Abstrato

Extratos aquosos de etanol de caules em pó de Dendrobium loddigesii forneceram três novos fenólicos, incluindo três-7-O-etil-9-O-(4-hidroxifenil)propionil-diacilglicerol (1), (R){{ 7}},5,4'-tri-hidroxi-3,3', -trimetoxibibenzil (2) e (S)-5,5',7-tri-hidroxi-3',4' -dimetoxifavanona (3), juntamente com onze análogos conhecidos. Suas estruturas foram determinadas por extensa análise espectroscópica. Para identificar antioxidantes naturais, clareadores e agentes antienvelhecimento, as habilidades desses fenólicos foram avaliadas para eliminar o radical 1,2-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), suas habilidades para inibir a produção de tirosinase e suas habilidades para estimular a produção de colágeno pelo ensaio de fibroblastos dérmicos humanos adultos (HDFa). Verificou-se que os compostos 1, 4–8, 13 e 14 exibiram atividades significativas de eliminação de radicais DPPH, o composto 10 exibiu atividade inibitória da tirosinase (IC50 370,904 ug/mL) e o composto 9 mostrou produção significativa de colágeno com um valor EC50 de 3,182 ug/mL. Esses resultados sugerem que os constituintes fenólicos de D. loddigesii podem ser candidatos a antioxidantes, clareadores da pele e/ou agentes antienvelhecimento.

De acordo com estudos relevantes,cistancheé um comumervaque é conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu componente principal écistanósido, que tem vários efeitos, comoantioxidante, anti-inflamatório, epromoção da função imunológica. O mecanismo entre cistanche eClareamento da pelereside no efeito antioxidante deglicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação detirosinacatalisada pela tirosinase, e a reação de oxidação requer a participação de oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, assiminibindo a produção de melanina.

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Resumo gráfico

1. Introdução

O gênero Dendrobium (Orchidaceae) contém aproximadamente 1500 espécies globalmente, das quais cerca de 80 espécies crescem na China [1]. Os caules de várias plantas deste gênero são conhecidos como "Shi-Hu", que têm sido usados ​​por milhares de anos como medicina tradicional chinesa e remédios populares para o tratamento de gastrite atrófica crônica, envelhecimento da pele, febre, doenças cardiovasculares e um tônico para promover a produção de fluidos corporais [2]. Estudos anteriores sobre este gênero levaram ao isolamento de uma série de polissacarídeos, compostos fenólicos, alcalóides e sesquiterpenóides [1, 3-5], alguns dos quais possuem várias bioatividades, incluindo anti-inflamatórias [6], antimicrobianas [2], antioxidantes [7], antitumoral [8], antiagregante plaquetário [9], imunomodulador [10] e contra atividades de influenza A [11].

Dendrobium loddigesii, uma erva epífita perene, é amplamente distribuída na área sudoeste da China, como nas províncias de Guangxi, Guizhou e Yunnan [12]. Seu caule tem sido aplicado na medicina popular para tratar gastrite, febre e tontura [13]. Continuando a busca por produtos naturais estruturalmente diversos e biologicamente ativos deste gênero [1, 5, 14–17], uma investigação aprofundada dos constituintes farmacologicamente ativos desta espécie de planta foi realizada aqui. Como resultado, três novos compostos fenólicos (1–3), bem como onze conhecidos (Fig. 1) foram isolados de um extrato etanólico a 80 por cento do caule de D. loddigesii. O isolamento, elucidação da estrutura e avaliação biológica desses compostos são aqui apresentados.

