Como o inibidor de fosfoinositide 3-quinase Alpelisib é usado para a síndrome de Lowe/doença de dente?

O inibidor de fosfoinositide 3-quinase alpelisib restaura a organização da actina e melhora a disfunção do túbulo proximal in vitro e em um modelo de camundongo com síndrome de Lowe e doença de Dent

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Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valéria Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6e Jennifer L. Gallop^2,6

PALAVRAS-CHAVE: citoesqueleto; endocitose; lipídios; Túbulo proximal; Síndrome de Fanconi renal

Mutações de perda de função no gene OCRL, que codifica a fosfatidilinositol [PI] 4,5-bifosfato [PI(4,5)P2] 5-fosfatase OCRL, causam endocitose defeituosa e disfunção do túbulo proximal dentroSíndrome de Lowe e doença de Dent2. O defeito é devido ao aumento dos níveis de PI(4,5)P2 e polimerização aberrante de actina, bloqueando o tráfego endossomal. PI 3-fosfato [PI(3)P] foi recentemente identificado como um coativador com PI(4,5)P2 na via da actina. Aqui, testamos a hipótese de quefosfoinositídeo 3-quinaseOs inibidores (PI3K) podem resgatar o defeito endocítico transmitido pela perda de OCRL, reequilibrando os sinais de fosfoinositida para a maquinaria de actina. O PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)inibidor copanlisib e classe IA p110a PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase) inibidor alpelisibepolimerização aberrante de actina reduzida em células renais humanas deficientes em OCRL in vitro. Os níveis de PI 3,4,5-trifosfato, PI(4,5) P2 e PI(3)P foram todos reduzidos com o tratamento com alpelisib, e o knockdown de siRNA da subunidade catalítica PI3K p110a fenocopiou o fenótipo de actina. Em um modelo de camundongo OcrlY/- humanizado, o alpelisibe reduziu a coloração de actina endossomal enquanto restaurava a arquitetura da fibra de estresse e os níveis de megalina na membrana plasmática das células do túbulo proximal, refletido pela melhor absorção endocítica de proteínas de baixo peso molecular in vivo. Assim, nossos achados apoiam a ligação entre os lipídios fosfoinositídeos, a polimerização da actina e o tráfego endocítico no túbulo proximal e representam uma prova de conceito para o reaproveitamento de alpelisibe emSíndrome de Lowe/doença de Dent2.

Declaração de tradução

Síndrome de Lowe e doença de Dent2, causada por mutações no lipídio fosfoinositide 5-fosfatase OCRL, manifesta-se com disfunção do túbulo proximal e proteinúria de baixo peso molecular com apenas cuidados de suporte disponíveis. Nossos achados revelam que afosfoinositídeo 3-quinase inibidor alpelisibe, atualmente aprovado para terapia do câncer, alivia o equilíbrio aberrante de fosfoinositida e o fenótipo de actina associado à perda de OCRL, causando uma melhora substancial da maquinaria endocítica e capacidade de absorção em sistemas celulares e um modelo de camundongo humanizado para síndrome de Lowe/doença de Dent 2. Dado seu aparente perfil de segurança, o alpelisibe é um candidato promissor para o reaproveitamento de medicamentos emSíndrome de Lowe e doença de Dent.

As células epiteliais que revestem os túbulos proximais (TPs) do rim possuem uma via endolisossomal mediada por receptor eficiente que recupera e processa substâncias essenciais que são filtradas através do glomérulo. Distúrbios congênitos que afetam os endolisossomos causam disfunção do PT (síndrome de Fanconi renal) com perda urinária de solutos e proteínas de baixo peso molecular (LMW), muitas vezes complicadas por complicações metabólicas e de crescimento e desenvolvimento de doença renal crônica.¹A mutação inativadora no OCRL tem sido associada à doença de Dent 2 (MIM #300555), um distúrbio caracterizado por disfunção do PT, cálculos renais e insuficiência renal progressiva, e à síndrome oculocerebrorrenal de Lowe (MIM #309000), que apresenta, além à disfunção do PT e insuficiência renal, manifestações sistêmicas como catarata congênita, deficiência cognitiva e hipotonia.^2-4Os tratamentos atuais para a doença de Dent 2 e a síndrome de Lowe são apenas de suporte.

Figura 1|PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)inibidores aliviam a montagem aberrante de actina em endossomos em um modelo de célula de rim humano deficiente em OCRL (HK2). (a) Etapas de conversão de lipídios de fosfoinositida relevantes para este estudo, indicando as conversões entre PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 e PI(3)P com as enzimas mais relevantes em negrito, mais relevantes conversões em linhas sólidas e outras em linhas tracejadas. PI(4,5)P2 é elevado na síndrome de Lowe devido à falta de atividade de 5-fosfatase de OCRL e é feito a partir da fosforilação de PI por fosfatidilinositol 4-quinases (PI4Ks) e PI(4) P 5-quinase (PIP5K). PI(4,5)P2 é fosforilado por PI3Ks de classe I para produzir PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 pode ser desfosforilado em PI(4,5)P2 por PTEN ou em PI(3,4)P2 por SH-2-contendo inositol 50 polifosfatos (SHIP) 1 e 2, sinaptojanina 1 e 2, e também OCRL, embora isso seja (continuação)

Figura 1|(continuação) pensado para ser menor. PI(3,4)P2 é desfosforilado em PI(3)P por inositol polifosfato-4-fosfatase tipo IA (INPP4A) e B. PI(3)P também é feito em endossomos através da fosforilação de PI pela classe III PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase), proteína de classificação vacuolar Vps34. (b) Western blots que ilustram a perda de expressão de OCRL na linha celular HK2 OCRL CRISPR knockout (KO) em comparação com células de controle HK2 de tipo selvagem (WT) com tubulina como controle de carga. (c–e) Micrografias confocais Airyscan representativas e quantificação do antígeno de endossoma precoce 1 (EEA1)/sobreposição de actina (expresso como uma porcentagem do total de vesículas EEA1+ detectadas) para células HK2 WT ou OCRL KO tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO) (d) ou o inibidor indicado e fixado com o fixador de formaldeído a 4 por cento. Em todos os casos, as imagens ilustram um único z-slice de uma pilha confocal de células confocais processadas com Airyscan imunomarcadas para EEA1 (amarelo), faloidina (actina, magenta) e 40,6-diamidino{ {14}}fenilindol (DAPI) (ciano). Barras=5 mm. Nas quantificações, as linhas indicam a média±SEM e cada ponto de dados é uma célula individual. Em todos os experimentos, os tratamentos foram aplicados 16 horas antes da fixação. Em todas as quantificações, a significância estatística foi avaliada por uma análise de variância de Kruskal-Wallis (KW) com o teste de comparações múltiplas de Dunn. (c) células WT ou KO tratadas com DMSO ou 100 nM de copanlisib, demonstrando resgate da sobreposição actina-endossomal. Teste KW: ***P < 0.0{{50}}1,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" copanlisibe="" ambos="" ***p=""><0.001, wt="" copanlisibe="" versus="" ko="" copanlisibe="" p="0.44" (não="" significativo="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" e="" 63="" células="" para="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisibe,="" ko="" dmso="" e="" ko="" copanlisibe,="" respectivamente.="" (d)="" células="" wt="" ou="" ko="" tratadas="" com="" dmso="" ou="" 10="" mm="" de="" alpelisib,="" demonstrando="" resgate="" da="" sobreposição="" actina-endossomal.="" teste="" kw:="" ***p="">< 0,001,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" ambos="" ***p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" versus="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 e 41 células para WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO e KO alpelisib, respectivamente. (e) células WT ou KO tratadas com DMSO, 10 mM de GSK2636771 ou 10 mM de idelalisib, demonstrando que nenhum dos compostos é capaz de reduzir significativamente a sobreposição actina-endossomal. Teste KW: ***P < 0,001,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ***p=""><0,001, ko="" dmso="" versus="" ko="" gsk,="" *p="0,04," ko="" dmso="" versus="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 e 145 células para WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771 e KO idelalisib, respectivamente. Para otimizar a visualização desta imagem, consulte a versão online deste artigo em www.kidney-international.org

Como o inibidor de fosfoinositida 3-quinase alpelisibe é usado para a síndrome de Lowe/doença de Dent?

