Glicosídeos de feniletanol de Cistanche Tubulosa suprimem a ativação de células estreladas hepáticas e bloqueiam a condução de vias de sinalização em TGF-01/smad como potenciais agentes antifibrose hepática
Mar 05, 2022
Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang e Tao Liu
Abstrato: Cistanche tubulosaé um fitoterápico tradicional chinês amplamente utilizado para regular a imunidade eglicosídeos feniletanoides(CPhGs) estão entre os principais componentes responsáveis por essa atividade. Estudos anteriores indicaram os efeitos preventivos e terapêuticos dos CPhGs na fibrose hepática induzida pela albumina sérica bovina (BSA) em ratos. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito anti-fibrose hepática de CPhGs e os monômerosechinacosideeacteósidoinibindo a ativação das células estreladas hepáticas (HSC), bloqueando a condução das vias de sinalização na transformação do fator de crescimento-p1 (TGF-p1)/smad, e determinando sua atividade hepatoprotetora in vitro. A proliferação de HSC foi obviamente inibida após o tratamento com CPhGs (100,50 ^g/mL)/equinacosídeo (500.250.125 ^g/mL)/acteoside (6, 3 ^g/mL), com valores de IC50 de 119,125.520,345 e 6,999 g/ mL, respectivamente, no ensaio MTT. Diferentes concentrações de CPhGs/echinacoside/acteósidonão afetou a toxicidade celular em HSC de acordo com as medições de lactato desidrogenase (LDH). Diferentes concentrações de CPhGs/echinacoside/acteósidoaumentou o nível de mRNA e a expressão proteica de smad7 e diminuiu os níveis de mRNA de smad2, smad3 e a expressão proteica de smad2, fosfo-smad2 (p-smad2), smad3, fosfo-smad3 (p-smad3) em HSC. Em resumo, esses resultados demonstram que CPhGs/echinacoside/acteósidopode bloquear a condução das vias de sinalização em TGF-p1/smad, e inibir a ativação de HSC, sugerindo queC. tubulosapode assim ser um potencial fitoterápico para o tratamento da fibrose hepática.
Palavras-chave: Cistanche tubulosa; glicosídeos de feniletanol deCistanche(CPHGs);echinacoside; acteósido; células estreladas hepáticas (HSC); TGF-p1/smad
1. Introdução
tornam-se proliferativas e fibrogênicas, subsequentemente acumulam MEC e, por fim, diferenciam-se em células fibrogênicas semelhantes a miofibroblastos. O fator de crescimento transformador-.1 (TGF-p 1) é considerado o principal mediador profibrogênico. A via de sinalização relacionada com TGF-&1 é um importante mecanismo de fibrose hepática, e inclui principalmente sinalização dependente e independente de smad, e acredita-se que a via de transdução de sinalização dependente de smad seja um dos principais canais de sinalização de TGF-p1 . Portanto, o bloqueio da via de sinalização TGF-p1/smad pode suprimir a produção de colágeno e, eventualmente, aliviar a fibrose hepática, o que tornou essa via um alvo importante na pesquisa de drogas anti-fibrose hepática nos últimos anos.
Apesar da alta incidência mundial de fibrose hepática, nenhuma terapia antifibrogênica geralmente aceita está disponível [2-4]. As Fitoterapias Tradicionais Chinesas (TCHMs) são de grande interesse para o tratamento de doenças hepáticas, pois algumas podem ser utilizadas como fármacos terapêuticos no manejo e prevenção da fibrose hepática. Atualmente, muitos estudos estão focados em potenciais drogas antifibrogênicas que têm sido usadas como TCHMs por milhares de anos [5].
