Lesão de podócitos por interação entre Tlr8 e seu ligante endógeno MiR-21 em rim obstruído e colateral

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disfunção erétil cistanche relacionado ao rim

Embora a doença renal crônica seja prevalente em adultos, a nefropatia obstrutiva (NO) tem sido relatada em pacientes jovens e idosos. Na NO, as lesões tubulointersticiais (TILs) têm sido amplamente investigadas, mas as lesões glomerulares (GLs) têm sido amplamente negligenciadas. Aqui, mostramos um novo mecanismo subjacente ao desenvolvimento de GL em ON em camundongos jovens e velhos. Os TILs se desenvolvem mais cedo do que os GLs devido à infiltração de células inflamatórias no túbulointerstício, mas os GLs se desenvolvem após a ativação do receptor Toll-like 8 (Tlr8), mesmo com a ausência de células inflamatórias infiltrando o glomérulo. As proteínas TLR8 e interleucina 1 beta (IL1b) co-localizam com marcadores de função podócitos redutores (PFMs), indicando a ativação da sinalização de TLR8 em podócitos lesionados. Além disso, os níveis glomerulares e séricos de miR-21, um ligante endógeno para Tlr8, foram maiores no modelo de camundongo ON do que no controle simulado. A expressão glomerular de Tlr8 correlaciona-se positivamente com miR{10}} e as citocinas a jusante Il1b e Il6 e negativamente correlacionada com PFMs (Nphs1 e Synpo). Também mostramos a co-localização de proteínas TLR8 e IL1b com redução de PFMs em ambos obstruídos egarantiarinsde camundongos jovens e velhos. Além disso, resultados de estudos in vitro revelaram maior expressão de Tlr8 e suas citocinas a jusante em glomérulos derinsapós o tratamento com miR- 21 mimetizador do que no controle. Em conclusão, a superexpressão de Tlr8 pode servir como um mecanismo plausível subjacente ao desenvolvimento de GL em ON através de lesão podocitária.

Palavras-chave: doença renal crônica,nefropatia obstrutiva, podócito, TLR8, rim obstruído e colateral

INTRODUÇÃO

Doença renal crônica (DRC), um grande problema de saúde pública, é prevalente em 8% a 13% da população geral (1). É frequente em pessoas idosas devido ao envelhecimento da sociedade. A nefropatia obstrutiva (NO) é de grande interesse para os clínicos, pois tem sido relatada em pacientes de diferentes faixas etárias. A ON é tratável e reversível, ao contrário de outras DRC (2, 3). Em crianças, ocorre em um dos 1500 indivíduos jovens, e sua prevalência é de 1% a 5% nos países desenvolvidos (4, 5). Em adultos, a prevalência de NO varia de 5 em 1.000 a 5 em 10.000 indivíduos. Além disso, a prevalência de NO unilateral crônica é de aproximadamente 0,5 por cento, enquanto a de NO unilateral aguda e bilateral crônica é de aproximadamente 0,1 por cento (4-7).

A NO pode levar à lesão renal aguda ou DRC, que envolve uma diminuição progressiva da função renal e alterações nas estruturas renais com duração superior a 3 meses (8, 9). A obstrução ureteral unilateral (UUO) é uma estratégia amplamente utilizada para estudar a NO crônica. ON em um rim UUO é caracterizado por hipertrofia, hidronefrose, recrutamento de células inflamatórias na área intersticial, morte de células tubulares por hipóxia e deposição de colágeno no tubulointerstício, seguido pelo desenvolvimento de fibrose tubulointersticial (TF) (10).

O TF é uma característica importante da doença renal terminal e um dos principais determinantes da lesão renal progressiva (11). O TF tem sido extensivamente investigado em modelos de NO, mas os dados sobre lesão glomerular, especialmente anormalidades da barreira hemato-urinária (BUB), são escassos (8, 9, 12). Além disso, estudos investigaram lesões tubulointersticiais (TILs) no rim colateral em NO unilateral, mas as lesões glomerulares (GLs) foram amplamente negligenciadas (12). Vários relatos revelaram o envolvimento de capilares peritubulares na progressão de TILs em NO experimental (13, 14). No entanto, o glomérulo e o capilar glomerular drenam para os segmentos tubulares do néfron e capilares peritubulares, respectivamente. Portanto, sugerimos que a glomerulonefrite também pode afetar o tubulointerstício. Nossos estudos anteriores destacaram a contribuição da lesão de células intrínsecas glomerulares, principalmente podócitos, para GL e o subsequente desenvolvimento de TIL em um modelo de camundongo com doença autoimune devido à superexpressão de diferentes receptores Toll-like (TLRs) (15-18).