A proteinúria de LMW é uma característica consistente observada na síndrome de Lowe/doença de Dent 2, revelando que o OCRL afeta a endocitose mediada por receptor.⁵OCRL codifica a fosfatidilinositol (PI) 4,5-bifosfato [PI(4,5)P2] 5- fosfatase OCRL,⁶que controla a identidade lipídica na via endolisossomal pela degradação de PI(4,5)P2 (Figura 1a). A degradação deficiente de PI(4,5)P2 através de OCRL está implicada na falha em desrevestir vesículas revestidas de clatrina em fibroblastos, acompanhada pela formação de estruturas "cometas" de actina filamentosa polimerizada a partir de organelas semelhantes a endossomos precoces resultantes.^7-9Em outros tipos de células, mais notavelmente nas células PT do rim, a deficiência de OCRL resulta em estruturas de "cesta" de actina F em torno de organelas endolisossomais aberrantes.¹⁰O excesso de F-actina bloqueia o tráfego de membrana através da via endocítica e endolisossomal, e é sugerido para diminuir a reciclagem do receptor multiligante megalina para a membrana apical, agravando o defeito dentro da via endolisossomal.¹¹De acordo com o papel principal da actina F aberrante, a captação endocítica defeituosa causada por mutações OCRL é aliviada pelo direcionamento da maquinaria de actina com latrunculina B, ou pela depleção das proteínas reguladoras da actina, bem como pela depleção mediada por RNA pequeno e interferente (siRNA) de PI(4)P 5-quinase para ajustar a síntese de PI(4,5)P2^7,10(Figura 1a).

A polimerização da actina é cada vez mais entendida como resultante não apenas do PI(4,5)P2, mas também de outros lipídios fosfoinositídeos. Por exemplo, PI(3,4,5)P3 ativa a GTPase Rac do tipo Rho, e PI(3)P atua em conjunto com PI(4,5)P2 para estimular a polimerização de actina a jusante de outra GTPase do tipo Rho, Cdc42.^12-14A interconversão desses fosfoinositídeos é acoplada ao movimento dos lipídios pela via endocítica e endossomal. PI(4,5)P2 é fosforilado pela classe I fosfatidilinositol- 30 -quinase (PI3K) em PI(3,4,5)P3 na membrana plasmática e torna-se progressivamente desfosforilado em PI(3,4)P2 e PI (3)P ou PI(4,5)P2.^14,15O PI(3)P é enriquecido nos endossomos, onde é essencial para sua função e predominantemente feito por fosforilação direta do PI pela classe III PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase), Vps34¹⁶(Figura 1a). Em uma linha de células epiteliais pigmentadas da retina (RPE) deficientes em OCRL, os cometas de actina gerados são reduzidos pelo tratamento com PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)inibidores wortmannin e Vps34-IN1, de acordo com estudos bioquímicos mostrando uma co-regulação de actina através da coincidência de PI(3)P e PI(4,5)P2.¹⁴

O resgate da endocitose observada ao direcionar a maquinaria de actina em pacientes OCRL e células knockout (KO),^7,10juntamente com regulação upstream de actina por PI3K (fosfoinositídeo 3-quinase)atividade¹⁴e a natureza altamente interconectada da conversão de PI, oferece uma possibilidade intrigante de que a classe I PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)inibidores podem ser úteis na síndrome de Lowe. Esses inibidores, desenvolvidos para a terapia do câncer, são aprovados para uso clínico¹⁷e são, portanto, potencialmente passíveis de reaproveitamento de drogas. Embora compostos como copanlisib¹⁸têm ampla especificidade e efeitos colaterais, o sucesso recente foi demonstrado para inibidores mais específicos. Idelalisibe,¹⁹que tem como alvo PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)subunidade p110d, é aprovado para linfoma linfocítico crônico, e alpelisib, que tem como alvo p110a, é aprovado para uso em câncer de mama.^20,21Além disso, o alpelisibe mostrou benefício clínico em crianças com síndrome PROS/CLOVES,²²uma rara síndrome de supercrescimento resultante da ativação de PIK3A.

Aqui, testamos a hipótese de que a classe I PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)os inibidores podem resgatar o defeito endocítico devido à perda de OCRL, usando modelos celulares e de camundongos estabelecidos.^10,11,23Mostramos que a inibição de PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)A atividade via copanlisib ou alpelisib, ou a depleção mediada por siRNA da subunidade catalítica alvo de alpelisib p110a reduz o excesso de polimerização de actina em células de rim humano (HK2) deficientes em OCRL. Focando no alpelisib como o composto mais específico para uso clínico, mostramos que ele reduz a polimerização da actina e melhora a captação pela via endolisossomal em células PT de Ocrl humanizado^Y/-camundongos in vitro. Além disso, o tratamento com alpelisib in vivo alivia a proteinúria, reduz a disfunção de PT e resgata os níveis celulares de megalina em Ocrl humanizado^Y/-ratos. Esses resultados apoiam o alpelisibe como candidato para reaproveitamento de drogas emSíndrome de Lowe e doença de Dent 2.

Figura 2|Os efeitos do alpelisib na actina são responsivos à dose e recapitulados pelo siRNA de PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)p110a. (a) Micrografias confocais Airyscan representativas (fixadas usando o fifix de formaldeído a 4 por cento e imunomarcadas para o antígeno de endossoma precoce 1 [EEA1], amarelo; actina [faloidina], magenta; e 4{{40}}},{{ 5}}diamidino-2-fenilindol [DAPI], ciano; barras=5 mm) e quantificação de células de rim humano de tipo selvagem (WT) ou knockout (KO) (HK2) tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO) ou as doses indicadas de alpelisibe por 16 horas, demonstrando resgate responsivo à dose da sobreposição actina-endossomal. Em todos os casos, as linhas indicam média±SEM e os pontos indicam células individuais. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 e 67 células para controle WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , e KO 2,5, 5, 10, 15, 25 e 50 mM alpelisib, respectivamente. Significância estatística avaliada pelo teste de Kruskal-Wallis (KW) com teste de comparações múltiplas de Dunn: global ***P < 0,001,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" e="" 50="" mm="" alpelisibe="" todos="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisibe="" *p="0,0131," ko="" dmso="" versus="" ko="" 10="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" versus="" wt="" 10="" e="" 50="" mm="" alpelisib="" p=""> 0,9999 (não significativo [ns]). (b) Western blot para p110a e o controle de carregamento de a-tubulina de células WT ou KO tratadas com siRNA scramble (Scram.) ou p110a. (c) Micrografias confocais Airyscan representativas (fixadas usando a fixação de formaldeído a 4% e imunomarcadas para EEA1, amarelo; actina [faloidina], magenta; e DAPI, ciano; barras =5 mm) e quantificação de células WT ou KO tratadas com siRNA scramble (S) ou p110a, demonstrando redução da sobreposição de actina EEA{60}}na depleção de p110a. Teste KW com teste de comparações múltiplas de Dunn: ***P < 0,001,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" scramble="" versus="" ko="" scramble,="" ko="" scramble="" versus="" ko="" p110a="" sirna="" ambos="" ***p="">< 0,001.="" n="79," 108,="" 93="" e="" 131="" células,="" respectivamente.="" hk2,="" rim="" humano;="" pi3k,="" fosfatidilinositol-30="" -quinase;="" sirna,="" rna="" pequeno="" e="" interferente.="" para="" otimizar="" a="" visualização="" desta="" imagem,="" consulte="" a="" versão="" online="" deste="" artigo="" em="">