Cistanche tubulosa W (família Orobanchaceae)fa planta parasita, é amplamente cultivada na região sul de Xinjiang na China [6]. As pessoas o usam para revigorar os rins, nutrir o sangue, relaxar os intestinos e retardar a senescência sem efeitos colaterais, e está oficialmente listado na Farmacopeia Chinesa [7]. C. tubulosa contém uma variedade de componentes ativos, incluindo glicosídeos feniletanoides (CPhGs), iridóides e polissacarídeos. Dentre os muitos componentes ativos em C. tubulous, os CPhGs, que apresentam uma série de bioatividades (antioxidante, antifadiga, radiorresistência, etc.) são os principais componentes característicos desta planta. Nos últimos anos, é relatado que os CPhGis têm excesso de efeitos hepatoprotetores Hent, e podem eliminar radicais de árvores, proteger as membranas hepáticas e exibir efeitos imunorreguladores, inibição da apoptose, inibição da expressão do antígeno de superfície da hepatite B (HBs Ag) e da hepatite B e atividade de replicação do DNA do antígeno (HBeAg) e do vírus da hepatite B (HBV), etc. O nível de DNA do VHB é o índice mais confiável que reflete diretamente a atividade de replicação viral, que é o fator chave na determinação da história natural das infecções crônicas pelo VHB, monitorar o efeito da terapia antiviral oP e avaliar o prognóstico de infecções agudas e crônicas por HBV. Os índices de detecção sorológica do HBV incluem principalmente HBsAg, HBeAg, etc. [8-11]. No entanto, existem poucos relatos na literatura sobre os efeitos anti-fibrose hepática dos CPhGs. Estudos anteriores indicaram os efeitos preventivos e terapêuticos de CPhGs na fibrose hepática induzida por albumina sérica bovina (BSA) em ratos, mas a atividade antifibrogênica de CPhGs e seus principais monômeros (equinacosídeo e acteosídeo, Figura 1) nunca foram avaliados in vitro.
orgânico Cistanche tubulosa
2. Resultados
2.1. Determinação Quantitativa de CPhGs
CPhGs emC. tubulosacontêm dois glicosídeos de álcool feniletílico: echinacoside e acteo side, e seus conteúdos nos CPhGs foram detectados por análise de HPLC (Figura 1) em 42,71 por cento 土 0,42 por cento e 14,27 por cento 土 0.18 por cento, respectivamente.
2.2. Atividades Inibitórias de CPhGs, Echinacoside e Acteoside em HSC-T6
CPhGs, echinacoside e acteoside (62.5-500 卩g/mL) inibiram a viabilidade celular de HSC de forma dependente da concentração. CPhGs e acteosídeos mostraram uma atividade inibitória notável em células HSC, com 50 por cento de inibição da atividade de crescimento celular (IC50) os valores foram de 119,125 昭/mL e 6,999 昭/mL, respectivamente. O echinacoside apresentou atividade inibitória moderada (IC50.520,345 昭/mL; Tabela 1 e Figura 2).
2.3. Toxicidade Celular de CPhGs, Echin acoside e Acteorida em HSC
A lactato desidrogenase (LDH), uma enzima citoplasmática estável presente em todas as células, é rapidamente liberada no sobrenadante da cultura celular após dano à membrana plasmática. A atividade enzimática no sobrenadante da cultura correlaciona-se com a proporção de células lisadas [12]. Conforme mostrado na Tabela 2, quando tratados com diferentes: concentrações de C PhGs, echinacoside e acteoside, embora a atividade da LDH tenha apresentado um ligeiro aumento em relação ao grupo coirtrol celular, a diferença não foi estatisticamente significativa (p > 0,05 ).