O endotélio capilar glomerular e os podócitos são importantes guardiões dos BUBs. Entre esses dois epitélios, os podócitos são continuamente expostos a sinais de perigo, incluindo ligantes de TLR, como padrões moleculares associados a perigos (DAMPs) ou padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), devido à sua localização única nos glomérulos (15). Portanto, acredita-se que a interação entre TLRs em podócitos e seus ligantes endógenos contribua para a lesão de podócitos em condições não infecciosas. No presente estudo, focamos no desenvolvimento de GL em ambos os rins obstruídos e colaterais de camundongos jovens e velhos, pois a ON é frequentemente encontrada em humanos jovens e idosos. Esclarecemos que o GL foi desenvolvido em ON devido à lesão de podócitos através da superexpressão de Tlr8 em podócitos de rins obstruídos e colaterais de camundongos jovens e velhos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Declaração Ética e Alojamento Animal Experimental Todos os experimentos com animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Hokkaido (aprovação nº 16- 0124). Os autores seguiram o guia aprovado para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade de Hokkaido, Faculdade de Medicina Veterinária (aprovado pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Camundongos C57BL/6N de seis semanas de idade foram adquiridos da Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japão) e mantidos em condições específicas livres de patógenos sob um ambiente claro-escuro 1:1. Os animais experimentais receberam ração e água potável ad libitum.

Desenho Experimental Usamos camundongos jovens (9 semanas) e velhos (12 meses). Camundongos de cada faixa etária (n=4) foram submetidos à operação simulada (grupo controle) ou UUO (2, 7, 11 e 21 dias) para estabelecer um rim modelo ON, conforme descrito em nosso estudo anterior (13).

Preparação da amostra Os camundongos foram profundamente anestesiados com uma mistura de agentes anestésicos como descrito anteriormente (16) e sacrificados por deslocamento cervical. Amostras de sangue foram coletadas através da artéria femoral para análise de marcadores séricos. Ambos os rins UUO e colaterais foram coletados e cortados em fatias finas. As fatias de rim foram fixadas com 10% de formalina tampão neutra (NBF), 4% de paraformaldeído (PFA) e 2,5% de glutaraldeído (GTA) para estudos histopatológicos, imuno-histoquímicos e de microscopia eletrônica, respectivamente.

Blocos de parafina fixados com NBF por imunohistoquímica e imunofluorescência foram cortados com 2 mm de espessura e corados com ácido periódico de Schiff-hematoxilina (PAS-H) para examinar a histopatologia renal. A imunodetecção de marcadores celulares foi realizada conforme relatado anteriormente (16) para células B (B220), células T (CD3), endotélio capilar (CD31), IL1b, macrófagos (Iba1), podócitos (podocina e sinaptopodina) e TLR8. As condições de coloração estão listadas na Tabela 1.

Histoplanimetria PAS-H e seções de rim imunocoradas foram convertidas em lâminas virtuais usando Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japão). As células positivas foram contadas a partir de 20 glomérulos ou 20 focos selecionados aleatoriamente do tubulointerstício em ampliação de 400x usando o software NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Imagens de 20 glomérulos de seções coradas com PAS-H também foram capturadas em 400x de cada camundongo usando um microscópio de fluorescência tudo-em-um BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japão). A área e tamanho mesangial glomerular foram medidos a partir de imagens capturadas usando um analisador BZ-X (Keyence).

Isolamento de glomérulos para extração e cultura de RNA Os glomérulos de rins sham-operados e UUO foram isolados como descrito anteriormente (16). Resumidamente, os camundongos foram profundamente anestesiados e perfundidos através do ventrículo esquerdo com 40 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) contendo Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). O rim foi extirpado

e cortado em pedaços pequenos. As células foram então digeridas com colagenase A (1 mg/mL; Roche, Basel, Suíça) e desoxirribonuclease I (100 U/ml; Life Technologies) em HBSS a 37 graus por 30 min. A suspensão contendo tecido digerido foi pressionada suavemente através de um filtro de células 100-mm (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, EUA) usando um pilão achatado. A suspensão de células resultante foi centrifugada a 200 xg por 5 min, e o sedimento de células foi ressuspenso em 2 ml de HBSS. Os glomérulos contendo Dynabeads foram coletados usando um concentrador de partículas magnéticas (Life Technologies) e usados ​​para isolamento de RNA.