Figura 3|Os níveis de fosfatidilinositol (PI) 4,5-bifosfato [PI(4,5)P2] são elevados com nocaute OCRL (KO) e PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 , e PI(3)P são suprimidos pelo tratamento com alpelisib. Em todos os experimentos, os tratamentos indicados foram aplicados 16 horas antes da fixação. Nas quantificações, as linhas indicam a média±SEM, e cada ponto de dados resulta de uma célula individual. Em todas as quantificações, a significância estatística foi avaliada por uma análise de variância de Kruskal-Wallis (KW) com o teste de comparações múltiplas de Dunn. Barras=20mm em todas as imagens. (a) Micrografias de campo amplo representativas de células de rim humano de tipo selvagem (WT) ou KO (HK2) tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO) ou 10 mM de alpelisib e depois fixadas com o fixador da membrana plasmática e imunomarcadas para PI(3,4,5 )P3 (vermelho) e 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ciano), com quantificação da intensidade média de marcação de PI(3,4,5)P3 celular, mostrando a eficácia do alpelisibe tratamento na síntese de PI(3,4,5)P3. N=96, 128 e 109 células para WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO e KO alpelisib, respectivamente. KW (continuação)

Figura 3|(continuação) teste: geral ***P < 0.001,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" e="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" todos="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" micrografias="" confocais="" representativas="" de="" células="" wt="" ou="" ko="" hk2="" tratadas="" com="" dmso,="" 10="" mm-,="" ou="" 50-mm="" alpelisib="" por="" 16="" horas="" e="" depois="" fixadas="" com="" o="" golgi="" fix="" e="" marcadas="" usando="" o="" m="" ch="" {{10}}sonda="" xfyve="" pi(3)p="" (magenta)="" e="" dapi="" (ciano),="" com="" quantificação="" do="" número="" de="" pontos="" pi(3)p="" positivos="" detectados="" em="" células="" tratadas="" com="" uma="" faixa="" de="" concentrações="" de="" alpelisibe="" ,="" conforme="" indicado,="" mostrando="" os="" pontos="" positivos="" para="" pi(3)p="" são="" reduzidos="" de="" uma="" forma="" responsiva="" à="" dose.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" e="" 215="" células="" para="" controle="" de="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" e="" ko="" 2,5,="" 5,="" 10,="" 25="" e="" 50="" mm="" de="" alpelisib,="" respectivamente.="" teste="" kw:="" geral="" ***p="">< 0,001,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" versus="" wt="" 10="" e="" alpelisib="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" todos="" ***p="">< 0,001;="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" e="" 5="" mm="" alpelisib="" ambos="" p=""> 0,9999 (não significativo [ns]); KO DMSO versus KO 10 mM alpelisib **P=0.0049; KO DMSO versus KO 25 mM alpelisibe ***P=0.0002. (c) Micrografias de campo amplo representativas de células WT ou KO HK2 tratadas com DMSO ou 10 mM de alpelisibe e depois fixadas com o fifix da membrana plasmática e imunomarcadas para PI(4,5)P2 (amarelo) e DAPI (ciano), com quantificação de a intensidade média de marcação de PI(4,5)P2 celular, mostrando aumento de PI(4,5)P2 de membrana plasmática em células KO, que é reduzido pelo tratamento com alpelisib, especificamente em células KO. N=126, 112, 85 e 116 células para WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO e KO alpelisib, respectivamente. Teste KW: geral ***P < 0,001,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" e="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" ambos="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" micrografias="" de="" campo="" amplo="" representativas="" de="" células="" wt="" ou="" ko="" hk2="" tratadas="" com="" dmso="" ou="" 10="" mm="" de="" alpelisibe="" e,="" em="" seguida,="" fixadas="" com="" o="" fixador="" de="" formaldeído="" a="" 4%="" e="" imunomarcadas="" para="" pi(4,5)p2="" (amarelo)="" e="" dapi="" (ciano),="" com="" quantificação="" do="" número="" de="" puncta="" pi(4,5)p2-positivo,="" mostrando="" aumento="" de="" puncta="" pi(4,5)p2="" em="" células="" ko,="" que="" é="" reduzido="" pelo="" tratamento="" com="" alpelisib,="" especificamente="" em="" células="" ko.="" n="75," 65,="" 52="" e="" 69="" células="" para="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" e="" ko="" alpelisib,="" respectivamente.="" teste="" kw:="" geral="" ***p="">< 0,001,="" comparações="" múltiplas;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" e="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" ambos="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, unidades arbitrárias. Para otimizar a visualização desta imagem, consulte a versão online deste artigo em www.kidney-international.org.

Como o inibidor de fosfoinositida 3-quinase alpelisibe é usado para a síndrome de Lowe/doença de Dent?

1. RESULTADOS

1.1 Inibidores de PI3K Classe I reduzem a agregação de actina em células OCRL-KO HK2

Usamos a edição do gene CRISPR-Cas9 para nocautear (KO) OCRL na linhagem de células HK2 para permitir o teste da classe I PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)inibidores da agregação de actina característica nos compartimentos endolisossomais.^7,9,10,14Western blotting verificou uma redução de 98,0± 0,7 por cento na expressão de OCRL em lisados ​​das células KO HK2 (Figura 1b). O OCRL KO recapitulou o fenótipo de cesta de actina nas células HK2, conforme indicado por uma sobreposição aumentada entre F-actina e antígeno de endossoma precoce 1 (EEA1), quantificado em z-stacks de microscopia confocal Airyscan (Figura 1c–e). Esta sobreposição aumentada observada em células OCRL KO foi revertida pelo tratamento com copanlisib (C), um PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)inibidor que tem como alvo p110a e d e, em menor grau, as isoformas p110b e g (Figura 1c). Por Western blotting de extratos de células inteiras de HK2, descobrimos que o PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)As subunidades reguladoras de p110 a, b e d foram todas bem expressas em células de tipo selvagem (WT) e KO, com apenas níveis de traços da isoforma p110g presentes (Figura S1A suplementar).

Distinguimos o PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)especificidade da inibição de F-actina usando alpelisib (A), um inibidor seletivo de p110a, e GSK2636771 (G) e idelalisib (I), inibidores seletivos de p110b e p110d, respectivamente (Figura complementar S1A). Embora o tratamento com alpelisib tenha dado uma redução semelhante na polimerização de actina endossomal em comparação com copanlisib (Figura 1d), GSK2636771 e idelalisib tiveram um pequeno efeito no acúmulo de actina (Figura 1e). A classe I PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)os inibidores não apresentaram toxicidade aumentada em OCRL KO em relação a células não modificadas, com base no ensaio MTT (Figura Suplementar S1B).