2.4. Efeito de CPhGs, Echinacoside e Acteosde na proliferação de HSC induzida por TGF-^i
A proliferação, ativação e diferenciação de HSC são reguladas por uma variedade de fatores. Dentre os diversos fatores envolvidos na fibrose hepática, o TGF{{0}} é considerado o mais importante, pois pode ativar HSC, promover a diferenciação de miofibroblastos, aumentar a síntese de MEC, inibir a degradação de MEC e liberar quimiocinas e citocinas envolvidas na fibrose hepática [13]. Neste estudo, exceto para o grupo controle, HSCs estacionárias foram estimuladas com TGF-P1 in vitro para simular a formação de fibrose hepática precoce e investigar o efeito de CPhGs, echinacoside e acteside sobre TGF-p1- proliferação de HSC induzida. Conforme apresentado na Tabela 3, comparado ao grupo controle, o grupo TGF-61 promoveu significativamente a proliferação de CTH (p < 0.01).="" comparado="" com="" o="" grupo="" tgf-p1,="" tgf-p1="" mais="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" mais="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" mais="" acteosídeo="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05)="" todos="" inibiram="" notavelmente="" a="" proliferação="" de="" hscs="" induzidas="" por="" tgf-|3="" 1="" em="" diferentes="">
2.5. Expressões de smad2)smad3 e smad7 mRNA após intervenção de CPhGs, ochmacoside e acteaside em HSCs
Smad3 e smad2 são efetores chave a jusante da via de sinalização TTGF-p [14,15], e smad7 é um inibidor da sinalização smad. Teoricamente, a expressão aumentada de smad7 ou expressão diminuída de smad2/smad3 pode bloquear a condução de vias de sinalização em TGF-p 1/smad. Conforme mostrado na Figura 3, a análise de PCR quantitativa em tempo real mostrou que a expressão de mRNA de smad2 e smad3 indicou um nível mais baixo, enquanto smad7 indicou níveis mais altos no grupo controle, em comparação com o grupo TGF-|31. No grupo TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), o nível de mRNA de smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" e="" smad3="" (p="">< 0,01)="" foram="" significativamente="" diminuídos="" em="" comparação,="" com="" o="" grupo="" tgf-pf,="" e="" foi="" até="" semelhante="" ao="" grupo="" controle;="" enquanto="" isso,="" o="" nível="" de="" mrna="" de="" smad7="" foi="" significativamente="" aumentado="" no="" grupo="" tc="" (50,="" 75.100="" 卩g/ml)="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01,="" respectivamente).="" no="" entanto;="" a="" expressão="" de="" smad7="" indicou="" uma="" tendência="" ascendente="" no="" grupo="" tc="" 25="" 卩g/ml="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" tgf-p1="" (figura="">
Enquanto isso, em comparação com o grupo TGF-p1, a expressão de smad2 e smad3 mRNA foi significativamente diminuída no TE (62,5, 125, 250, 500 卩g /mL) (p < 0.01),="" e="" as="" expressões="" de="" smad7="" mrna="" foram="" significativamente="" aumentadas="" no="" grupo="" te="" (125,="" 250.500="" 昭/ml)="" (p="">< 0,01)="" (figura="" 4)="" .="" da="" mesma="" forma,="" o="" grupo="" ta="" (0,75,1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ^g/ml)="" também="" apresentou="" a="" mesma="" tendência="" (figura="">
2.6. Influência de CPhGs, Echinacoside e Ac)eosids na Via de Sinalização T GF-^i/smad em HSC
A via de sinalização TGF-p 1/smad depende de smad2, smad3, fosfo-smad2 (p-smad2), fosfo-smad3 (p-smad3) e smad7, onde p-smad2, p-smad3 são as formas ativadas de smad2 e smad3. Neste estudo, os níveis de proteína de omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 e smad7 foram analisados. A análise de Western blot detectou aumentos nos níveis de smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 por TGF-p1, e a inibição desses aumentos por CPhGs, ec hinacoside e acteoside; enquanto isso, a análise de Wesiern blot revelou níveis de smad7 regulados para cima por CPhGs, echinacoside e acteoside. (Figuras 6-8).
Conforme mostrado na Figura 6, em comparação com o grupo c on2rol (as expressões proteicas de smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 foram significativamente aumentadas e a expressão da proteína smad7 foi diminuída no grupo TGF-p1. No TC (25 , 50, 75, 100 昭/mL) grupos de drogas, o smad/ (Figura 6A), p-smad2 (Figura 6B), smad 3 (Figura 6C), p -smad3 (Figura 6D) as expressões foram significativamente menores do que no grupo TGF-p1 (卩 < 0,01), e a expressão da proteína smad7 (Figura 6E) foi maior do que no grupo TGF-S1 (p < 0,01) (Figura 6).
