camundongo transgênico de DP e, como as APOs estão envolvidas na manutenção da homeostase do colesterol, pode existir uma possível associação entre APOs e DP [39].
No entanto, poucos estudos têm focado no papel das APOs na DP. No SNC, os APOs são produzidos pelas células da glia e são captados pelos neurônios para serem usados no crescimento do axônio e na atividade sináptica. Além disso, acredita-se que ApoE tenha um papel neuroprotetor, impedindo a apoptose de neurônios e células ganglionares da retina (RGCs) [40]. A expressão de APOs no cérebro humano é influenciada pelo tipo de APO e pela idade do indivíduo. Dos diferentes APOs, ApoE, ApoD e ApoJ são os mais fortemente expressos no cérebro. No entanto, seus níveis de expressão podem mudar em diferentes fases da vida e, por exemplo, há 50% mais ApoE no cérebro neonatal do que no adulto, enquanto há aproximadamente 10 vezes mais ApoD e ApoJ no cérebro adulto do que no do embrião. A ApoD é expressa principalmente no cérebro, nervos periféricos, placenta, pulmão, ovário e baço [41]. Em nossas amostras de lágrimas, a ApoD parece estar superexpressa em pacientes com DP. As células gliais próximas ao SN de pacientes com DP têm mais ApoD, que se acredita estar relacionado ao estresse oxidativo, pois o ApoD protege as células do estresse oxidativo e sua expressão aumentada inibe a peroxidação lipídica [42].
De fato, a expressão de ApoD no tronco cerebral parece proteger contra a neurodegeneração e, em cérebros danificados, os neurônios não expressam ApoD [41]. Assim, ApoD na lágrima garante mais estudos em pacientes com DP e naqueles com outras doenças neurodegenerativas para avaliar se tem um verdadeiro efeito neuroprotetor em tais pacientes. Entre outras proteínas encontradas desreguladas no presente estudo, um pequeno grupo foi selecionado devido ao seu envolvimento em processos neurodegenerativos, especificamente na autofagia lisossômica ou transporte neuronal. Foi proposto que a via ubiquitina-proteassoma (UPP) desempenha um papel fundamental na degradação de -syn [43]; no entanto, há evidências crescentes de que o lisossomo também pode mediar a degradação de -syn [44,45]. Independentemente da via de autofagia exata pela qual a -syn entra no lisossomo, presume-se que seja rapidamente degradada pela "sinucleinase" em condições normais. Nos neurônios dopaminérgicos, há um equilíbrio dinâmico entre as várias formas conformacionais e estados oligoméricos da proteína -syn, que é modulado por fatores que podem acelerar ou inibir a agregação e formação de fibrilas [46]. A identificação e caracterização das espécies -syn tóxicas ainda são incompletas, e muitos estudos têm focado em diferentes estados de agregação de proteínas.
Esses estudos tentaram determinar se as espécies tóxicas correspondem às proteínas fibrilares insolúveis encontradas principalmente nos LBs ou, inversamente, aos oligômeros de proteínas pré-fibrilares ou protofibrilas. Há evidências crescentes in vivo e in vitro de que as espécies oligoméricas são as isoformas mais patologicamente relevantes [47,48], e até foi proposto que os LBs poderiam ser protetores, representando uma forma de agressoma. Em circunstâncias fisiológicas, -syn é ativo nas sinapses e está envolvido em processos como a formação, tráfego e acoplamento de vesículas sinápticas (SVs). Também está associado à reciclagem de SVs e ao armazenamento de dopamina.
A fosforilação e desfosforilação de -syn conduzem a ativação e desativação desta proteína, que também é controlada pela autofagia lisossômica e degradação do proteassoma impulsionada pela ubiquitinação [49]. Em condições patológicas provocadas por diferentes estímulos, -syn sofre dobramento, mutação ou fosforilação incorretos que levam à sua agregação, afetando a formação e o acoplamento de vesículas lisossômicas sem produzir autofagia lisossômica e levando à sua deposição em neurônios dopaminérgicos, a formação de LBs e apoptose [49]. Os resultados aqui apresentados mostram que, entre as proteínas desreguladas no fluido lacrimal de pacientes com DP, tanto iPD quanto portadores da mutação E46K-SNCA, existem duas proteínas relacionadas à autofagia lisossômica: CATD e ASAH1. CATD é uma importante aspartil protease lisossômica e, curiosamente, a deficiência de CATD e sua inativação enzimática em humanos resultam em um início precoce de neurodegeneração progressiva e eventualmente fatal, que é classificada como uma das várias síndromes de lipofuscinose ceróide neuronal (NCL) [50,51 ]. In vitro, CATD produz proteólise parcial de -syn recombinante [52], e a capacidade de CATD para regular -syn foi avaliada em células dopaminérgicas de tipo selvagem e mutantes em cultura.