1.2 Alpelisib e knockdown de p110a resgatam o fenótipo de actina em células HK2

Para nossos estudos subsequentes, nos concentramos no alpelisibe, pois é o PI3K mais seletivo e menos tóxico (fosfoinositídeo 3-quinase)inibidor desenvolvido até agora, e atualmente é usado para tratar uma superativação em mosaico de PI3K classe Ia em crianças com síndrome PROS/CLOVES.²²Alpelisib reduziu as cestas de actina em células OCRL KO HK2 de forma dose-responsiva (Figura 2a). Os efeitos foram observados na dosagem de 10 mM assim que 4 horas após o tratamento, sem toxicidade aparente (Figura S2 suplementar). Para testar se PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)a inibição por alpelisib foi a fonte da coloração de actina diminuída, reduzimos especificamente seu alvo, a subunidade p110a, usando siRNA (Figura 2b). Comparado com o tratamento com um siRNA de controle (embaralhado em sequência), o siRNA contra p110a rendeu uma depleção de 78,3 ± 4,8 por cento e 68,9 ± 7,7 por cento da proteína p110a em células WT e OCRL KO HK2, respectivamente, refletida por uma redução significativa nas cestas de actina ( Figura 2c).

1.3 Níveis reduzidos de PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 e PI(3)P em células HK2 tratadas com alpelisib

Para examinar como os lipídios fosfoinositide são afetados pelo tratamento com OCRL KO e alpelisib, coramos células HK2 com anticorpos ou domínios de proteína contra PI(3,4,5)P3, PI(3)P e PI(4,5)P2, usando condições de fixação otimizadas para a membrana plasmática ou coloração intracelular.^24,25PI(3,4,5)P3 tem uma localização difusa na membrana plasmática, e o tratamento com alpelisib (10 mM) induziu uma diminuição robusta na coloração para PI(3,4,5)P3 em células WT e OCRL KO, como esperado de seu mecanismo de ação e especificidade para classe IA PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)p110a (Figura 3a). Espera-se que o PI(3,4,5)P3 seja desfosforilado progressivamente à medida que as membranas são endocitadas e transportadas para os endossomos.^14,26,27Ao fixar células de modo que o PI(3)P intracelular seja preservado,²⁵descobrimos que PI(3)P punctae também foram reduzidos pelo tratamento com alpelisibe (de forma responsiva à dose aparente a partir de concentrações tão baixas quanto 10 mm para o tratamento 16-hora) em células WT e OCRL KO (Figura 3b e Figura Suplementar S2C). Como esperado, o KO de OCRL em células HK2 induziu um aumento acentuado nos níveis de PI(4,5)P2 tanto na membrana plasmática (Figura 3c) quanto intracelular (Figura 3d), em comparação com células WT.^10,28O tratamento com alpelisib reduziu marcadamente a elevação de PI(4,5)P2 gerada por OCRL KO em ambos os compartimentos, enquanto não teve efeito em células WT (Figura 3c e d). Alpelisib é relatado para inibir PI 4-quinase b com uma concentração inibitória de 50 por cento de 0,5 mM,¹⁹que é uma possível fonte da redução de PI(4,5)P2. Coletivamente, nossos dados sugeriram que alpelisib inibe a montagem de actina em endossomos OCRL KO através de um efeito biespecífico nos níveis de PI(4,5)P2 e PI(3)P.

Figura 4|Alpelisib alivia defeitos de actina Oral em Ocrl humanizado cultivado^Y/-PTCs de rato (m PTCs). (a) Micrografias confocais de projeção Z de intensidade máxima representativa de OcrlY/þ ou Ocrl^Y/-m PTCs tratados com dimetilsulfóxido (DMSO) ou 10 mM de alpelisibe por 16 horas e depois fixados com o fifix de formaldeído a 4% e imunomarcados para actina (faloidina) (branca) e 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (azul), com quantificação do grau em que as fibras de estresse estão presentes em cada condição, mostrando que as fibras de estresse perdidas em Ocrl^Y/-m Os PTCs são resgatados pelo tratamento com alpelisibe. As linhas indicam média±SEM e os pontos de dados indicam cada região de imagem: N=5 regiões de imagem por condição (cada uma contendo aproximadamente 15–20 células). A significância foi avaliada pela análise de variância (ANOVA) de 1-way comum com teste de comparação múltipla de Holm-Sidak, **P=0.001, comparações múltiplas; Ocrl Y/+ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO **

P=0.002, Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (não significativo [ns]). Barras=20mm. (b) Renderizações de superfície 3D representativas de alta ampliação de PTCs Ocrl m tratados com DMSO ou 10 mM de alpelisibe por 16 horas e depois fixados com o fixador de formaldeído a 4 por cento e imunomarcados para antígeno de endossoma precoce 1 (EEA1) (roxo), actina ( faloidina, amarelo) e DAPI (azul), e quantificação ilustrando o resgate da sobreposição actina-endossomal por alpelisib. Visualizações de ampliação menor indicando visões gerais de (continuação)

Figura 4|(continuação) essas regiões são mostradas na Figura Complementar S4B e nos Filmes Complementares S1–S3. As linhas indicam média±SEM. N=42, 47 e 45 campos selecionados aleatoriamente para OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO e Ocrl^Y/-þ condições de alpelisibe, respectivamente, em cada caso agrupadas de 4 rins de camundongo por condição. A significância foi testada por ANOVA de Kruskal-Wallis (KW) com teste de comparações múltiplas de Dunn: global ***P < 0.001,="" comparações="" múltiplas;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO e Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns). Barras=1 mm. (c) Micrografias confocais representativas de OcrlY/þ ou Ocrl^Y/-m PTCs tratados com DMSO ou 10-mM alpelisib e depois fixados com o fixador de Golgi e marcados usando a sonda m Ch-2xFYVE PI(3)P (magenta) e DAPI (ciano), com quantificação de o número de pontos positivos para PI(3)P detectados nas células. N=188, 177, 246 e 206 células de OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO e Ocrl^Y/-þ alpelisibe, respectivamente; as células foram reunidas de 3 rins orais por grupo. Teste KW: geral ***P < 0.001,="" comparações="" múltiplas;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib e Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib, todos ***P < 0.001.="" barras="20" mm.="" (d)="" micrografias="" confocais="" representativas="" de="" ocrly/þ="" ou="">^Y/-m PTCs tratados com DMSO ou 10 mM de alpelisibe por 16 horas, depois fixados com o fifix de formaldeído a 4% e imunomarcados para fosfatidilinositol (PI) 4,5-bifosfato [PI(4,5) P2] (amarelo) e DAPI (ciano), com quantificação do número de pontos PI(4,5)P2-positivos, mostrando aumento de pontos PI(4,5)P2 em Ocrl^Y/-células, que é reduzido pelo tratamento com alpelisib. N=477, 444, 423 e 494 de OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO e Ocrl^Y/-þ alpelisibe, respectivamente; as células foram reunidas de 3 rins orais por grupo. Teste KW: geral ***P < 0.001,="" comparações="" múltiplas;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib e Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib, todos ***P < 0.001.="" barras="20" mm.="" para="" otimizar="" a="" visualização="" desta="" imagem,="" consulte="" a="" versão="" online="" deste="" artigo="" em="">

1.4 Alpelisib reduz fosfoinositídeos intracelulares e alivia defeitos do citoesqueleto em Ocrl^Y/-m PTCs

Em seguida, testamos se alpelisib teve os mesmos efeitos em células primárias de células PT derivadas do modelo de camundongo humanizado com deficiência de Ocrl (Ocrl^Y/-), que recapitula a polimerização anormal da actina e o defeito endocítico observado nas células derivadas do paciente.^10,11Os PTCs de camundongos (m PTCs) se expressaram de forma semelhante à classe I PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase) subunidades reguladoras para células HK2 em WT e Ocrl^Y/-camundongos e exibiram um perfil de toxicidade semelhante em relação ao alpelisibe quando avaliado por ensaios de MTT (Figura complementar S3). A imagem por microscopia confocal revelou uma ruptura impressionante da arquitetura normal da fibra de estresse F-actina em m PTCs de Ocrl^Y/-em comparação com camundongos OcrlY/þ, provavelmente devido à realocação de proteínas reguladoras de actina de suas localizações celulares normais para endossomos, pois grandes conjuntos de actina cercam essas organelas e são considerados a origem do defeito de tráfego.^10,29Tratamento de Ocrl^Y/- m PTCs com alpelisib (10 mM) restauraram a arquitetura da fibra de estresse (Figura 4a).