Ao mesmo tempo, as expressões das proteínas smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 e smad7 foram medidas após a intervenção com echinacoside e acteoside em HSC. Conforme mostrado nas Figuras 7 e 8, os níveis de expressão da proteína smad2, smad3, p-smad2 e p-smad3 foram significativamente inibidos (p < 0.05="" ou="" p="">< 0.01)="" ),="" o="" nível="" de="" expressão="" da="" proteína="" smad7="" estava="" elevado="" (p="">< 0,01),="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" tgf-p="" 1="" (figuras="" 7="" e="">
3. Discussão
A fibrose hepática é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, mas opções terapêuticas muito limitadas estão disponíveis atualmente para essa condição, portanto, é muito importante buscarmos potenciais alvos para intervenção terapêutica para prevenir o desenvolvimento de fibrose hepática [ ]. 16]. Recentemente, pesquisadores descobriram que vários medicamentos fitoterápicos têm efeitos hepatoprotetores de antifibróticos. Muitos TCHMs, como as pílulas Fufang Biejia Ruangan [17] e a decocção Xiao-chai-hu (shosaiko no Japão) [18,19] têm sido amplamente utilizados para tratar a fibrose hepática na China, Coréia e Japão há milhares de anos. C. tubulosa contém uma variedade de componentes ativos, incluindo CPhGs, iridóides e polissacarídeos. Como uma das bases materiais eficazes de C. tubulosa, CPhGs possuem excelente atividade hepatoprotetora, mas há informações limitadas sobre os efeitos antifibróticos de GPhCs e seus compostos relacionados. Neste estudo, investigamos como CPhGs, echinacoside e acteoside suprimem a ativação de HSC e bloqueiam a condução da via de sinalização em TGF-p1/snaad como potenciais agentes anti-fibrose hepática in vitro.
A lesão hepática de qualquer etiologia acabará por levar à ativação de HSCs, que sofrem transdiferenciação para células semelhantes a miofibroblastos fibrogênicos [20]. Ou seja, os miofibroblastos
são derivados da ativação e proliferação de HSCs [21], e é considerado o mediador da formação de fibrose hepática. Por esta razão, realizamos estudos in vitro para comparar as taxas de viabilidade celular de HSCs expostas a CPhGs, echinacoside e acteoside. Os resultados mostraram que o efeito inibitório do acteosídeo sobre as HSC foi o mais forte, e o efeito dos CPhGs foi melhor do que o do equinacosídeo. Os soros medicados com CPhGs, echinacoside e acteoside inibiram a proliferação de HSC de forma dose-dependente.
A LDH é uma enzima citoplasmática em células vivas e não pode penetrar na membrana celular em circunstâncias normais. Quando as células são danificadas, a permeabilidade da membrana aumenta e a LDH é liberada para o exterior da célula. Normalmente, a LDH pode detectar o grau de dano celular [{{0}}]. A investigação mostrou que a atividade da LDH de CPhGs, soro medicado com echinacoside e acteoside apresentou apenas um leve aumento em comparação com o grupo controle celular, e a diferença não foi estatisticamente significativa (p > 0,05), indicando que a maior parte da membrana celular manteve sua integridade , e a inibição de HSCs por CPhGs, echinacoside e acteosídeo não é devido à toxicidade celular inespecífica.
Quando ocorre lesão hepática, hepatócitos ativados podem liberar TGF-pi que por sua vez ativa HSC-T6, portanto, TGF-pi tem uma relação próxima com fibrose [25-27]. Neste estudo, CPhGs, echinacoside e acteoside podem ser considerados como uma estratégia terapêutica atraente para a inibição da proliferação de HSC após HSCs serem estimuladas com wTGF-pi in vitro. Especulamos que CPhGs, echinacoside e acteoside podem ser usados como forma de tratamento e/ou prevenção da fibrose hepática, além de inibir a formação de fibrose hepática precoce. A formação da fibrose hepática é um processo complexo de envolvimento multifatorial e multicelular. Nesse processo patológico, as interações célula-célula, célula-citocinas e célula-matriz constituem uma rede incômoda. Nesta rede, o desenvolvimento da fibrose hepática pode ser regulado por diferentes vias e meios de sinalização. O TGF-pi é um ativador clássico de HSC e um mediador chave na patogênese da fibrose hepática [28]. CPhGs, echinacoside e acteoside podem inibir as expressões de mRNA e proteínas relacionadas à via TGF-pi/smad em HSCs.