Além disso, os cérebros de vários mamíferos deficientes em CATD com NCL foram estudados para avaliar o processamento endógeno de -syn e, conseqüentemente, concluiu-se que a atividade enzimática de CATD desempenha um papel importante no metabolismo de -syn. A proteína ASAH1 é uma enzima lisossômica que converte a ceramida lisossômica em esfingosina. A inibição de ASAH1 aumenta os níveis de ceramida, reduzindo também a quantidade de -syn oxidada e a da proteína ubiquitinilada em neurônios dopaminérgicos derivados de pacientes com DP. Uma diminuição nos níveis de ceramida devido ao aumento da atividade ASAH1 pode contribuir para o acúmulo de -syn intracelular, uma vez que altera a autofagia lisossômica, talvez inibindo a liberação de -syn para o espaço extracelular.
DYHC1 e LMNA são outras duas proteínas relevantes desreguladas nas lágrimas de pacientes com DP. DYHC1 é uma proteína envolvida no movimento de organelas dentro da célula e no transporte retrógrado nos axônios. Entre outras doenças neurodegenerativas, está implicada na DA e na DP. As alterações em DYHC1 causam transporte deficiente para sua localização sináptica normal e eliminação deficiente de proteínas, como a da protease lisossômica catepsina D [53]. Essa sequência de eventos proposta geraria uma espiral autocatalítica na qual os processos que levam à inibição do transporte axonal e à produção de -syn fosforilada tornam-se mutuamente estimulantes, fornecendo uma explicação racional para a perda sináptica precoce no estriado de pacientes com DP. Finalmente, a superexpressão da proteína LMNA na lágrima da DP foi implicada na desmielinização, mas isso não foi relacionado à DP até o momento [54].
No entanto, este é um percurso que merece ser considerado em estudos futuros. Este estudo apresenta algumas limitações, como o baixo número de pacientes incluídos, portanto deve ser considerado um estudo piloto, e isso deve ser levado em consideração na interpretação dos resultados. Além disso, seria necessário validar as proteínas candidatas, não apenas em uma coorte maior, mas também para verificar se elas aparecem em outros fluidos corporais (ou seja, sangue ou líquido cefalorraquidiano). Também é importante ter em mente que os possíveis mecanismos propostos neste artigo são apenas hipóteses que precisariam ser verificadas em estudos posteriores. Além disso, deve-se notar que, como as buscas nas bases de dados levaram em consideração sequências canônicas de proteínas, nenhuma informação sobre proteoformas foi obtida. Embora isso possa representar uma limitação na especificidade dos resultados, acreditamos que as informações obtidas no nível da sequência canônica ainda são de grande valor e fornecem informações valiosas sobre as características moleculares da doença.
No entanto, a possibilidade de que certas proteoformas possam ser responsáveis pelos resultados anotados deve ser considerada ao interpretar os dados.
5. Conclusões
Neste estudo piloto, a análise proteômica revelou que certas proteínas foram reguladas positivamente nas lágrimas de pacientes com DP, principalmente aquelas envolvidas na função lisossômica. A importância deste estudo na identificação de proteínas na lágrima envolvidas na neurodegeneração deve ser destacada como sua relação com pacientes com DP com um fenótipo agressivo da doença. Como este foi um estudo piloto, apenas um número limitado de pacientes foi estudado. Uma limitação do estudo é a diferença de idade entre o grupo controle e o grupo DP. A análise com amostras de lágrimas em indivíduos saudáveis sem patologias oculares é complicada, pois, a partir de certa idade, é difícil encontrar voluntários sem alterações no filme lacrimal. Estudos futuros com coortes maiores de pacientes nos permitirão identificar biomarcadores específicos para DP que ajudariam idealmente a prever o início dessa doença.
No entanto, fornecemos evidências aqui de que o proteoma de pacientes individuais pode ser analisado usando apenas uma quantidade limitada de lágrimas. Com um bom treinamento, a melhor maneira de extrair lágrimas para estudos proteômicos é usando um capilar de vidro, evitando assim a contaminação celular que pode ocorrer quando as tiras de Schirmer são usadas. Em estudos futuros, esperamos validar os resultados aqui apresentados e identificar endofenótipos da DP através do perfil proteômico lacrimal, que possam servir para o diagnóstico precoce da DP.
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