Análise Fitoquímica, Antiproliferativo In Vitro, Antioxidante Parte 1

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Fundo:Rumex rothschildianus é o único membro de uma seção única do gênero Rumex, na família Polygonaceae. Esta espécie é um pequeno anuário dióico muito raro, endémico da Palestina que é tradicionalmente utilizado como alimento e para o tratamento de várias doenças. Portanto, a presente investigação teve como objetivo rastrear os constituintes químicos, antioxidantes, anti-a-amilase, anti-a-glicosidase, antecipação e efeitos citotóxicos de quatro frações de solventes de folhas de R. rothschildianus.

Métodos:O pó seco de folhas de R. rothschildianus foi extraído em quatro solventes com diferentes polaridades. Vários testes fitoquímicos qualitativos e quantitativos foram realizados para determinar os componentes dos extratos. A análise colorimétrica foi utilizada para a determinação quantitativa de fenóis, flavonóides e taninos. Ensaios in vitro foram realizados para avaliar os extratos quanto às atividades antioxidante, anti-a-amilase, anti-a-glicosidase e antecipar as atividades inibitórias, bem como a citotoxicidade pelo ensaio MTS contra linhagem celular de carcinoma cervical (HeLa) e linhagem celular de câncer de mama (MCF7).

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Resultados:A fração acetona das folhas de R. rothschildianus apresentou a maiorantioxidanteatividade, devido ao maior teor de flavonóides e fenólicos, com um valor de ICso de 6,3±0,4 ug/ml, comparado a 3,1±0,9 ug/ml para Trolox, e em relação atividade de inibição da lipase a fração acetona apresentou a atividade mais potente com um valor de ICso de 26,3±{{10}},6 ug/ml, em comparação com o controle positivo de orlistat ICso de 12,3 ug/ml. O mesmo extrato foi o inibidor mais potente de a-amilase e a-glicosidase, com valores de ICso de 19,1±0,7 ug/ml e 54,9±0,3 ug/ml, respectivamente, comparados a 28,8, 37,1±0,3 ug/e de acarbose, respectivamente. A fração hexânica apresentou 99,9 por cento de inibição de células HeLa e 97,4 por cento de inibição de células MCF7.

Conclusão:A fração acetona das folhas de R. rothschildianus pode fornecer uma fonte de compostos bioativos para o tratamento do estresse oxidativo. Da mesma forma, a fração hexânica indica o potencial antitumoral promissor de R. rothschildianus. Claramente, essas indicações iniciais precisam de purificação adicional de compostos potencialmente ativos e, finalmente, estudos in vivo para determinar sua eficácia.

Palavras-chave:Rumex rothschildianus, Antioxidante, Lipase, Amilase, Trolox, Fitoquímica, Atividade antiproliferativa

Fundo

As plantas têm sido usadas como terapias desde os tempos antigos. Raízes, sementes, cascas, folhas e flores têm sido usadas para fins curativos. Nos dias atuais, os medicamentos sintéticos estão disponíveis e são eficazes no tratamento de uma ampla gama de doenças; no entanto, algumas pessoas ainda preferem medicamentos fitoterápicos, pois são vistos como menos prejudiciais ao corpo humano [1,2]. As plantas medicinais são, por definição, a fonte de compostos fitoquímicos que possuem atividades terapêuticas. Essas propriedades dependem da presença de diferentes metabólitos secundários, como fenólicos, terpenóides e alcalóides [3]. Rumex rothschildianus Aarons. é o único membro de uma seção única do gênero Rumex, na família Polygonaceae. Esta espécie é uma pequena dioica anual muito rara, endêmica na Palestina. Tem uma altura média de 45 cm e é caracterizada por caules eretos com folhas pecioladas radicais, que são curtas-hasta na base e curto-acuminadas no ápice. As flores têm um diâmetro de 3-4 mm, enquanto as flores pistiladas têm cerca de 2 mm de diâmetro com uma camada membranosa coriácea [4]. Rumex spp. são comuns em diferentes regiões da Turquia e são representados por 22 espécies. Algumas das espécies mais comuns são R. patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus e R. caucasicus são plantas perenes distribuídas no centro e leste da Anatólia a uma altitude de {{10 }} m acima do nível do mar. O gênero Rumex tem sido amplamente utilizado na medicina tradicional na Turquia para tratar distúrbios, como constipação, diarreia e eczema [5, 6]. O gênero também possui alguns efeitos laxativos, diuréticos, antipiréticos, cicatrizantes e anti-inflamatórios. Muitas pessoas na parte oriental da Turquia usam as folhas jovens de Rumex spp. como conservante em queijos, além de dar aroma aos alimentos [7].