O TGF-pi exerce seus efeitos celulares através da via de sinalização smad, e tem sido considerado um mediador chave no desenvolvimento de fibrose e inflamação hepática. Após a ligação do TGF-pi ao receptor TGF-p tipo II, a quinase do receptor tipo II fosforila o domínio GS do receptor TGF-p tipo I, levando à ativação do receptor tipo I [29]. Através da ação de p-smad2 e p-smad3 em dois resíduos de serina no motivo SSXS de seu terminal C, as reações a jusante da via de sinalização smad são ativadas pela ativação do receptor tipo I [30]. P-smad2 e p-smad3 formam complexos oligoméricos com smad4, então entram no núcleo e exercem sua atividade biológica de transcrição. Assim, as proteínas smad transmitem sinais diretamente do receptor quinase para o núcleo [3i]. Por outro lado, o smad7 está firmemente combinado com o receptor TGF-pi, levando à incapacidade do smad 2/3 de ser ativado, bem como à inibição das vias de transdução de sinal [32]. Smad7 pode atuar para inibir o p-smad2 e p-smad3, translocação nuclear de complexos smad ativados e ativação de (CAGA) (9)-MLP-Luc, resultando em diminuição da expressão de colágeno I e inibição completa da transdução de sinal de TGF-p [33,34]. Nossos resultados mostraram que CPhGs, echinacoside e acteoside podem diminuir a expressão de mRNA de smad2 e smad3 e aumentar a expressão de mRNA de smad7; inibem as expressões das proteínas smad2, p-smad2, smad3 e p-smad3 e regulam positivamente a expressão da proteína smad7, sugerindo que CPhGs, echinacoside e acteside também desempenham um papel na inibição da ativação de HSC e, assim, inibem a fibrose hepática, destacando um potencial antifibrótico mecanismo.
A sequência dos efeitos hepatoprotetores dos três agentes de teste mostrou ser acteoside > CPhGs > echinacoside. A fim de elucidar ainda mais as razões das diferenças no mecanismo pelo qual CPhGs, echinacoside e acteoside protegem contra a fibrose hepática, suas estruturas químicas foram analisadas. A porção glicosídica do álcool fenetílico parece ser uma estrutura essencial para o efeito hepatoprotetor [35]. O acteosídeo (C29H36Oi5) é um glicosídeo duplo e o equinacosídeo (C35H46O20) é um triglicosídeo, ou seja, o equinacosídeo possui um glicosídeo extra em sua estrutura em relação ao acteosídeo, o que leva a um aumento do seu tamanho espacial. A hepatoproteção ou inibição da atividade de HSC do acteosídeo é melhor do que a do equinacosídeo, o que pode ser devido à existência de impedimento estérico.
proteger o fígado: extrato de cistanche
4. Seção Experimental
4.1. Produtos Químicos e Reagentes
O TGF-pi foi adquirido da Peprotech (Rocky Hill, NJ, EUA). A linha celular HSC-T6 foi adquirida de Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, China). O dimetilsulfóxido (DMSO) foi adquirido da Sigma Inc. (St. Louis, MO, EUA). Os primers Smad2, smad3 e smad7 foram produzidos pela Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Xangai, China). O kit de síntese de cDNA da primeira cadeia Revert Aid foi adquirido à Thermo Scientific (Shanghai, China). O kit Quantifast SYBR green PCR foi adquirido da QIAGEN GmbH (Hilden, Alemanha). O anticorpo p-smad2 (ser465/467), o mAb de coelho Smad3 (C67H9) e o mAb de coelho p-smad3 (ser423/425) foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Boston, MA, EUA). O anticorpo Smad7 foi adquirido de Boster (Wuhan, China). O anticorpo policlonal Smad2 e o anticorpo monoclonal p-actina foram adquiridos da Proteintech (Wuhan, China). A detecção do anticorpo primário foi feita usando solução de anticorpo de 2 graus (Alk-Phos. Conjugated, Anti-coelho) e solução de 2 graus de anticorpo (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) adquirida da Invitrogen™ (Carlsbad, CA, EUA). O kit de ensaio de lactato desidrogenase foi do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China).