Como o inibidor de fosfoinositida 3-quinase alpelisibe é usado para a síndrome de Lowe/doença de Dent?

Como o principal problema emSíndrome de Lowe e doença de Dent2 é a redução do tráfego endossomal e consequente degradação da megalina, buscou-se distinguir a actina endossomal das fibras de estresse. Coletamos z-stacks confocais de varredura a laser em todas as células, reconstruímos o padrão de coloração em renderizações de superfície 3D e usamos forma/parâmetros de tamanho para identificar estruturas puntiformes de actina e o grau em que elas se sobrepõem às estruturas endossomais (Figura complementar S4 e filmes S1 –S3). Esta análise revelou que o tratamento com alpelisib diminuiu a polimerização aberrante de F-actina em endossomos corados com EEA1, distinta da arquitetura de fibra de estresse (Figura 4b). Os m PTCs derivados de Ocrl^Y/-camundongos apresentaram alterações significativas na coloração intracelular para PI(3)P (diminuído) e PI(4,5)P2 (aumentado), em comparação com m PTCs de camundongos WT OcrlY/+ (Figura 4c e d). Tratamento de m PTCs de Ocrl^Y/- camundongos com alpelisib resultaram em uma redução significativa na coloração intracelular de PI(3)P e PI(4,5)P2 (Figura 4c e d).

1.5 Alpelisib melhora a captação endocítica em Ocrl^Y/-m PTCs

Em seguida, avaliamos se o efeito do alpelisibe nos defeitos citoesqueléticos e vesiculares observados em m PTCs resultou em alterações na capacidade de captação endocítica. Para diferenciar o efeito do alpelisibe na ligação e/ou internalização do ligante, m PTCs foram primeiro incubados com albumina de soro bovino (BSA) marcada, para induzir a ligação da sonda com os receptores endocíticos e, em seguida, incubados com um meio de crescimento, para seguir a internalização da albumina (Figura 5a). O Ocrl^Y/-as células mostraram uma menor ligação à membrana plasmática de Alexa 488-albumina sérica bovina juntamente com internalização prejudicada de albumina em comparação com células OcrlY/þ. O tratamento com alpelisib resgatou tanto a ligação quanto a captação de albumina no Ocrl^Y/-células, com um resgate global de 50 por cento da captação endocítica (Figura 5b e c). Esses dados foram apoiados pela medição da captação total de albumina (Figuras complementares S5a eb). Observamos que a razão de albumina sérica bovina de Alexa 488- ligada / internalizada permaneceu semelhante entre as diferentes condições (Figura 5d), o que implica que a absorção reduzida de albumina é principalmente devido à ligação prejudicada em vez de um processo de internalização defeituoso perse.

1.6 Alpelisib melhora a disfunção de PT e endocitose mediada por receptor em Ocrl^Y/- ratos

Testamos o potencial efeito terapêutico de alpelisib na disfunção de PT in vivo. Camundongos orais foram administrados com veículo ou alpelisibe (50 mg/kg de peso corporal por dia) por gavagem oral por 6 semanas (Figura 6a). Este regime foi escolhido de acordo com estudos anteriores in vivo demonstrando eficácia e segurança.^22,30De acordo com o fato de a administração de alpelisibe ser conhecida por causar resistência à insulina e hiperglicemia,²²O tratamento com alpelisib levou a um aumento significativo da glicosúria em ambos Ocrl Y/þ e Oral^Y/-camundongos, o que poderia ser considerado um biomarcador para dosagem de drogas (Tabela Suplementar S1). Após 6 semanas de tratamento com alpelisibe, o Ocrl^Y/-camundongos apresentaram uma redução significativa na excreção urinária das proteínas LMW CC16 (-34 por cento) e albumina (-38 por cento), em comparação com controles tratados com veículo (Figura 6b e c), enquanto o volume de urina e outros parâmetros não foram afetados (Tabela Complementar S1). Camundongos tratados com alpelisib de ambos os genótipos mostraram uma redução semelhante na taxa de crescimento em relação aos camundongos de controle, conforme descrito anteriormente.²²No entanto, tanto o veículo quanto os camundongos tratados ganharam peso corporal, indicando que a droga não afeta gravemente o desenvolvimento pós-natal (Figura 6d e Tabela Suplementar S1).

Para testar se o efeito de alpelisibe na proteinúria de LMW refletia a recuperação da endocitose mediada por receptor em células PT, acompanhamos a captação in vivo de b-lactoglobulina marcada com Cy5-em um rim de camundongo. Ocrl tratado com alpelisibe^Y/-camundongos exibiram um resgate significativo da captação de b-lactoglobulina marcada com Cy5-, próximo à extensão da internalização observada em camundongos OcrlY/þ tratados com veículo (Figura 6e). Isso foi espelhado por um resgate significativo na expressão do receptor endocítico megalina em células PT, conforme observado por imunomarcação e Western blotting dos lisados ​​renais de Ocrl tratado com alpelisibe^Y/-ratos; observe que não houve alteração na expressão do marcador PT AQP1 (Figura 6f e g e Figura Complementar S5C e D). Esses dados mostram que o PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)inibidor alpelisibeinduz uma melhoria substancial da maquinaria endocítica PT e reduz a proteinúria LMW em um modelo de camundongo humanizado para a síndrome de Lowe.