Transcrição reversa e PCR em tempo realO RNA total foi isolado dos glomérulos usando um kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha). O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total por transcrição reversa usando a enzima transcriptase reversa ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japão) e iniciadores dT aleatórios (Promega). O cDNA foi utilizado em PCR em tempo real com master mix Brilliant III SYBR Green QPCR e Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, EUA). A expressão do gene glomerular foi normalizada para a expressão de Actb. Os pares de primers usados ​​são mostrados na Tabela 2.

Transcrição reversa e PCR em tempo real baseado em TaqManO RNA total, incluindo microRNA (miRNA) nos glomérulos isolados, foi isolado usando um kit miRNeasy (Qiagen). Iniciadores de RT de alça de haste específicos de miRNA, transcriptase reversa, tampão de transcrição reversa, dNTPs e inibidor de RNase foram usados ​​para transcrever o RNA total de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A PCR em tempo real foi realizada com o cDNA resultante usando primers TaqMan específicos de miR-21- e sondas específicas (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) e Mx3000P (Agilent Technologies).

Tratamento in vitro de glomérulos isolados com mímicosGlomérulos foram isolados de sham-operated e UUOrinsapós 11 dias de obstrução. O meio Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) (Fujifilm Wako, Japão) contendo 300 glomérulos foi distribuído em cada poço de uma 96-placa de cultura de poço (TPP, Trasadingen, Suíça) e tratados com PBS, controle negativo e mimetizador de miR-21 (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Coreia do Sul) a 1 pmol/µL por 4 h a 37 graus em 5 por cento de CO2. A expressão de Tlr8 e suas citocinas a jusante foi medida conforme descrito na seção anterior.

Microscopia Eletrônica de VarreduraPara microscopia eletrônica de varredura de rotina (SEM), pequenasrim fatiasforam fixados com 2,5 por cento de GTA por 4 h e pós-fixados com 1 por cento de tetróxido de ósmio por 1 h, seguido de tratamento com 1 por cento de ácido tânico por 1 h. As amostras foram então fixadas com tetróxido de ósmio a 1 por cento por 1 h e tratadas com 0,5 por cento e 1 por cento de ácido tânico por 10 min e 1 h, respectivamente.Rimfatiasforam desidratados com graus crescentes de álcool, transferidos para 3-acetato de metil butil e finalmente secos com um secador de ponto crítico HCP-2 (Hitachi, Tóquio, Japão). Os espécimes foram submetidos à pulverização de íons e então examinados em um microscópio eletrônico de varredura S-4100 a uma voltagem acelerada de 12 kV.

Análise estatísticaOs valores são expressos como média ± erro padrão (se). Os resultados foram analisados ​​estatisticamente usando um teste não paramétrico de Mann-Whitney U (P < 0.05).="" o="" teste="" de="" kruskal-wallis="" foi="" utilizado="" para="" comparar="" três="" ou="" mais="" populações,="" e="" comparações="" múltiplas="" foram="" realizadas="" pelo="" método="" de="" scheffe,="" uma="" vez="" observadas="" diferenças="" significativas="" (p="">< 0,05).="" a="" correlação="" entre="" os="" dois="" parâmetros="" foi="" analisada="" por="" meio="" do="" teste="" do="" coeficiente="" de="" correlação="" de="" postos="" de="" spearman="" (p=""><>

RESULTADOS

TILs e GLs nos rins obstruídos de camundongos jovensNós primeiro examinamos TILs e GLs em rins sham-operados e UUO de camundongos jovens submetidos à obstrução por diferentes períodos de tempo. Enquanto os rins sham-operados mostraram tubulointerstício normal (Figura 1A), os rins obstruídos após 2 dias de UUO apresentaram TILs e foram caracterizados pela dilatação dos túbulos; alguns túbulos também continham cilindros urinários. Tais lesões aumentaram com o avanço da obstrução (Figura 1A). GLs, principalmente glomeruloesclerose, foram observados no estágio tardio aos 21 dias após UUO e caracterizados pela deposição de materiais positivos para ácido periódico de Schiff (PAS). A estrutura glomerular era normal em ambos os rins sham e UUO precoce (2, 7 e 11 dias) (Figura 1B). O número de células glomerulares tendia a aumentar até o dia-11 após a obstrução e tendia a diminuir no dia-21 nos rins UUO (Figura 1C). O acúmulo mesangial glomerular tendeu a aumentar a partir de 7 dias após a obstrução (Figura 1D).