4.2. Material vegetal
C. tubulosa foi coletada em Tulufan, na região autônoma de Xinjiang Uirghur, na China, em maio de 2006. Os materiais vegetais foram identificados como C. tubulosa por Jiang He, Instituto de Matéria Médica de Xinjiang. Um espécime de comprovante foi depositado no Instituto de Matéria Médica de Xinjiang, na China.
4.3. Isolamento e Purificação de CPhGs e seus Compostos
Rizomas secos e fatiados de C. tubulosa (6.0 kg) foram extraídos consecutivamente três vezes sob refluxo com 70 por cento de etanol (4,8 L), e o solvente foi então removido dos extratos combinados para para produzir o extrato etanólico (1,146 kg). Os extratos etanólicos foram purificados por resina AB-8 para obter o extrato bruto de fenil etanolglicosídeos (CPhG s). Após a dissolução em água, o extrato foi purificado por cromatografia de resina macroporosa de adsorção AB-8 para obter os glicosídeos fenil etanol totais de C. tubulosa (CPhGs, 210 g). Os CPhGs foram aplicados em uma coluna ODS OP{{10}} e eluídos sucessivamente com misturas de MeOH—H?.(0:1 -^1:0). Os eluatos foram combinados em cinco subfrações de acordo com o comportamento de TLC usando o sistema solvente CHCh-MeOH-H?.(6:4:0,5). Os pontos foram visualizados após a pulverização com 1 por cento de FeCih. Várias frações foram repetidamente purificadas por cromatografia em coluna Sephadex LH-20 com metanol como eluente, e dois fenil etanol glicosídeos foram isolados dos CPhGs. Suas estruturas foram confirmadas como echinacoside (C35H46O20) e acteoside (C29H36O15) usando MS, 1H- e MC-NMR [35], cujas purezas foram determinadas em 99,17 por cento e 98,92 por cento, respectivamente, por UV-HPLC. As estruturas de echinacoside e acteoside são mostradas na Figura 9.
4.5. Determinação Quantitativa de CPhGs
Cromatografia líquida (HPLC) (LC{{0}}) Um instrumento HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Japão) foi empregado para analisar o conteúdo de cosídeo de echina e um cteosídeo nos CPhGs. Uma coluna Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 mm, 5 |^m) foi usada a 30 graus. Uma fase móvel isocrática consistindo em metanol-acetonitrila-1 por cento de ácido acético (15:10:75, v/v/v) foi usada para uma corrida de 40 min, a uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min, com UV detecção a 334 nm.