2 Resultados e Discussão

O composto 1, obtido como um sólido branco, deu uma fórmula molecular de C21H26O7 conforme determinado pelo íon (-)-HRESIMS em m/z 389,1602 [M−H]− (calculado para C21H25O7, 389,16{{ 28}}6) com nove graus de insaturação. O espectro 1 H NMR de 1 contém sete prótons aromáticos em δH 6,85 (1H, d, J=1,7 Hz), 6,75 (1H, d, J=8,0 Hz), 6,68 (1H , dd, J = 8.0, 1,7 Hz), 7,01 (2H, d, J = 8,5 Hz) e 6,68 (2H, d, J = 8,5 Hz), sugerindo a presença de um anel de benzeno 1,3,4-trissubstituído e um anel de benzeno 1,4-dissubstituído. Seu espectro de 13C NMR exibiu 21 ressonâncias de carbono, incluindo dois metils (um metoxi), quatro metileno alifático, nove metinos (dois sp3, sete sp2) e seis carbonos quaternários (um carbonil, cinco olefínicos, incluindo três oxigenados). As correlações HMBC (Fig. 2) de H-7/C-1 (δC 131,6), C-2 (δC 111,7), C-6 (δC 121,4), C -8 (δC 74,2), e C-10 (δC 65,3); H-9/C-7 (δC 83,8) e C-8 (δC 74,2); H-10/C-11 (δC 15,6); 3-OMe (δH 3,81)/C-3 (δC 149,1), juntamente com correlações de H-7/H-8/H2-9 e H{{ 87}}/H3-11 do espectro 1 H–1 H COSY (Fig. 2) indicou a presença de 7-O-etilguaiacilglicerol [18]. Foi relatado que J7,8 foi de cerca de 5 Hz para o isômero eritro e 7 Hz para os três isômeros nos casos de seringas-gliceróis e derivados de diacilglicerol. Assim, o composto 1 foi considerado os três isômeros com J7,8 (6,5 Hz) [18]. As correlações HMBC de H-7' (δH 2,79, t, J = 7,5 Hz)/C-8' (δC 37,1), C-1' (δC 132,7), C-2', 6' (δC 130,2) e C-9' (δC 174,6), H-8' (δH 2,59, t, J = 7,5 Hz)/C-7' (δC 31,0), C-1' e C-9', juntamente com picos cruzados COSY de H-8'/H-7' indicados a presença de ácido p-hidroxicumárico [19]. Com base nas evidências descritas acima, 1 foi proposto como tendo uma porção 7-O-etilguaiacilglicerol e um ácido p-hidroxi-cumárico por meio de uma ligação éster. A correlação HMBC de H-9 para C-9' sugeriu que a ligação éster estava entre C-9 e C-9'. Assim, a estrutura de 1 foi determinada como mostrado.

(R){{0}},5,4'-Trihidroxi-3,3', -trimetoxibibenzil (2) foi obtido como um sólido branco. O espectro HRESIMS de 2 exibiu um pico de íon quasimolecular em m/z 319,1180 [M−H]− (calculado para C17H19O6, 319,1187) com 8 graus de insaturação. O espectro de 1 H NMR de 2 mostrou três grupos metoxila em δH 3,75 (3H, s), 3,70 (3H, s) e 3,17 (3H, s); um próton metino oxigenado em δH 4,13 (1H, t, J=6,8 Hz, H- ); dois sinais de metileno em δH 2,73 (1H, dd, J=13,5, 6,9 Hz) e 2,96 (1H, dd, J=13,5, 6,9 Hz); e cinco prótons aromáticos, aparecendo como um anel aromático 1,3,4,5-tetrasubstituído em δH 6,28 (1H, d, J=1,8 Hz) e 6,34 (1H, d, J{{ 60}},8 Hz), e um anel aromático 1,3,4-trissubstituído em δH 6,49 (1H, d, J=2,0 Hz), 6,62 (1H, d, J=8.0 Hz) e 6,52 (1H, dd, J = 8.0, 2,0 Hz). Os espectros de 13CNMR e DEPT de 2 mostraram três oximetileno, um metileno, um metino oxigenado e 12 carbonos aromáticos (cinco oxigenados). A comparação de seus dados de RMN (Tabela 1) com os da dendrocandina C [20] mostrou grandes semelhanças, exceto pela presença de mais um grupo metoxila, localizado em C-3' pelas correlações HMBC de 3'-OMe e H-5' para C-3' (δC 148,4). Além disso, as múltiplas interações HMBC (Fig. 2) de 3-OMe e H-2/C-3 (δC 149,5); -OMe/C- (δC 86,9) sugeriu os outros grupos metoxilo em C-3 e C-, respectivamente. A configuração absoluta em C- foi determinada como R com base na rotação óptica negativa ([훼] 26 D –12,46), semelhante ao áfilo D [훼] 20 D –20,3, MeOH) [15]. Consequentemente, a estrutura de 2 foi determinada como mostrado.