estava ausente no centro dos glomérulos dos rins UUO aos 21 dias após a obstrução (Figura 1F). A reação em cadeia da polimerase revelou uma diminuição significativa nos PFMs (Nphs1 e Synpo) em rins UUO 21 dias após a obstrução (Figura 1G). Além disso, a análise SEM revelou processos podócitos normais do pé (PFPs) em rins sham-operados; no entanto, o apagamento da PFP e estruturas semelhantes a microvilosidades foram relatados em rins UUO 21 dias após a obstrução (Figura 1H). Juntos, esses resultados sugerem a ocorrência de lesão podocitária no rim obstruído 21 dias após a obstrução.

Células imunes infiltrantes estão ausentes no rim obstruído Mostramos anteriormente que a lesão de podócitos se correlaciona com células imunes infiltrantes no glomérulo (13, 16, 18). Portanto, examinamos a infiltração de células B e T, bem como macrófagos em TILs e GLs de rins sham-operados e UUO (Figura 2). Numerosas células B, T e macrófagos infiltrantes foram observados nos TILs dos rins UUO em todos os dias após a obstrução, mas eles estavam quase ausentes ou poucos nos glomérulos de ambos os rins falsos e UUO (Figuras 2A-E). O número de células B, T e macrófagos foi muito pequeno no glomérulo (dados não mostrados), mas significativamente maior no

tubulointerstitium dos rins 2-, 7-, 11- e 21-dia em comparação com o do rim simulado (Figura 2F). Portanto, a infiltração de células imunes pode contribuir para o desenvolvimento de TILs no rim obstruído. No entanto, outros fatores podem estar relacionados ao desenvolvimento da LG.

Expressão de diferentes membros da família TLR e citocinas a jusante em rins obstruídos e operados por engano de camundongos jovens Estudos anteriores revelaram maior expressão de diferentes TLRs em podócitos de rins doentes (15, 16, 19, 20). Curiosamente, nossos dados revelaram uma expressão significativamente maior de Tlr8 e Tlr9 nos glomérulos isolados do grupo UUO 21-dia do que nos glomérulos do grupo sham (Figura 3A). Além disso, examinamos a expressão de citocinas a jusante dos membros da família TLR nos glomérulos de grupos sham e UUO 21-day e encontramos uma regulação positiva significativa na expressão dos genes que codificam tanto a interleucina 1 beta (Il1b) quanto a interleucina 6 (Il6) no grupo UUO em comparação com o grupo sham (Figura 3B).

TLR8 co-localizado com PFM Como a expressão de Tlr8 e Tlr9 era alta nos glomérulos isolados do rim obstruído, examinamos sua localização por coloração de imunofluorescência. A proteína TLR8 não foi detectada em rins sham-operados (Figura 4A), mas foi co-localizada com a sinaptopodina PFM no rim UUO (Figura 4B). Além disso, não conseguimos detectar a expressão da proteína TLR9 no rim de camundongos sham-operados ou UUO (dados não mostrados).

Produção de IL1b a partir de podócitos no rim obstruído de camundongos jovens Como mostrado na Figura 3B, a expressão de Il1b glomerular (uma citocina a jusante da família TLR) foi significativamente maior no rim UUO aos 21 dias do que no rim simulado. Portanto, examinamos a fonte de IL1b nos glomérulos de rins UUO por coloração de imunofluorescência. A expressão da proteína IL1b não foi detectada nos glomérulos de rins falsos, mas foi observada nos glomérulos de rins UUO (Figuras 4C, D). Além disso, IL1b colocalizado com podocina PFM (Figura 4D).

na UAUrimem 21 dias do que na farsarim.Portanto, examinamos a fonte de IL1b nos glomérulos de rins UUO por coloração de imunofluorescência. A expressão da proteína IL1b não foi detectada nos glomérulos de shamrinsmas foi observada nos glomérulos de UUOrins(Figuras 4C, D). Além disso, IL1b colocalizado com podocina PFM (Figura 4D).