Uma variedade de pesquisas foi realizada em espécies de Rumex, como atividades antimicrobianas sendo relatadas para algumas espécies. Alguns fitoquímicos bioativos já foram encontrados no Rumex vicário L, como carotenóides, tocoferóis, polifenóis, flavonóides e ácido ascórbico, que têm um papel como antioxidantes e agentes desintoxicantes naturais. A ingestão dietética de fitoquímicos antioxidantes, como carotenóides,fenólicos, eflavonóidespode proteger contra doenças não transmissíveis em humanos, como câncer, distúrbios cardiovasculares e outros problemas de saúde relacionados ao estresse oxidativo [5, 8]. Os radicais livres nocivos são conhecidos por desempenhar um papel importante em muitos dos principais problemas de saúde, como câncer, doenças cardiovasculares, artrite reumatóide, catarata,doença de Alzheimer, e outras doenças degenerativas relacionadas ao envelhecimento. Os antioxidantes são componentes benéficos que neutralizam esses radicais livres antes que eles possam atacar as células e, portanto, previnem danos às proteínas celulares, lipídios e proteínas.carboidratos. Uma variedade de antioxidantes naturais e sintéticos tem sido proposta para o tratamento de doenças humanas. Tal interesse no papel dos antioxidantes na saúde humana tem motivado pesquisas nas áreas de ciência de alimentos e ervas medicinais, avaliando a função das ervas como antioxidantes. A ação antioxidante inclui capacidade de eliminação de radicais livres, inibição da peroxidação lipídica, capacidade quelante de íons metálicos e também capacidade redutora [9,10].

O câncer é um dos problemas de saúde mais globais. O desenvolvimento e a descoberta de novos medicamentos anticancerígenos continuam sendo extremamente importantes devido a vários fatores. Esses fatores incluem tratamentos que podem causar efeitos colaterais importantes ou podem ser bastante caros. Alternativas biologicamente mais seguras e mais acessíveis ainda são altamente desejáveis ​​[11-14].

Várias espécies vegetais são consideradas fontes potenciais de moléculas bioativas, como atropina das folhas de Belladonna, cocaína das folhas de coca, vincristina da planta Vinca e muitas outras que ainda desempenham um papel importante na medicina moderna [15,16].

Efeitos terapêuticos úteis podem vir da mistura de produtos secundários presentes em plantas medicinais. Esses compostos são principalmente metabólitos secundários, como alcalóides, esteróides, taninos, flavonóides e fenólicos, que são sintetizados e depositados em partes específicas dessas plantas [17,18]. O presente estudo investiga as atividades in vitro anti-a-amilase, anti- -glicosidase, antilipase, antiproliferativa e antioxidante de diferentes frações extraídas das folhas de R. rothschildianus.

Métodos

Material vegetal, produtos químicos e instrumentos

As folhas de R. rothschildianus foram colhidas nas regiões ocidentais da Palestina, entre fevereiro e março de 2018. Elas foram identificadas pelo Dr. Nidal Jaradat, do Laboratório de Farmacognosia da Universidade Nacional An-Najah, sob o código de espécime voucher Pharm-PCT{{3} }. Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Um espectrofotômetro-UV/Visible (Jenway grau 7135, Stafford-shire, Reino Unido), papéis de filtro (Whitman No. 1, Washington, EUA), dispositivo agitador (Memmert 531-25-1, Estocolmo, Suécia), aparelho rotavap (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Alemanha), moedor (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, China), balança eletrônica (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Polônia), liofilizador-BT85 (Millrock Technology, China) e crio-dessecador (Mill-rock technology, BT85, Kingston, EUA) foram usados.

Preparação de extratos e fracionamento

O pó seco das folhas de R. rothschildianus foi extraído pela adição de solventes sequencialmente com base em sua polaridade, começando com o solvente não polar hexano e depois acetona (um solvente orgânico aprótico polar), metanol (álcool polar) e, finalmente, água destilada (a solvente polar prótico). Para cada extração, cerca de 25g de folhas secas moídas foram colocadas em 00,51 hexano por 72h em um agitador a 100 rotações por minuto a 25 graus. Primeiramente, o hexano foi substituído por 0,5 L de acetona e, posteriormente, a substituição envolveu volumes equivalentes de metanol e água. As incubações nos solventes foram como descrito acima para hexano. Cada fração orgânica foi filtrada e concentrada sob vácuo em um evaporador rotativo, enquanto a fração aquosa foi seca usando um liofilizador. Finalmente, todas as frações brutas foram armazenadas a 4 graus [19,20].

