Abstrato:

Estudos recentes mostraram que a plumbagina tem atividades anti-inflamatórias, antialérgicas, antibacterianas e anticancerígenas; no entanto, ainda não foi demonstrado se a plumbagina suprime a síntese de melanina induzida pelo hormônio alfa-melanócito (-MSH) para prevenir a hiperpigmentação. Neste estudo, demonstramos que a plumbagina suprime significativamente a síntese de melanina estimulada por -MSH em células de melanoma de camundongo B16F10. Para entender o mecanismo inibitório da plumbagina na síntese de melanina, realizamos ensaios de atividade de tirosinase celular ou livre de células e analisamos a expressão gênica relacionada à melanogênese. Demonstramos que a plumbagina suprime diretamente a atividade da tirosinase independentemente da maquinaria transcricional associada à melanogênese, que inclui fator de transcrição associado à microftalmia (MITF), tirosinase (TYR) e proteína 1 relacionada à tirosinase (TYRP1). Também investigamos se a plumbagina era tóxica para queratinócitos humanos normais (HaCaT) e células epiteliais do cristalino (B3) que podem ser danificadas pelo uso de cosméticos para cuidados com a pele. Surpreendentemente, concentrações mais baixas de plumbagina (0,5–1 µM) inibiram efetivamente a síntese de melanina e a atividade da tirosinase, mas não causaram toxicidade em queratinócitos, células epiteliais do cristalino e células de melanoma de camundongos B16F10, sugerindo que a plumbagina é segura para aplicação dérmica. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que o efeito inibitório da plumbagina na pigmentação pode torná-la um componente aceitável e seguro para uso em formulações cosméticas de cuidados com a pele usadas para clareamento da pele.

De acordo com estudos relevantes, a cistanche é uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu principal componente é o cistanósido, que possui diversos efeitos como antioxidante, anti-inflamatório e promotor da função imunológica. O mecanismo entre cistanche e clareamento da pele reside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada pela tirosinase, e a reação de oxidação requer a participação do oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, inibindo assim a produção de melanina.

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Palavras-chave:plumbagina; melanogênese; pigmentação; tirosinase

1. Introdução

A melanina consiste em um grupo de pigmentos sintetizados nos melanócitos epidérmicos que desempenham um papel importante na defesa da pele contra os danos causados ​​pela radiação ultravioleta (UV). A melanogênese anormal, produção aumentada ou diminuída de melanina, está intimamente associada a várias doenças de pele, incluindo melanoma e distúrbios de pigmentação, como cloasma e sardas [2,3]. A biossíntese de melanina é iniciada por múltiplos estímulos, incluindo irradiação ultravioleta, citocinas inflamatórias e sinalização hormonal. Especificamente, o hormônio estimulador de melanócitos (-MSH) liberado de queratinócitos expostos a UV pode estimular a biossíntese de melanina em melanócitos epidérmicos, ativando o eixo cAMP-PKA-CREB (adenosina monofosfato-proteína quinase A-cAMP resposta elemento de ligação) [3] . O eixo cAMP-PKA-CREB ativado leva a um aumento no mRNA que codifica o fator de transcrição associado à microftalmia (MITF). O MITF aumenta a expressão gênica da tirosinase (TYR), da proteína 2 relacionada à tirosinase (TYRP1) e da proteína 2 relacionada à tirosinase (TYRP2) mediante estimulação de -MSH em melanócitos [3,4]. Além disso, muitas vias de sinalização que controlam o crescimento celular, incluindo proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), quinase de resposta extracelular (ERK) e AKT, são essenciais para a melanogênese, regulando a estabilidade e a atividade do MITF [5].

A enzima tirosinase, uma oxidase multifuncional contendo cobre, desempenha um papel essencial na biossíntese da melanina, catalisando as reações nas quais a L-tirosina é hidroxilada a L-diidroxifenilalanina (L-DOPA) e a L-DOPA é oxidada em o-quinona (dopaquinona ) [5,6]. Portanto, alguns inibidores de tirosinase também inibem a biossíntese de melanina, e estes incluem resveratrol, arbutin e honokiol, que têm sido usados ​​em aplicações cosméticas de clareamento da pele [7].

Plumbagin é uma hidroxil-naftoquinona simples, que foi extraída pela primeira vez das raízes do gênero de plantas Plumbago e demonstrou ter propriedades medicinais notáveis ​​[8]. As atividades anti-inflamatória, anticancerígena, antialérgica e antibacteriana da plumbagina foram relatadas [8,9]. De fato, foi relatado que a plumbagina inibe a ativação de neutrófilos, a angiogênese e a expressão da colagenase suprimindo a topoisomerase-II, sugerindo o uso da plumbagina como uma droga potencial no tratamento da artrite reumatóide [10]. Além disso, vários relatórios mostraram que a plumbagina exibe atividade anticancerígena em vários tipos de câncer, incluindo mama [11], próstata [12], ovário [13], pulmão [14], carcinoma de pele [15] e câncer de fígado [16]. Embora esteja ficando claro que a plumbagina pode ser útil como uma intervenção terapêutica no tratamento de várias doenças humanas, o efeito inibitório da plumbagina na melanogênese ligada à hiperpigmentação nunca foi relatado.