(S){{0}},7,5′-Trihydroxy-3′,4′-dimetoxifavanona (3) foi obtido como um pó amorfo amarelo e tinha o C17H16O7 molecular (1{{69} } índices de deficiência de hidrogênio) de acordo com o íon (-)-HRESIMS em m/z 331,0819 [M – H]- (calculado 331,0823). Os máximos de absorção UV em 206 e 294 nm indicaram a presença de uma flavanona [21]. O espectro 1 H NMR (Tabela 1) mostrou três sinais na região não aromática colocada em δH 5,29 (1H, dd, J=12.7, 3,1, H-2), 3,04 (1H, dd, J=17.1, 12.7, H-3ax) e 2.71 (1H, dd, J=17.1, 3.1, H-3 eq), quatro prótons aromáticos δH 5,87 (1H, d, J=2.2, H-6), 5,91 (1H, d, J=2.2, H-8), 6,62 (1H, d, J=2.0, H-2ʹ) e 6,61 (1H, d, J=2.0, H-6ʹ), dois grupos metoxil δH 3,83 (3H, s) e 3,77 (3H, s). Os espectros de 13C NMR e DEPT (Tabela 1) contêm ressonâncias para 17 carbonos, incluindo dois metoxis, um metileno, um metino, um carbono carbonílico e 12 carbonos aromáticos. A análise abrangente de seus dados de RMN indicou que sua estrutura planar está intimamente relacionada à da diidrotricina [22], exceto para as ressonâncias OH-4' e OCH3-5' na diidrotricina que foram transpostas em 3. Isso foi confirmado pelo cruzamento de HMBC picos (Fig. 2) de H-2', H-6' e OCH3-4' a C-4' (δC 137,7), de H-6' a C-5' (δC 151,8). A configuração absoluta em C-2 foi postulada como estando na forma S com base em um valor negativo de rotação específica (– 46,64, MeOH) em sua rotação óptica [23]. Portanto, a estrutura do composto 3 foi assim atribuída inequivocamente como mostrado.

Onze compostos conhecidos foram identificados como trepidação 4 [24], mescalina 5 [25], 4,5,4'-trihidroxi- 3,3'-dimetoxibibenzil 6 [26], 4',5- dihidroxi-3,3′-dimetoxibibenzil 7 [27], Tristin 8 [28], batatas em III 9 [27], 3,5,3′-hidroxibibenzil 10 [29], aphyllous C 11 [15], dentiform A 12 [30], dihidroconiferil dihidro-p-cumarato 13 [31], p-hidroxifenil transferulado 14 [32] por análise espectroscópica e comparando seus dados espectrais com a literatura.

Os compostos fenólicos são uma parte essencial da dieta humana e são conhecidos como poderosos antioxidantes devido à sua potente ação de quebra de cadeia e podem contribuir diretamente para a atividade antioxidante [33]. O ensaio de eliminação de radicais DPPH é um dos métodos mais comuns e relativamente rápidos usados ​​para avaliar a atividade antioxidante. Compostos que podem doar um átomo de hidrogênio para o radical DPPH, e então dar origem à forma reduzida do DPPH, serão considerados potenciais agentes antioxidantes. Todos os compostos foram avaliados quanto às suas atividades de eliminação do radical DPPH. Os presentes resultados (Tabela 2) mostraram que a maioria dos compostos fenólicos (1, 4–8, 13 e 14) apresentou atividades significativas com capacidades de eliminação variando de 89,411 a 94,278 por cento a 100 ug/mL.

Por outro lado, a tirosinase é uma enzima contendo cobre e desempenha um papel crítico no controle da via de biossíntese da melanina nos melanócitos [34]. Portanto, os inibidores de tirosinase tornaram-se constituintes importantes de cosméticos ou medicamentos para hiperpigmentação e desenvolvimento de agentes clareadores da pele. No presente estudo, todos os isolados foram avaliados quanto à sua atividade inibidora da tirosinase (Tabela 2). O ácido kójico, um suposto agente clareador da pele, foi usado como controle positivo. O 3,5,3'-hidroxibibenzil (10) revelou uma atividade inibitória significativa com um valor de IC50 de 37,904 ug/mL. Aphyllals C (11) apresentou inibição moderada (IC50, 152,56 ug/mL). Todos os compostos restantes foram inativos em concentrações de até 200 ug/mL. Neste estudo, pode-se concluir que os compostos 10 e 11 podem ser um potencial candidato para o tratamento de doenças de pele relacionadas à biossíntese de melanina.