O rendimento de cada fração foi calculado usando a seguinte fórmula:

Avaliação fitoquímica preliminar

Testes de triagem fitoquímica de folhas de R. rothschildianus em quatro frações foram realizados para identificar metabólitos secundários ativos. Os resultados qualitativos foram expressos como ( mais ) para a presença e (-) para a ausência de fitoquímicos bioativos[10,21].

Determinação do conteúdo fenólico total (TPC)

O procedimento para determinar a CPT foi baseado no de Cheung et al. O TPC foi expresso em miligramas de equivalentes de ácido gálico por grama de peso seco de folhas (mg GA/g peso seco). A solução de carbonato de sódio a 7,5% recém-preparada foi feita colocando 7,5g de Na2CO3 em um balão volumétrico e ajustando o volume para 1{16}}0ml com água destilada. Uma solução padrão de referência (solução de ácido gálico) foi preparada dissolvendo 100mg de ácido gálico em água destilada até um volume final de 100ml. A partir disso, uma diluição seriada foi realizada para obter soluções de ácido gálico a 100,70,50,40 e 10ug/ml）. As soluções estoque das frações das folhas foram preparadas dissolvendo 100mg de extrato vegetal em água destilada e ajustadas para um volume total de 100ml. As misturas reaccionais foram preparadas misturando 0,5 ml de cada solução de fracção com 2,5 ml de reagente de Folin-Ciocalteu a 10 por cento, que foi dissolvido em água com 2,5 ml de bicarbonato de sódio a 7,5 por cento. Os tubos de amostra foram incubados por 45 min a 45 graus. Em seguida, a absorbância de cada um foi medida em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 765 nm. As amostras de trabalho foram preparadas em triplicata para cada ensaio analítico, a partir do qual foram calculados os valores de média e desvio padrão [21].

Determinação do conteúdo total de flavonóides (TFC)

O TFC nas quatro frações foliares de R. rothschildianus foi avaliado usando uma curva de calibração de rutina (composto padrão de referência). Os resultados foram expressos em miligramas de equivalente de rutina por grama de peso seco de extrato de folhas (mg RU/g peso seco). Uma curva de calibração para rutina foi estabelecida usando diluições em série geradas a partir de uma solução estoque de 1{{10}}0 ug/ml. Para fazer a solução estoque, 10 mg de rutina foram dissolvidos em 10 ml de água destilada e depois diluídos para 100 ml. Subsequentemente, a solução estoque foi diluída para fornecer rutina em concentrações de 10, 30, 40,50,70 e 100 ug/ml. Para a preparação da solução de trabalho, 0,5 ml de cada solução de fração foi misturado com 3 ml de metanol, 0,2 ml de 10 por cento de AlCl3, 0,2 ml de acetato de potássio 1 M e 5 ml de água destilada, e então incubados à temperatura ambiente por 30 min. As etapas anteriores foram repetidas para cada uma das frações, após o que, a absorbância foi medida em um comprimento de onda de 415 nm. Para um controle em branco, uma solução de trabalho foi preparada com água destilada no lugar do extrato da amostra. As amostras foram preparadas em triplicata para cada ensaio analítico, a partir do qual foram calculados os valores de média e desvio padrão [22].

Determinação do teor de tanino total (TTC) O protocolo de Sun et al. foi utilizado para determinar o CTT nas quatro frações foliares de R. rothschildianus, sendo o procedimento mais utilizado. A catequina foi usada como composto de referência para construir uma curva de calibração. Um estoque de 100ug/ml em metanol foi preparado, a partir do qual uma série de diluição foi gerada para fornecer concentrações de catequina de 10, 30, 50,70 e 100 ug/ml. Uma solução de 4 por cento de vanilina em metanol foi preparada de fresco. As soluções estoque das frações a 100 ug/ml foram preparadas usando metanol como solvente. Para a solução de trabalho, misturou-se 0,5ml de cada solução fracionada com 3ml de solução de vanilina e 1,5ml de HCl concentrado. A mistura foi deixada em repouso por 15 min e, em seguida, a absorbância a 500 nm foi medida, usando uma solução de trabalho preparada com metanol no lugar do extrato da amostra como branco. Todas as amostras de trabalho foram analisadas em triplicata, a partir das quais foram calculados os valores de média e desvio padrão. O tanino total em cada fração foi expresso em equivalentes de catequinas (mg de CAE/g peso seco das folhas)[23].