Aumento do nível do ligante Tlr8 endógeno putativo em camundongos modelo ON Um estudo anterior mostrou que miR-21 serve como um ligante para TLR8 (21). Portanto, comparamos os níveis glomerulares e séricos de miR-21 entre os grupos sham e UUO 21-dia. Curiosamente, o grupo UUO 21-dia mostrou níveis significativamente mais altos de miR glomerular-21 do que no grupo sham (P < 0.05),="" no="" entanto,="" uma="" tendência="" crescente="" de="" mir="" sérico{="" {10}}="" foi="" observado="" no="" primeiro="" grupo="" do="" que="" no="" último="" (p="0.06)" (figura="">

Correlação da expressão de Tlr8 com seu ligante miR-21 e PFMs no ObstruídoRimConforme mostrado na Tabela 3, observamos uma correlação positiva significativa entre a expressão glomerular do mRNA de Tlr8 e seu ligante endógeno (miR-21), bem como as citocinas a jusante Il1b e Il6. Por outro lado, foi evidente uma correlação negativa entre o mRNA de Tlr8 e os PFMs Nphs1 e Synpo.

Estimulação in vitro de glomérulos com miR{{0}} Mimic ativa a expressão de Tlr8 e suas citocinas a jusante A expressão de Tlr8 tendeu a aumentar (P=0.06) mas suas citocinas a jusante (Ifng e Il1b) foram significativamente (P < 0,05 e 0,01) aumentadas nos glomérulos de camundongos sham após

tratamento com mimetizador de miR-21 em comparação com o dos glomérulos de camundongos tratados com PBS e mimetizador de controle negativo (Figura 5A). No entanto, nenhuma correlação significativa foi observada entre a expressão de Tlr8 e suas citocinas a jusante nos glomérulos de camundongos sham após tratamento com mimetizadores (Tabela 4). A expressão de Tlr8 e suas citocinas a jusante foi significativamente maior nos glomérulos de UUOrins, após o tratamento com miR-21 mimetizador do que aqueles nos glomérulos de UUOrinstratados com PBS e mimetizador de controle negativo (Figura 5B). Uma correlação significativa foi detectada entre a expressão de Tlr8 e suas citocinas a jusante nos glomérulos de rins UUO após tratamento com mimetizadores, indicativo da maior ativação da via do fator nuclear kappa B (NF-kB) mediada por Tlr8- e secreção de citocinas pró-inflamatórias no rim obstruído (Tabela 4).

Localização de TLR8 e lesão de podócitos nos rins colaterais de camundongos jovensOs rins sham-operados apresentaram glomérulo normal, enquanto os rins colaterais apresentaram hipertrofia glomerular, aumento do número de células glomerulares e dilatação dos capilares glomerulares (Figura 6A). Os glomérulos de rins sham-operados foram positivos para a expressão de sinaptopodina e não tinham expressão de TLR8 (Figura 6B). Por outro lado, os rins colaterais perderam a expressão de sinaptopodina no centro dos glomérulos, mas apresentaram expressão de TLR8 ao longo da taxa glomerular (Figura 6C). Além disso, a proteína TLR8 foi co-localizada com sinaptopodina (Figura 6C). Rins operados por sham mostraram expressão normal de podocina, mas nenhuma expressão de IL1b nos glomérulos (Figura 6D). No entanto, os glomérulos dentro do rim colateral perderam a expressão de podocina no centro, mas tiveram expressão de IL1b ao longo da taxa glomerular (Figura 6E). Além disso, a proteína IL1b foi co-localizada com podocina (Figura 6E). A análise SEM revelou PFPs normais em rins de camundongos simulados, mas o apagamento de PFP e estruturas semelhantes a microvilosidades eram visíveis nos rins colaterais (Figura 6F).