4.6. Cultura de células
As células HSC foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (High Glucose) (DMEM, Pequim, China) suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, EUA), 10 0 UI/mL de penicilina e 100 ^g/mL de estreptomicina (HyClone, Logan, UT, EUA) em uma incubadora umidificada a 37 graus com 5% de CO2. Essas células foram regularmente subcultivadas por solução de tripsina 0,25 por cento (1x) (HyClone, Logan, UT, EUA) e o meio foi trocado a cada 2 dias. Inicialmente, as células foram cultivadas com DMEM contendo 10 por cento de FBS por 48 h. O meio foi então substituído por DMEM sem FBS para privar as células por 12 h. Essas células foram propagadas por 48 h e após 48 h, o soro foi privado de 0,5 por cento de FBS por 12 h antes de adicionar 5 ng/mL de TGF-&1,
4.7. Determinação dos Valores IC50
Após uma incubação durante a noite em meio de inanição contendo {{0}},5 por cento de FBS, as células HSC foram semeadas em uma 96-placa de poço a uma densidade de 5 x 104 células/mL por 24 h. As células HSC foram tratadas com CPhGs, echinacoside e acteoside em diferentes concentrações (0, 3,90625, 7,8125, 15,625,31,25, 62,5, 125, 250 e 500 ^g/mL) por 48h. Cada concentração tinha quatro poços. Ao final do tratamento, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazólio] (Sigma; 5 mg/mL) foi adicionado e as células foram incubadas por mais 4 h. DMSO (200 rL) foi adicionado a cada poço após a remoção do sobrenadante. Após agitação da placa por 10 min em shaker, os valores de IC50 foram obtidos medindo-se a absorbância no comprimento de onda de 490 nm usando um instrumento de marcação enzimática (Benchmark PLUS, Hercules, CA, EUA), este ensaio foi feito em triplicata. Os valores de IC50 de CPhGs, echinacoside e acteoside foram 119,125, 520,345 e 6,999 Rg/mL, respectivamente.
4.8. Os Efeitos da Inibição da Proliferação Celular e a Viabilidade Celular
As células HSC foram expostas a diferentes concentrações de CPhGs (25,50,100 Rg/mL), echinacoside (125,250,500 Rg/mL) e acteosídeo (1,5,3, 6 Rg/mL). Diferentes concentrações de CPhGs, echinacoside e acteoside foram aplicadas na placa em quatro poços consecutivos e incubadas por 48 h. Os efeitos de inibição da proliferação celular e o nível de viabilidade celular (com base na medição da atividade de LDH liberada das células danificadas no sobrenadante [36]) foram determinados por um ensaio MTT. A taxa de inibição foi calculada usando a seguinte fórmula [37]:
Taxa de inibição ( por cento ) " [1 - (absorvância média do grupo experimental/absorvância média do grupo de controle em branco)] x 100 por cento
De acordo com as instruções do kit,
LDH (U/L) {{0}} (OD medido - OD de controle)/(OD padrão - OD em branco) x 0,2 mmol/L x 1000
Nosso estudo preliminar mostrou que CPhGs, echinacoside e acteoside não afetaram a viabilidade celular.
4.9. Atividades antiproliferativas por TGF-^1
HSC ativado por TGF-p1 tem sido considerado associado à fibrose hepática, e a inibição do crescimento de HSC foi proposta como um método para o tratamento da fibrose hepática [36,38]. Os efeitos antiproliferativos de CPhGs, echinacoside e acteoside em HSCs ativados por TGF-p1 foram determinados por um ensaio MTT [39]. Usando os procedimentos e concentrações de drogas conforme descrito, o
os grupos experimentais incluíram o grupo controle, grupo TGF-pi, TGF-pi mais diferentes grupos de drogas de concentração. Todos os grupos celulares, exceto o grupo controle, foram cultivados com DMEM contendo 5,0 ng/mL de TGF-p1 (sem FBS) por 24 h. A atividade inibitória na proliferação celular foi calculada como 100 x (absorvância do composto tratado - absorbância da luz de fundo)/(absorvância do modelo - absorbância da luz de fundo).
4.10. Reação em Cadeia da Polimerase de Transcrição Reversa (RT-PCR)
O nível de expressão de mRNA de smad2, smad3 e smad7 foi determinado por PCR em tempo real. Para determinar a expressão de mRNA em células HSC, as células (5 x 104 células) foram semeadas em placas de seis poços com 3,0 mL de DMEM com 10 por cento de FBS e incubadas durante a noite a 37 graus e 5 por cento de CO2. Depois que o meio de cultura foi alterado para DMEM sem soro, CPhGs (100,50,25 µg/mL), equinacosídeo (500.250.125 µg/mL) e acteosídeo (6, 3,1,5 µg/mL) foram adicionados aos poços. Após incubação por 48 h com CPhGs e composições de monômeros, o RNA total foi extraído usando reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e agitado vigorosamente com clorofórmio por 15 s. Depois de deixar repousar à temperatura ambiente durante 3 min, o lisado foi centrifugado a 12,000 xg durante 15 min a 4 graus. O RNA na fase aquosa foi precipitado com isopropanol e a fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo de microcentrífuga. O RNA foi precipitado pela adição de 0,75 por cento de etanol, após o que o tubo de microcentrífuga foi centrifugado a 12,000 xg a 4 graus por não mais que 5 min. O sobrenadante foi removido e o RNA foi seco à temperatura ambiente por 5-10 min. Os primers (Sangon) foram projetados usando Batch Primer 3 e estão listados na Tabela 4. Os resultados foram normalizados para o mRNA do gene housekeeping p-actina como controle interno e são apresentados como níveis relativos de mRNA. As reações foram realizadas com 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 par de primers pM, 8,5 de água destilada e 2,5 rL de cDNA.