Método de atividade antioxidante

O ensaio de sequestro do radical 2,2-difenil-picrilhidrazil (DPPH) livre foi utilizado para medir a atividade antioxidante nas diferentes frações das folhas de R. rothschildianus. Uma solução estoque de 1000ug/ml de cada fração da planta foi preparada em metanol. Além disso, também foi preparada uma solução de 1000 ug/ml de Trolox (o padrão de referência). Uma série de diluições foi preparada a partir das soluções estoque para cada fração, dando seis diluições em série a 2, 5, 10,20, 50 e 100 µg/ml. Um ml de cada diluição de extrato foi misturado com 1 ml de 0,002 g/ml de DPPH em metanol. Um ml de metanol foi adicionado para dar um volume de trabalho final de 3 ml. A solução de DPPH foi preparada na hora, pois era muito sensível à luz. O controle em branco das concentrações da série foi DPPH em metanol na proporção de 1:2, sem adição de extrato. Todas as soluções de trabalho foram incubadas à temperatura ambiente (25 graus) no escuro durante cerca de 30 min. As densidades ópticas foram então medidas com um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 517 nm. A seguinte equação foi usada para calcular a porcentagem de inibição de DPPH para cada fração de planta, com Trolox como o composto padrão:

onde, Ag é a absorbância registrada da solução em branco e Ats é a absorbância registrada da solução da amostra testada [21].

Ensaio de inibição da lipase pancreática suína

Soluções de estoque de 500 ug/ml foram feitas de cada fração de planta em 10 por cento de DMSO. A partir destes, foi feita uma série de diluições de cinco concentrações de 50.100.200, 300 e 400 ug/ml. Uma solução estoque de 1 mg/ml de lipase pancreática porcina em tampão Tris-HCl foi preparada de fresco imediatamente antes do uso. O substrato, butirato de p-nitrofenil (PNPB) foi preparado dissolvendo 20,9 mg em 2 ml de acetonitrila. Para cada solução de trabalho, 0,1 ml de lipase pancreática porcina foi misturado com 0,2 ml de fração vegetal de cada membro da série de diluição. Tris-HCl foi adicionado para perfazer o volume final das soluções de trabalho de 1 ml, e elas foram incubadas a 37°C por 15 min. Após a incubação, adicionou-se 0,1 ml de solução de butirato de p-nitrofenilo a cada tubo de ensaio. A mistura foi então incubada por mais 30 minutos a 37 graus. A atividade da lipase pancreática foi determinada medindo a hidrólise de PNPB em p-nitrofenolato a 410 nm, usando um espectrofotômetro UV. O mesmo procedimento foi repetido usando orlistat como composto de referência padrão. A porcentagem de inibição de lipase por frações de plantas foi calculada com a seguinte equação:

onde, Ap é a absorbância registrada da solução em branco e Ats é a absorbância registrada da solução da amostra testada [24]. Ensaio inibidor de a-amilase

A100 mg de cada fração foi dissolvido em alguns milímetros de 10 por cento de DMSO e, em seguida, dissolvido até 100ml em 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4, NaCl 0,006M, pH 6,9 para dar finalmente soluções estoque com concentrações de 1000 ug/ml. A partir destas, prepararam-se as seguintes diluições de 10,50,70,100 e 500 ug/ml, utilizando 10 por cento de DMSO como diluente. Um volume de 0,2 ml de 2 unidades/ml de amilase pancreática porcina foi misturado com 0,2 ml

fração da planta e foi incubada por 10min a 30 graus . Após a incubação, adicionou-se 0,2ml de uma solução de amido a 1% recém-preparada em água e os tubos foram então incubados por pelo menos mais três minutos. Neste ponto, a reação foi interrompida pela adição de 0,2ml de reagente corante 3,5-ácido dinitro salicílico (DNSA) e foi diluído com 5ml de água destilada, antes de ser aquecido a 90 graus por 10 min em água banho. A mistura foi então arrefecida até à temperatura ambiente e a absorvância foi medida a 540 nm. O controle em branco foi preparado usando as mesmas quantidades descritas acima, mas substituindo a fração vegetal por 0,2ml de tampão. A acarbose foi usada como referência padrão seguindo o procedimento descrito acima. a atividade inibitória de a-amilase foi calculada usando a seguinte equação:

onde, Ag: é a absorbância da amostra em branco e Ar é a absorbância da amostra de teste [25].

Este artigo é extraído de Jaradat et al. BMC Medicina Complementar e Terapias (2021) 21:107