Considerando que esta espécie é usada medicinalmente para o envelhecimento da pele, uma vez que o colágeno é fundamental para a força e elasticidade da pele, e sua degradação leva a rugas que acompanham o envelhecimento [35]. Portanto, todos os compostos também foram avaliados propositadamente quanto aos seus efeitos na produção de colágeno em HDFa. Os resultados (Tabela 2) mostraram que o composto 9 estimula significativamente a atividade de produção de colágeno HDFa (EC50 30,182 ug/mL). Os compostos 6 e 7 apresentaram atividades mais fracas, com produção de colágeno de 33,062 por cento e 29,157 por cento a 10 ug/mL, respectivamente. Os presentes resultados não apenas apoiaram o uso etnofarmacológico de D. loddigesii, mas também forneceram um modelo de estrutura confiável para o desenvolvimento de doenças associadas à deficiência de colágeno, como queimaduras e úlceras.

3 Experimental

3.1 Procedimentos experimentais gerais

3.2 Material Vegetal

Os caules de D. loddigesii foram coletados em setembro de 2014 na cidade de Wenshan, província de Yunnan, República Popular da China, e identificados pelo professor Hong Yu (Universidade de Yunnan, Kunming, República Popular da China). O espécime de comprovação (No. 20.140.829) foi depositado no Laboratório Estatal Chave de Fitoquímica e Recursos Vegetais no Oeste da China, Instituto Kunming de Botânica, Academia Chinesa de Ciências.

3.3 Extração e Isolamento

Os caules secos e em pó (10,2 kg) de D. loddigesii foram extraídos três vezes com 80 por cento de etanol à temperatura ambiente e concentrados sob pressão reduzida. Em seguida, o resíduo foi suspenso em H2O e particionado com EtOAc para obter a fração EtOAc (220 g), que foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel eluída com um gradiente de éter de petróleo/acetona (15:1 a { {110}}:1) para pagar 22 frações (Fr.1–22). Fr.11 (6 g) foi submetido a sílica gel CC eluída com CHCl3/MeOH (300:1), seguida por coluna MCI (gradiente de MeOH/H2O, 60:40–95:5) e sílica gel CC (CHCl3/ MeOH, 200:1) para produzir 12 (4 mg). Fr.13 (850 mg) foi separado em uma coluna de MCI (MeOH/ H2O, 60:40 a 95:5) para dar cinco frações (Fr.13.1–Fr.13.5). Fr.13.4 (150 mg) proporcionou os compostos 4 (3 mg) e 5 (5 mg) por preparação de HPLC (MeOH/H2O, 60:40). Fr.16 (19 g) foi cromatografado em coluna de gel de sílica eluída com CHCl3/MeOH (100:1 a 20:1) para gerar 6 subfrações (Fr.16.1–Fr.16.6). Fr.16.4 (2,3 g) foi aplicado coluna MCI eluída com MeOH/H2O (50:50–100:0) e depois fracionada em uma coluna de Sephadex LH-20 (MeOH/ H2O, 90:10) para rendimento 7 (716 mg) e 13 (39 mg). Usando as mesmas condições de Fr.16.4, Fr.16.6 (240 mg) forneceu o composto 9 (7 mg). Fr.18 (10 g) foi separado por sílica gel CC (CHCl3/MeOH, 100:1–20:1), depois passado por MCI (gradiente MeOH/H2O, 50:50–100:0) e Sephadex LH{{ 96}} (MeOH/H2O, 90:10) colunas para produzir 3 (25 mg) e 11 (4 mg). Fr.19 (20 g) foi submetido a uma coluna MCI eluída com MeOH/H2O (30:70–100:0) para obter sete frações (Fr.19.1–Fr.19.7). Fr.19,5 (2,3 g) foi separado por coluna repetida de gel de sílica (CHCl3/MeOH, 30:1) para gerar 8 (15 mg) e 10 (7 mg). Fr.19.6 (4,3 g) foi fracionado em uma coluna de gel de sílica (CHCl3/MeOH, 30:1) para dar 5 frações (Fr.19.6.1– Fr.19.6.5). Fr.19.6.1 (1,2 g) foi submetido a coluna de sílica gel (CHCl3/MeOH, 30:1) e após purificação por HPLC (MeOH/H2O, 45:55), fornecendo 1 (15 mg). Fr.19.6.3 (540 mg) foi aplicado a uma coluna de coluna Sephadex LH-20 eluída com MeOH/H2O (90:10) e depois purificada por HPLC semipreparativa (MeOH/H2O, 45:55) para fornecer 2 (6 mg) e 6 (5 mg). Fr.20 (12 g) foi aplicado a uma etapa cromatográfica de gel MCI (MeOH/H2O, 30:70–100:0) e, em seguida, foi submetido a gel de sílica CC (CHCl3/MeOH, 30:1) para dar 14 (21 mg).três{{0}}O-Etil-9-O-(4-hidroxifenil) propionil-diacilglicerol (1): sólido branco; [ ]D 26 – 3,72 (c 0,51, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 203 (4,53), 225 (4,17), 280 (3,66) nm; IR (KBr) νmax 3426, 1727, 1516, 829 cm-1; 1H e 13C RMN (CD3OD), ver Tabela 1; ESIMS m/z 389 [M−H]−, HRESIMS m/z 389,1602 [M−H]− (calculado para C21H25O7, 389,1606).