Cada reação em cadeia da polimerase foi realizada sob as seguintes condições: 95 graus por 3 min, depois 40 ciclos de 10 s a 95 graus, 30 s a 55 graus e 10 s a 55 graus -95 graus para extensão, seguido por uma única medição de fluorescência. Os resultados finais foram descritos com os valores relativos (2_AACt). O cálculo e a análise foram realizados pelo iQ5 Real Time PCR Detection System.
4.11. Análise Western Blot
Os extratos de células inteiras foram preparados usando tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) com 1 por cento de inibidor de protease Halt e coquetéis de inibidor de fosfatase Halt a 1 por cento (Thermo Fisher Scientific, Inc.). A proteína total foi utilizada para a detecção de smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 e smad7. A concentração de proteína foi medida e quantificada pelo método de Bradford. A proteína (10-30 Rg) foi separada em um gel SDS-PAGE 10 por cento e transferida para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Boston, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas por 1h à temperatura ambiente com 5% de albumina de soro bovino e os anticorpos primários (anticorpo policlonal smad2, anticorpo p-smad2, mAb de coelho smad3 e mAb de coelho p-smad3, diluição 1:1000; mAb de coelho de smad7, 1 :200 diluição, anticorpo monoclonal p-actina, 1:5000 diluição) foram incubados a 4 graus durante a noite. O Alk-Phos correspondente. anticorpos secundários conjugados foram incubados à temperatura ambiente. Finalmente, as membranas foram lavadas três vezes com 1 x Tris-HCl salina com 0,1 por cento de Tween 20, e os sinais foram escaneados e visualizados por um GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A análise densitométrica foi realizada nas proteínas de interesse e normalizada para p-actina pelo software GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). A p-actina foi usada como controle interno.
4.12. Análise estatística
Os dados foram expressos como média 土 desvio padrão (DP). As análises estatísticas foram realizadas usando o software SPSS 16.0 (Xinjiang Medical University). A análise Probit foi usada para analisar os valores de IC50. A significância da diferença foi calculada pelo teste ANOVA one-way, e valores com p < 0,05="" foram="" considerados="" estatisticamente="">
5. Conclusões
Em conclusão, CPhGs de C. tubulosa e seus componentes echinacoside e acteoside apresentam efeitos antifibróticos significativos. Entre eles, a atividade do acteosídeo é a mais potente, enquanto a atividade dos CPhGs está entre os dois compostos. A inibição da ativação da sinalização TGF-p1/Smad pode ser o mecanismo subjacente pelo qual os CPhGs protegem contra a doença hepática crônica associada à fibrose, e o echinacoside e o acteosídeo são a base material antifibrótica eficaz de C. tubulosa.
Agradecimentos:Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81260624). Os autores gostariam de expressar seus sinceros agradecimentos ao Professor Tao Liu por sua melhoria na redação deste artigo.
Contribuições do autor:TL, JZ, S.-PY, LM e S.-LZ conceberam e projetaram os experimentos. S.-PY, TL e JZ analisaram os dados. S.-PY e JZ escreveram o manuscrito. TL, LM e JZ revisaram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Conflitos de interesse:Os autores declaram não haver conflito de interesses.
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