Figura 5|Alpelisib melhora a captação endocítica de Ocrl humanizado^Y/-PTCs de rato (m PTCs). (a) Esquema ilustrando o experimento de perseguição de pulso usado para examinar a ligação e internalização de Alexa 488-albumina de soro bovino (BSA) em m PTCs. As células foram expostas ao Alexa 488-BSA (0,2 mg/ml) por 1 hora a 4 graus para permitir que o BSA se ligasse aos receptores da superfície celular (pulso) e depois aquecido a 37 graus em meio celular por 20 minutos antes da fixação para permitir a internalização do ligante (perseguição). (b) Micrografias confocais representativas de OcrlY/þ ou Ocrl^Y/-m PTCs tratados com dimetilsulfóxido (DMSO) ou 10 mM de alpelisibe por 16 horas e submetidos ao experimento de perseguição de pulso Alexa 488-BSA (verde), antes de serem fixados e rotulados para 40,6-diamidino{ {6}}fenilindol (DAPI) (azul). A fase de pulso do experimento é mostrada no painel superior para cada condição, com a sequência abaixo. Barras=20 mm. (c) Quantificação da superfície celular Alexa 488-BSA (i) e Alexa internalizada 488-BSA (ii), avaliada como intensidades médias de fluorescência FL por célula. Alpelisib resgata a ligação e internalização de BSA resgatadas observadas em Ocrl^Y/-células. N=209, 228, 186 e 196 células para OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/DMSO e Ocrl^Y/-condições de alpelisib, respectivamente em (i) e N=203, 183, 199 e 233 células para OcrlY/+ DMSO, OcrlY/+ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO e Ocrl^Y/-condições de alpelisib, respectivamente em (ii), em cada caso reunidas de 2 rins de camundongo por condição; cada ponto de dados representa a intensidade de fluorescência FL média em uma célula individual. A significância foi testada pela análise de variância (ANOVA) de Kruskal-Wallis (KW) com o teste de comparações múltiplas de Dunn: para (i) BSA de superfície celular, ***P geral <0.001, comparações="" múltiplas:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO e Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (não="" significativo="" [ns]);="" para="" (ii)="" bsa="" internalizado,="" geral="" ***p="">< 0,001,="" comparações="" múltiplas:="" ocrly/+="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO e Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" quantificação="" da="" razão="" entre="" a="" superfície="" celular="" alexa="" 488-="" bsa="" e="" as="" intensidades="" de="" fluorescência="" internalizadas="" alexa="" 488–bsa="" fl,="" não="" mostrando="" diferenças="" significativas="" nas="" razões="" entre="" cada="" condição.="" cada="" ponto="" representa="" a="" média="" da="" proporção="" em="" um="" campo="" contendo="" aproximadamente="" 15–20="" células="" (n="13," 13,="" 10="" e="" 11="" campos="" selecionados="" aleatoriamente="" para="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO e Ocrl^Y/-condições de alpelisib, respectivamente, em cada caso reunidos de 2 rins de camundongo por condição). A significância foi testada por KW ANOVA com testes de comparações múltiplas de Dunn: global P=0.46 (ns), comparações múltiplas: OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO e Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns); OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Para otimizar a visualização desta imagem, consulte a versão online deste artigo em www.kidney-international.org.

Figura 6|Alpelisib melhora a função do túbulo proximal (PT) de camundongos OcrlY/L, restaurando a captação de ligante e a expressão de megalina. (a) Configuração experimental. Camundongos orais foram tratados por 6 semanas com uma dose oral diária de carboximetilcelulose 1 por cento (veículo) ou alpelisib (50 mg/kg de peso corporal). No último dia do tratamento, os camundongos foram injetados com b-lactoglobulina marcada com Cy5-(N=6 Ocrl^Y/-, ou 8 Ocrl^Y/-camundongos por grupo). (b–d) Os valores de D mostrados indicam a mudança média de BL para D42 para a condição ± SEM. (b) proteína de células Clara 16 (CC16), (c) produção urinária de albumina (ambos dentro de 15 horas) e (d) a massa corporal foi medida em camundongos OcrlY/- tratados com veículo ou alpelisibe no ponto de tempo indicado. Cada ponto representa 1 rato. A significância foi avaliada por 2-teste t de Student pareado com cauda; em (b) CC16 (continuação)

Figura 6|(continuação) mudança de produção em relação à linha de base; þ veículo, P=0.9802 (não significativo [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; em (c) alteração da produção de albumina em relação à linha de base; þ veículo, P=0,0502 (ns), þ alpelisibe, ***P ¼ 0,0006; em (d) alteração da massa corporal em relação à linha de base; þ veículo, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisibe,="" **p="0,0083." (e)="" micrografias="" confocais="" representativas="" mostrando="" b-lactoglobulina="" marcada="" com="" cy5-b-lactoglobulina="" (magenta)="" 15="" minutos="" após="" a="" injeção="" na="" veia="" da="" cauda="" e="" marcada="" para="" 40,6-diamidino-2-fenilindol="" (dapi)="" (ciano),="" além="" da="" quantificação="" dos="" sinais="" fluorescentes="" fl="" correspondentes="" de="" rins="" de="" camundongos="" ocrl="" (n="412," 500="" e="" 588="" túbulos,="" respectivamente,="" para="" veículo="" ocrly/++,="">^Y/-þ veículo, e Ocrl^Y/-þ alpelisib) para 3 camundongos por grupo de tratamento. A captação de b-lactoglobulina é resgatada pelo tratamento com alpelisibe. Barras ¼ 20 mm. Nas quantificações, cada ponto representa a intensidade de fluorescência FL normalizada pela área do túbulo; os dados plotados indicam a média ± SEM. A significância foi avaliada pelo teste de Kruskal-Wallis (KW) seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn; ***P < 0,001,="" comparações="" múltiplas;="" ocrly/þþ="" veículo="" versus="">^Y/-þ veículo e Ocrl^Y/-þ veículo versus Ocrl^Y/-þ alpelisib, ambos ***P < 0.001.="" (f)="" western="" blotting="" e="" análise="" densitometria="" dos="" níveis="" de="" megalina="" em="" lisados="" ​​renais="" inteiros="" de="" camundongos="" oral.="" a-tubulina="" foi="" usada="" como="" controle="" de="" carga.="" a="" expressão="" reduzida="" de="" megalina="" em="">^Y/-é resgatado por alpelisib. Na quantificação da análise densitometria, cada ponto representa 1 camundongo (N=4 OcrlY/þþ veículo e Ocrl^Y/-þ veículo e N=3 Ocrl^Y/-þ camundongos alpelisibe); as linhas indicam média ± SEM. A significância foi avaliada por 2-testes t de Student não pareados com cauda: OcrlY/þþ veículo versus Ocrl^Y/-þ veículo; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ veículo versus Ocrl^Y/- þ alpelisibe, *P=0.0246. (g) Micrografias confocais representativas com inserções de alta ampliação e quantificação da intensidade de megalina (amarelo) em AQP1+PTs (magenta) de rins orais também foram marcadas para DAPI (ciano) ilustrando o resgate dos níveis de megalina após o tratamento com alpelisibe. Barras=20 mm. Nas quantificações, cada ponto representa a intensidade de fluorescência FL normalizada pela área do túbulo; os dados plotados indicam a média ± SEM; N=142, 191 e 266 túbulos, respectivamente, para veículo OcrlY/þþ, Ocrl^Y/-þ veículo, e Ocrl^Y/-þ alpelisibe para 3 camundongos por grupo de tratamento. A significância foi avaliada pela análise de variância KW seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunn; geral ***P < 0.001,="" comparações="" múltiplas;="" ocrly/þþ="" veículo="" versus="">^Y/-þ veículo e Ocrl^Y/-þ veículo versus Ocrl^Y/-þ alpelisib, ambos ***P < 0.001.="" para="" otimizar="" a="" visualização="" desta="" imagem,="" consulte="" a="" versão="" online="" deste="" artigo="" em="">

Como o inibidor de fosfoinositida 3-quinase alpelisibe é usado para a síndrome de Lowe/doença de Dent?

2. DISCUSSÃO

Atualmente, não há tratamento para aliviar a endocitose defeituosa que causa disfunção do PT emSíndrome de Lowe e doença de Dent2. Nossos achados revelam que alpelisib alivia o fenótipo de actina aberrante, reduzindo os níveis de PI(4,5)P2 e PI(3)P, causando uma melhora substancial da maquinaria endocítica e capacidade de absorção em sistemas celulares e um modelo de camundongo humanizado para Síndrome de Lowe/doença de Dent 2. Esses resultados suportam a ligação entre lipídios fosfoinositídeos, polimerização de actina e tráfego endocítico, com relevância imediata para células epiteliais altamente ativas envolvidas em processos homeostáticos cruciais (Figura 7). Dada a falta de terapias eficazes e a aparente segurança desta classe de PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)inibidores, o alpelisibe é um candidato promissor para o reaproveitamento de drogas emSíndrome de Lowe e doença de Dent.