Localização de TLR8 e lesão de podócitos nos rins obstruídos e colaterais de camundongos idososRins operados por sham mostraram expressão normal de sinaptopodina, mas não revelaram coloração para proteína TLR8 dentro de seus glomérulos (Figura 7A). Curiosamente, os rins colaterais e UUO mostraram perda de expressão de sinaptopodina no centro dos glomérulos, mas mantiveram a expressão de TLR8 ao longo da rede glomerular (Figuras 7B, C). A proteína TLR8 foi co-localizada com sinaptopodina nos rins colaterais e UUO (Figuras 7B, C). Rins operados por sham também mostraram expressão normal de podocina, mas não tiveram expressão de IL1b em seus glomérulos (Figura 7D). Por outro lado, os rins colaterais e UUO perderam a expressão de podocina no centro dos glomérulos, mas mostraram expressão de IL1b ao longo da rede glomerular (Figuras 7E, F). A coloração positiva foi localizada com podocina nos glomérulos dos rins colaterais e UUO (Figuras 7E, F). O exame SEM revelou PFPs normais em rins de camundongos simulados, apagamento de PFP e estruturas semelhantes a microvilosidades nos rins colaterais e UUO de camundongos velhos (Figura 7G).

DISCUSSÃOSOBRE

a prevalência é comum em crianças, bem como em indivíduos idosos (4-7). Assim, submetemos camundongos jovens e velhos a UUO para imitar a condição ON de indivíduos de diferentes faixas etárias e examinamos TILs e GLs. No rim obstruído, a progressão dos TILs foi evidente em um estágio mais precoce da obstrução (2 dias); no entanto, a progressão dos GLs juntamente com a lesão podocitária foi observada em um estágio posterior. O rim colateral apresentou GLs e lesão podocitária ao mesmo tempo. Essa observação indica que a lesão podocitária ocorre tanto nos rins obstruídos quanto nos colaterais, embora o insulto inicial possa variar. Nossos estudos anteriores destacaram a correlação entre lesão de podócitos e infiltração de células imunes no glomérulo (13, 16, 18). No entanto, a infiltração de células imunes nos glomérulos de rins falsos ou obstruídos não foi observada no presente estudo. Portanto, consideramos o envolvimento de outros fatores na lesão podocitária no rim obstruído. Nós hipotetizamos que sinais de perigo (DAMPs ou PAMPs), sejam de origem circulatória ou decorrentes do epitélio tubular danificado, podem contribuir para a lesão podocitária na NO, devido à sua localização única no glomérulo. É importante ressaltar que a interação entre DAMPs e TLRs demonstrou desempenhar um papel importante na patogênese de doenças não infecciosas (15). Diferentes membros da família TLR são expressos na membrana plasmática da célula ou vesículas intracelulares (22) e são caracterizados como sensores imunes inatos que reconhecem eficientemente DAMPs ou PAMPs. Após a ativação por DAMPs ou PAMPs correspondentes, os TLRs aumentaram a expressão de citocinas a jusante através da via NF-kB e induziram o sistema de defesa do hospedeiro (22). Além disso, os DAMPs retransmitem a presença de lesão tecidual para células imunes ou células intrínsecas locais e, consequentemente, agravam o dano tecidual (23-26). É importante ressaltar que todos os TLRs ativam a via NF-kB que controla a expressão de uma série de genes de citocinas inflamatórias (27). Além disso, a ativação dos TLRs sinaliza suas vias a jusante para ativar o NF-kB, que é responsável pela inflamação e ligado à patogênese dos tecidos danificados (28). Shichita et ai. revelaram as interações patológicas entre ligantes endógenos e TLR2 ou TLR4, que contribuem para lesão cerebral isquêmica (25). Estudos anteriores também demonstraram a capacidade dos membros da família TLR de induzir TILs no rim (TLR2, 4, 5, 7 e 11) e GLs (TLR1-6, 8 e 9) (17, 29-33 ). No presente estudo, encontramos lesão podocitária em rins obstruídos e colaterais e esclarecemos a