2. Resultados

2.1. Estrutura Química e Efeitos Citotóxicos da Plumbagina em Células de Melanoma de Camundongo B16F10

Antes de estudar os efeitos anti-melanogênicos da plumbagina, primeiro avaliamos sua toxicidade em células de melanoma de camundongo B16F10 produtoras de melanina. A estrutura química da plumbagina é mostrada na Figura 1A. Os resultados do nosso ensaio de citotoxicidade em que concentrações de plumbagina inferiores a 5 µM não afetaram a viabilidade celular em células B16F10 são mostrados na Figura 1B.

2.2. Plumbagina suprime a síntese de melanina induzida por MSH em células de melanoma de camundongo B16F10

Em seguida, investigamos os efeitos inibitórios da plumbagina na síntese de melanina induzida pelo hormônio estimulante de melanócitos (-MSH) em células B16F10. Demonstramos que a plumbagina suprime fortemente o acúmulo de melanina induzido por -MSH em um meio de cultura de células B16F10 (Figura 2A). Para confirmar o efeito inibitório da plumbagina na síntese de melanina induzida por -MSH, determinamos o conteúdo de melanina extracelular ou intracelular na ausência ou presença de plumbagina em células B16F10 estimuladas por -MSH. As Figuras 2B e C mostram que a plumbagina diminui significativamente o conteúdo de melanina extracelular e intracelular.

2.3. Plumbagina não regula a expressão gênica da melanogênese induzida por MSH e as cascatas de transdução de sinal

Como o fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) é um fator de transcrição essencial que regula a expressão gênica associada à melanogênese por meio do eixo -MSH-PKA-CREB, investigamos se a plumbagina poderia regular a expressão gênica mediada por MITF associada à melanogênese. Primeiro, determinamos um ponto no tempo de expressão gênica máxima de melanogênese para MITF, tirosinase (TYR) e proteína 1 relacionada à tirosinase (TYRP1) sob estimulação -MSH. MITF é fortemente regulado após o tratamento -MSH por 2 h (Figura 3A). TYR e TYRP1 foram dramaticamente regulados após 48 h de tratamento com -MSH (Figura 3A). Os níveis de proteína MITF e tirosinase aumentaram em resposta ao tratamento com -MSH e não foram suprimidos pelo tratamento com plumbagina (Figura 3B). Consistentemente, a plumbagina não inibiu os níveis de mRNA de MITF, TYR e TYRP1 após estimulação com -MSH, sugerindo que a plumbagina não regula a maquinaria transcricional relacionada à expressão do gene da melanogênese em células B16F10 (Figura 3C). Como a fosforilação e a ativação de AKT, ERK1/2 e CREB (principais cascatas de transdução de sinal que regulam a melanogênese) são necessárias para a melanogênese [3], investigamos ainda mais se a plumbagina regula essas vias de transdução de sinal associadas à melanogênese. Nossos resultados, descritos na Figura 3D, mostram que a plumbagina não altera a sinalização de AKT, ERK1/2 ou CREB após o tratamento com -MSH.

2.4. Plumbagina inibe a atividade da tirosinase

Como está claro que os produtos naturais inibidores diretos ou indiretos da tirosinase podem ser úteis para o desenvolvimento de cosméticos para clareamento da pele, investigamos o efeito inibitório da plumbagina na atividade da enzima tirosinase. Neste estudo, demonstramos que a plumbagina suprime significativamente a atividade enzimática da tirosinase celular induzida por -MSH em células B16F10 (Figura 4A). Para entender se a plumbagina inibe a atividade da tirosinase direta ou indiretamente, a atividade da tirosinase livre de células foi medida. A plumbagina também inibe fortemente a atividade de oxidação da L-DOPA da tirosinase derivada de cogumelo, sugerindo que a plumbagina suprime a melanogênese inibindo diretamente a atividade da tirosinase (Figura 4B). Além disso, uma elevação significativa nas atividades de eliminação de radicais usando um ensaio de 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) foi observada em amostras tratadas com vitamina C e plumbagina em concentrações variando de 0.1 para 5mg/mL. Consequentemente, 5 mg/mL de plumbagina exibiram um efeito semelhante na atividade de eliminação de radicais aos de 0,1 mg/mL de vitamina C (Figura 4C).

2.5. Plumbagina não é tóxica em queratinócitos normais e células epiteliais do cristalino

Como cosméticos como creme para a pele são para uso externo e a citotoxicidade pode causar problemas de pele, investigamos ainda se a plumbagina é tóxica para queratinócitos normais (HaCaT) e células epiteliais do cristalino (B3) e se pode ser útil para o desenvolvimento de clareamento da pele cosméticos. Consequentemente, descobrimos que concentrações mais baixas de plumbagina (1–5 µM) não causam toxicidade em células HaCaT e B3, mas são eficazes na inibição da síntese de melanina (Figura 5A). Além disso, a plumbagina não induziu H2AX relacionada a danos no DNA e reduziu as proteínas poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e caspase{10}} relacionadas à apoptose celular em células HaCaT e B3 (Figura 5B), sugerindo que a plumbagina pode ser aceitável para uso em produtos de clareamento da pele sem exibir qualquer toxicidade dérmica

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