A proteinúria LMW é a característica mais consistente encontrada em pacientes comSíndrome de Lowe e doença de Dent2 devido a mutações inativadoras no OCRL.⁴Essas proteínas LMW podem ser prontamente detectadas e quantificadas, oferecendo um biomarcador fiel de endocitose mediada por receptor defeituoso em células PT.1 A proteinúria LMW é particularmente relevante, pois é detectada de forma mais consistente e muitas vezes mais cedo do que outros solutos (por exemplo, glicose, fosfato, aminoácidos) fazendo parte da clássica "síndrome de Fanconi renal" - pelo menos em distúrbios congênitos da via endolisossomal.¹Aqui, mostramos que o alpelisib resgata a capacidade de captação endocítica apical das células PT in vitro e in vivo, devido aos níveis restaurados do receptor de megalina na membrana plasmática. Este efeito é refletido por reduções significativas na perda urinária de proteínas LMW (CC16 e albumina) em Ocrl^Y/-camundongos tratados com alpelisibe por 6 semanas. Esses efeitos do alpelisibe foram observados em m PTCs, que mantêm sua diferenciação apical e são particularmente adequados para investigar a endocitose mediada por receptor na fisiologia e na doença.⁹ Em particular, obtivemos m PTCs de um modelo de camundongo humanizado expressando INPP5B humano em Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/-antecedentes, o que nos permite investigar as consequências específicas da perda de atividade OCRL.^11,23

O resgate da endocitose pelo alpelisib é explicado pelo seu efeito na maquinaria da actina, claramente evidenciado nas células OCRL KO HK2 e m PTCs. Nossas observações, portanto, confirmam e ampliam estudos anteriores que mostram a ligação entre o controle do equilíbrio de fosfoinositida e F-actina na via endossomal precoce em pacientes OCRL e células KO.^7,10A perda funcional da atividade de OCRL prejudica a degradação de PI(4,5)P2, que, por sua vez, leva a uma falha no desrevestimento de vesículas revestidas de clatrina, resultando em organelas endossomais aberrantes em vários tipos de células, incluindo as células PT.^7-10Recentemente, mostramos que o excesso de F-actina diminui a reciclagem do receptor multiligante megalina para a membrana apical das células PT, causando endocitose defeituosa e proteinúria de LMW.¹¹

Nossos dados indicam que o mecanismo de ação do alpelisibe na actina endossomal decorre de um efeito biespecífico da inibição do alpelisibe: primeiro na produção de PI(3,4,5)P3 e sua conversão em PI(3)P, e segundo na produção de PI(4,5)P2. A diminuição nos níveis de PI(4,5)P2 neutraliza diretamente a deficiência de OCRL e está de acordo com trabalhos anteriores aliviando o excesso de actina e aumentando o efluxo endocítico por uma redução nos níveis de fosfatidilinositol 4-fosfato 5- quinase , uma enzima que gera PI(4,5)P2.¹⁰Alpelisib tem uma concentração inibitória de 0 0,5 mM 50 por cento no PI(4,5)P2 gerando a quinase PI4Kb, que pode ser responsável, ou pode resultar de efeitos mais gerais no equilíbrio de fosfoinositídeos resultantes da combinação de OCRL KO e tratamento com alpelisib. Identificamos que a classe IA PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)a inibição por alpelisib é relevante para a inibição de actina, uma vez que a depleção de p110a mediada por siRNA inibe a acumulação de actina de forma semelhante ao tratamento com alpelisib e copanlisib (que não é relatado para inibir PI4Ks). Em células RPE, observamos anteriormente que o siRNA de INPP4A, que converte PI(3,4)P2 em PI(3)P, inibe a montagem de actina em células OCRL KO, fornecendo uma via de inibição de PI(3,4,5) produção de P3 a uma diminuição de PI(3)P endossomal. Mostramos que alguns PI(3)P permanecem, presumivelmente o pool produzido no endossoma inicial pela classe III PI3K, Vps34, porque descobrimos que o tráfego endossomal é aumentado em vez de suprimido pelo tratamento com alpelisib. A complexa co-regulação do metabolismo de PI e sua relevância para a inativação de OCRL também foi destacada em um estudo recente onde as funções não catalíticas da fosfoinositida 3- fosfatase PTEN ativam a degradação de PI(4,5)P2 via PLCXD, aliviando fenótipos celulares e absorção de ligantes em um modelo de peixe-zebra.³¹

O alívio do fenótipo de actina por níveis reduzidos de PI(4,5)P2 e PI(3)P pelo tratamento com alpelisib concorda com a ação sinérgica de PI(4,5)P2 e PI(3)P no recrutamento de SNX9 para ativar a maquinaria de actina nos endossomos de Ocrl,¹⁴sugerindo uma correspondência muito eficaz de especificidade de alpelisib para manipular a regulação molecular da ativação de actina em endossomos. Por sua vez, como demonstrado anteriormente, a redução da montagem endossomal de actina, por sua vez, leva a uma melhora na endocitose de PT em células deficientes em OCRL.¹⁰Uma caracterização adicional será necessária para entender melhor se a regulação da actina através do metabolismo do fosfoinositídeo é a verdadeira fonte do efeito terapêutico que observamos com alpelisibe no Ocrl^Y/-modelo de rato. Porque a classe I PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)regulam as vias que controlam o crescimento celular, proliferação, sobrevivência, metabolismo e autofagia,³²não podemos excluir que o resgate endocítico seja devido a efeitos diretos na PI(3,4,5)P3 e o efeito combinado em outras vias moduladas pela PI3K classe I. Mais trabalho também é necessário para testar se PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)os inibidores também podem aliviar as manifestações neurológicas e outras manifestações clínicas de pacientes portadores de mutações OCRL.⁴

A experiência recente de alpelisibe em pacientes pediátricos com síndrome PROS/CLOVES sugere que a droga tem potencial para ser bem tolerada. Alpelisib é tomado por via oral, visa seletivamente a isoforma de PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)classe I, e mostra um perfil de toxicidade menor em comparação com os inibidores pan-PI3K. Como o alpelisib não bloqueia completamente o PI3K(fosfoinositídeo 3-quinase)atividade, mantendo assim as funções da via de sinalização, pode ser particularmente adequado para uso a longo prazo. De interesse, a hiperglicemia decorrente do uso de alpelisibe pode ser controlada por mudanças na dieta.²²Como a disfunção de PT é a primeira manifestação de doença renal observada em lactentes jovens com doença de Dent 2 e síndrome de Lowe, o tratamento precoce dessa disfunção de PT, levando a melhorias no perfil metabólico e no crescimento, pode, portanto, retardar a progressão para doença renal crônica e, portanto, ter um impacto significativo na longevidade e qualidade de vida.³³Embora as manifestações da doença da mutação OCRL sejam particularmente amplas, estudos recentes baseados em grandes coortes de pacientes genotipados com síndrome de Lowe da doença de Dent 2 não evidenciaram efeitos significativos do tipo de mutação ou da localização da mutação na sobrevida renal.³⁴Coletivamente, nossos dados destacam o potencial de redirecionamento do alpelisibe para o tratamento da disfunção do PT na síndrome de Lowe/doença de Dent 2, fornecendo assim uma base para implantação rápida e econômica em ensaios clínicos em humanos.