papéis de diferentes membros da família TLR que podem contribuir para a lesão de podócitos (15, 16, 19, 20). Como hipotetizamos, a expressão glomerular de Tlr8 e Tlr9 foi maior nos glomérulos isolados do rim UUO do que naqueles de camundongos sham-operados. Além disso, a expressão glomerular de citocinas inflamatórias relacionadas à via NF-kB, incluindo Il1b e Il6, foi maior no rim UUO aos 21 dias após a obstrução. Portanto, concluímos que a via NF-kB mediada por TLR desempenha um papel importante na patogênese da GL no rim obstrutivo. Ao contrário de outros membros da família TLR, TLR8 e TLR9 são detectados nos endossomos das células. O TLR8 reconhece RNAs de fita simples e RNAs de fita dupla curtos de microrganismos e ativa a produção de várias citocinas mediadas por NF-kB (22). Por outro lado, TLR9 reconhece DNAs de fita dupla e ativa a via NF-kB para produzir citocinas a jusante (16, 34). Neste estudo, reconhecemos apenas a co-localização da proteína TLR8 junto com a sinaptopodina PFM nos glomérulos. Nossos estudos anteriores também mostraram que TLR8 e TLR9 co-localizam com PFMs e ativam a produção de citocinas inflamatórias mediadas por NF-kB para induzir lesão de podócitos (15, 16). Além disso, outros estudos mostraram a correlação patológica entre as vias mediadas por TLR e a lesão de podócitos in vitro (34, 35). Banas et ai. revelaram a interação de TLR4 em podócitos com o sistema imunológico durante o desenvolvimento de GL (35). Assim, os podócitos podem contribuir para a vigilância imunológica por meio de vias mediadas por TLR. Neste estudo, mostramos a expressão do gene TLR8 e a localização da proteína nos podócitos do rim obstruído, bem como a maior expressão das citocinas a jusante no glomérulo. Portanto, concluímos que as vias mediadas por TLR8-contribuem para o desenvolvimento de GL através da lesão de podócitos no rim obstruído.

Um estudo anterior mostrou que miR-21, um ligante endógeno de TLR8, pode alcançar e se ligar a TLR8 em endossomos celulares, onde pode induzir a ativação mediada por TLR8-da via NFkB e secreção de citocinas pró-inflamatórias (21). No presente estudo, encontramos níveis significativamente mais altos de miR glomerular-21, bem como níveis elevados de miR sérico-21 no rim UUO do que em controles simulados e demonstramos sua correlação com a expressão glomerular de Tlr8 . Curiosamente, os glomérulos de rins UUO tratados com miR-21 mimetizador mostraram maior expressão de Tlr8 e suas citocinas a jusante em comparação com aqueles nos glomérulos de camundongos sham tratados com miR-21 mimetizador, indicando maior disponibilidade de miR endógeno -21 de tecidos danificados no rim obstruído e ativação da superexpressão de Tlr8 em rins UUO comparam com a de um sham. Juntos, concluímos que um maior volume de miR-21 no rim obstruído atinge os endossomos em podócitos e induz a ativação mediada por Tlr8-da via NF-kB e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Essas citocinas, por sua vez, participam do desenvolvimento do GL por meio da lesão de podócitos.

A IL1b é uma das importantes citocinas a jusante da via NF-kB, produzida principalmente por podócitos no glomérulo sob condições de doença. Estudos anteriores mostraram que IL1b induz lesão de podócitos reduzindo PFMs (36, 37). No presente estudo, mostramos maior expressão glomerular de Il1b e sua co-localização com MAPs, que apresentaram expressão reduzida. Além disso, a expressão glomerular de Il1b correlacionou-se com Tlr8 e tendeu a se correlacionar com a expressão de PFMs (Nphs1 e Synpo). Portanto, esses resultados indicam que fatores a jusante de Tlr8, incluindo Il1b e Il6, podem causar lesão de podócitos no rim obstruído, reduzindo a expressão de PFM.

Os rins colaterais de camundongos jovens também apresentaram GLs e perda de PFMs. Este resultado foi confirmado por MEV, que revelou lesão podocitária no rim colateral. Também encontramos níveis mais altos de miR sérico-21 no modelo de camundongo ON. Além disso, a proteína IL1b co-localizada com PFM. Esses resultados indicam que o miR-21 sérico interage com o TLR8 nos podócitos do rim colateral e ativa a produção de citocinas a jusante, que por sua vez reduz a função e a lesão dos podócitos. A lesão de podócitos também foi observada nos rins obstruídos e colaterais de camundongos velhos por meio de um mecanismo semelhante ao observado em camundongos jovens.

Em conclusão (Figura 8), a expressão glomerular miR-21 é elevada após obstrução ureteral unilateral, em que interage com TLR8 em podócitos e induz a produção de citocinas a jusante (Il1b e Il6) sugerindo ativação da via NF-kB. Níveis mais altos de citocinas reduzem os MAPs, resultando em lesão de podócitos e subsequente desenvolvimento de GLs. Níveis elevados de miR sérico-21 ativam TLR8 nos podócitos do rim colateral e induzem GLs por meio de lesão de podócitos. Portanto, este estudo mostra claramente o desenvolvimento de GL em rins obstruídos e colaterais através de lesão de podócitos após superexpressão de Tlr8.