(R)-4,5,4'-Trihidroxi-3,3', -trimetoxibibenzil (2): pó branco amorfo; [ ]D 26 –12,46 (c 1,07, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 204 (4,59), 286 (3,75) nm; IV (KBr) vmax 3418, 1607, 1517, 1455, 1434, 796 cm-1; 1H e 13C RMN (CD3OD), ver Tabela 1; ESIMS m/z 319 [M−H]−, HRESIMS m/z 319,1180 [M−H]− (calculado para C17H19O6, 319,1187).

(2S)-5,7,3'-Trihidroxi-6,4,5-trimetoxifavona (3): pó amorfo amarelo; [ ]D 26 – 46,64 (c 0,46, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 206 (4,70), 294 (4,17) nm; IR (KBr) νmax 3335, 2940, 1641, 1514, 1462, 1345, 1434, 1182, 1091, 998, 833 cm-1; 1H e 13C RMN (CD3OD), ver Tabela 1; ESIMS m/z 331 [M−H]−, HRESIMS m/z 331,0819 [M−H]− (calculado para C17H15O7, 331,0823).

3.4 Ensaio de atividade de eliminação de radicais DPPH

O ensaio da atividade sequestradora de radicais livres foi realizado de acordo com o método anterior [36] com algumas modificações. Resumidamente, 30 amostras de μL (1000 ug/mL, dissolvido em etanol) e Trolox (1 mM) foram adicionados a 270 μL de solução de DPPH (100 μM, dissolvido em metanol), respectivamente. A reação prosseguiu por 1 h a 37 graus em uma microplaca 96-poço. A absorbância foi então lida a 515 nm e a porcentagem da atividade total de eliminação de radicais foi calculada usando a seguinte fórmula: porcentagem de inibição =[(A0− A1)/A0]×100 por cento, onde A0 é a absorbância do DPPH sem amostras (reação de controle) e A1 é a absorbância do DPPH incubado com as amostras. Todos os testes foram realizados em triplicata e o Trolox foi usado como agente de controle positivo.

3.5 Ensaio Inibitório da Tirosinase de Cogumelo

A inibição da atividade da tirosinase foi determinada espectrofotometricamente de acordo com o método descrito anteriormente [36] com algumas modificações. Resumidamente, diferentes concentrações de compostos de teste foram preparadas em 10 por cento de DMSO. Cada solução de amostra (20 μM) foi misturada com L-Dopa (1,25 mM) e diluída com 970 μL de 0,05 mM de tampão de fosfato de sódio (PBS, pH 6,8) nos tubos de ensaio. A reação foi iniciada pela adição de tirosinase de cogumelo (25 U/mL). A mistura reacional foi incubada por 5 minutos em temperatura ambiente. A quantidade de Dopachrome na mistura foi determinada pela medição da absorbância de cada poço a 490 nm. O ácido kójico foi usado como controle positivo. A porcentagem inibitória da tirosinase foi calculada de acordo com a seguinte equação: Inibição percentual=[(A0− A1)/A0] × 100 por cento , onde A0 é a absorbância do Dopacromo sem compostos de teste (reação de controle) e A1 é a absorvância do Dopacromo incubado com os compostos de teste.

3.6 Produção de Colágeno por Ensaio HDFa

Agradecimentos Este projeto foi apoiado financeiramente pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Yunnan (Nos. 2017ZF003-04, 2015HB093 e 2019HA001). Os autores agradecem à equipe do grupo analítico do State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, pelas medições de todos os espectros.

Conformidade com os Padrões Éticos

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