3. MÉTODOS

3.1 Detalhes completos podem ser encontrados nos Métodos Suplementares.

As células HK2 foram tratadas com copanlisib, alpelisib, GSK2636771 ou idelalisib nas concentrações indicadas durante 16 horas, salvo indicação em contrário. As proteínas foram extraídas usando métodos padrão de células ou tecidos renais e o Western blotting foi realizado usando anticorpos publicados ou disponíveis comercialmente. O knockdown de siRNA foi realizado usando 2 transfecções 72 e 24 horas antes da análise. Usamos OcrlY/þ pareados por idade e sexo; Inpp5b^{- /-}; e Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- irmãos da mesma ninhada de camundongos com expressão de BAC-INPP5B. As culturas primárias de m PTCs foram geradas a partir dos rins colhidos de camundongos Ocrl de 8 semanas de idade e a capacidade endocítica de Oral m PTCs foi avaliada medindo a absorção de albumina. Os tratamentos com alpelisib foram de 10 mM durante 16 horas, salvo indicação em contrário. A captação de albumina em m PTCs foi avaliada usando um protocolo "pulse-chase" para avaliar a ligação apical e a captação resultante. m PTCs foram corados durante a noite com o anticorpo primário apropriado e por 45 minutos com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo FL adequados e/ou Alexa-488 Phalloidin. A coloração de PI(3)P em m PTCs foi realizada usando a sonda de domínio FYVE. A análise de imagem foi realizada com CellProfifiler, usando pipelines personalizados para medir a sobreposição de actina/EEA1 e o número de pontos, e com o ImageJ para medir a intensidade de imunofluorescência e as bordas detectadas para calcular a pontuação da fibra de estresse. Os dados quantitativos foram expressos como média±erro padrão da média. Para os experimentos in vivo, camundongos com 6 semanas de idade foram tratados com veículo ou alpelisibe 50 mg/kg de peso corporal. A urina foi coletada a cada 14 dias e os animais foram sacrificados após 42 dias de tratamento, com coleta de sangue e rins. A capacidade endocítica de PT de camundongos Oral foi examinada medindo a captação de b-lactoglobulina.

4. DIVULGAÇÃO

A JLG tem financiamento da AstraZeneca para uma bolsa de estudos em seu laboratório. SPJ faz parte dos conselhos consultivos e tem participação acionária da Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics e Adrestia Therapeutics, e é um parceiro científico da Ahren Innovation Capital. Todos os outros autores declararam não haver interesses conflitantes.

5. AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi apoiado por European Research Council Grant 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac Newton Trust Research Grant 18.23 (j) para JLG, e Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z para SPJ, e reconhecemos o financiamento do Instituto Gurdon do Wellcome Trust (092096) e CRUK (C6946/A14492). Agradecemos à Cystinosis Research Foundation (Irvine, CA), à Swiss National Science Foundation (subvenção do projeto 310030_189044), ao programa de prioridade de pesquisa clínica (KFSP) RADIZ (Rare Disease Initiative Zurich) da UZH, ao Swiss

Centro Nacional de Competência em Pesquisa (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) para apoio, e o NIDDK/NIH e o Lowe Syndrome Trust/UK para apoiar o desenvolvimento dos camundongos orais. Agradecemos a Robert L. Nussbaum (Invitae Corporation e UCSF, São Francisco, CA) e Maria Antonietta De Matteis (Instituto de Genética e Medicina Telethon, Universidade Federico II de Nápoles, Nápoles, Itália) por fornecer os fundadores da colônia de camundongos Oral;

e Eric Olinger (UZH, Zurique) pelas discussões frutíferas. Agradecemos a Nadine Näegele e Daniela Nieri pela assistência técnica durante a coleta e análise da urina; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris) por compartilhar conosco o protocolo detalhado para a preparação de Alpelisib para o tratamento in vivo; e Renata Kozyraki e Pierre Verroust pelo fornecimento de reagentes. Agradecemos também ao Centro de Microscopia e Análise de Imagens da Universidade de Zurique (Zurique, Suíça) e às instalações de fisiologia integrativa de roedores (ZIRP) de Zurique por fornecer o equipamento para aquisição de imagens e suporte técnico durante os experimentos in vivo.

Como o inibidor de fosfoinositida 3-quinase alpelisibe é usado para a síndrome de Lowe/doença de Dent?

6. MATERIAL SUPLEMENTAR

Arquivo Complementar (PDF)

Métodos Suplementares e Referências.

Tabela S1. Parâmetros de peso corporal, urina e sangue ao longo do tempo em camundongos orais tratados com alpelisibe ou veículo.

Figura S1. Expressão da isoforma p110 e ensaios de citotoxicidade dose-resposta da droga em células HK2.

Figura 2. PI3Kinibidor alpelisiberestaura a sobreposição actina-endossomal e reduz os níveis de PI(3)P de maneira responsiva à dose 4 horas após o tratamento com drogas em células HK2.

Figura S3. Expressão da isoforma p110 e toxicidade do alpelisib em Ocrl mPTCs.

Figura S4. Fluxo de trabalho da análise de sobreposição de EEA1/actina em Ocrl mPTCs.

Figura S5. Alpelisib restaura a captação de albumina em Ocrl^Y/-mPTCs. A expressão Aqp1 não é afetada. Arquivo Complementar (Filmes)

Filme S1. Renderização 3D do Imaris de sobreposição de EEA1/actina em OcrlY/þ mPTCs tratados com DMSO. Renderização de superfície 3D representativa de uma pilha confocal de OcrlY/þ mPTCs tratados com DMSO por 16 horas, depois fixados com o fixador de formaldeído a 4% e imunomarcados para EEA1 (roxo), actina (faloidina; amarelo) e DAPI (azul), ilustrando pouco associação actina/endossomal. Barra=5 mm.

Filme S2. Renderização 3D Imaris de sobreposição EEA1/actina em Ocrl^Y/-mPTCs tratados com DMSO. Renderização de superfície 3D representativa de uma pilha confocal de OcrlY/– mPTCs tratados com DMSO por 16 horas, em seguida, fixados com o fixador de formaldeído a 4% e imunomarcados para EEA1 (roxo), actina (faloidina; amarelo) e DAPI (azul), ilustrando o pontilhado actina associando estruturas endossomais próximas. Barra=5mm.

Filme S3. Renderização 3D Imaris de sobreposição EEA1/actina em Ocrl^Y/- mPTCs tratados com alpelisibe. Renderização de superfície 3D representativa de uma pilha confocal de OcrlY/– mPTCs tratados com 10 mM de alpelisibe por 16 horas, depois fixados com o fifix de formaldeído a 4% e imunomarcados para EEA1 (roxo), actina (faloidina; amarelo) e DAPI (azul) , ilustrando o resgate de estruturas puntiformes de actina em torno de endossomos. Barra=5 mm.

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Copyright ª 2020, Sociedade Internacional de Nefrologia. Publicado por Elsevier Inc. Este é um artigo de acesso aberto sob a licença CC BY (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Institute, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, Reino Unido. E-mail: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; ou Olivier Devuyst, Instituto de Fisiologia, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça. E-mail: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho.⁶Esses autores co-dirigem o estudo. Recebido em 8 de agosto de 2019; revisto em 1 de maio de 2020; aceito em 15 de maio de 2020; publicado on-line em 9 de setembro de 2020