Compostos fenólicos de folhas e flores de hibiscus roseus: potenciais aplicações cosméticas para a pele de uma espécie pouco investigada

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Abstrato:O uso de extratos vegetais em cosméticos para a pele é uma tendência moderna devido à sua riqueza em polifenóis que atuam como moléculas antienvelhecimento. a rosa de hibisco é uma espécie perene naturalizada na Itália, com lindas flores rosas suaves; sua composição fenólica e atividades biológicas ainda não foram estudadas. O objetivo deste estudo foi caracterizar e quantificar os fenólicos e avaliar as atividades antioxidante, fator de proteção solar (SIPF) e anticolagenase dos extratos etanólicos de folhas (HL) e flores (HE) de H. roseus.p- Derivados dos ácidos cumárico, clorogênico e transferúlico, assim como os flavonóides quercetina e kaempferol, foram os principais compostos fenólicos detectados. Catequina, epicatequina, kaempferol-3-O-rutinosídeo, kaempferol-3-O-glicosídeo, kaempferol-7-O-glicosídeo, salidrosídeo, oenina e peonidina-3-O-glicosídeo foram detectados apenas no HF, enquanto a floridzina foi exclusiva do HL, que também apresentou maiores quantidades de derivados do ácido hidroxicinâmico. O HF foi mais rico em flavonóides e fenólicos totais, exibindo também maior capacidade antioxidante.bioflavonóidesA atividade SPF e anti-colagenase de ambos os extratos foram semelhantes e comparáveis ​​às dos padrões sintéticos. Os resultados gerais demonstram que os extratos de H. roseus são fontes promissoras de compostos fenólicos bioativos que podem ser potencialmente aplicados como agentes antienvelhecimento em cosméticos para cuidados com a pele.

Palavras-chave:anti-colagenase; antioxidante; flavonóides; flores; cosméticos à base de plantas; ácidos hidroxicinâmicos; LC-MS/MS-MRM; folhas; cuidados com a pele; proteção solar

1. Introdução

O uso de cosméticos é antigo, e sua história se molda em paralelo com a da humanidade [1,2]. Cosméticos para cuidados com a pele são alguns dos produtos mais importantes, é a principal categoria nesta indústria [1,3]. Portanto, o interesse pelos cuidados com a pele tornou-se generalizado, desencadeando a demanda por produtos eficazes derivados de fontes naturais [2].

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A recente conscientização sobre o meio ambiente, a saúde e o uso menor de produtos químicos sintéticos levaram a um crescente interesse em cosméticos à base de plantas, que agora representam um terço de todo o setor de cosméticos [1A]. Assim, o uso de extratos vegetais e seus fitoconstituintes como ingredientes ativos é uma abordagem "pró-ecológica" moderna [5,6]. A crescente demanda por esses produtos pode ser devido aos seus efeitos colaterais reduzidos, seu amplo espectro de ação combinado com uma alta eficácia e seus preços geralmente baixos [7,8].

As plantas são ricas em várias classes de compostos bioativos, sendo uma das fontes mais abundantes de novos ingredientes responsáveis ​​pelo tratamento de muitas doenças [9,10]. Além disso, as plantas também são fontes de hidratantes naturais, aromatizantes e pigmentos, o que as torna muito interessantes para aplicações cosméticas na pele [5]. Finalmente, os extratos vegetais são geralmente considerados seguros e atendem aos requisitos das autoridades reguladoras [10,11].

Dentre os compostos presentes em extratos vegetais, os fenólicos têm ganhado atenção especial como ingredientes ativos[12,13], principalmente por se destacarem como agentes anti-inflamatórios, antimicrobianos e antioxidantes[14,15]. Essas propriedades as tornam moléculas preventivas e curativas ideais para doenças da pele, sendo aplicadas em cosmetologia e dermatologia [16]. A notável atividade antioxidante dos fenólicos também é parcialmente responsável por seus efeitos antienvelhecimento, possivelmente devido à sua capacidade de reduzir a degradação do colágeno e fornecer proteção UV [16]. Portanto, o uso de extratos naturais ricos em fenólicos com alta capacidade antioxidante tem sido investigado e incentivado para a substituição de antioxidantes sintéticos em produtos para a pele [12].

Cistanche pode anti-envelhecimento

Produtos naturais extraídos de plantas da família Malvaceae são utilizados mundialmente, e o gênero Hibiscus tem ganhado grande atenção pelas múltiplas atividades farmacológicas de seus extratos e pela alta abundância fenólica [17-19]. Hibiscus spp. contém cerca de 240 espécies de ervas, arbustos ou árvores com flores anuais ou perenes, distribuídas em diferentes regiões do mundo [20]. Extratos de hibisco têm sido aplicados na medicina tradicional como emolientes para o tratamento de muitos distúrbios da pele e queimaduras [19,21].comprar cistancheCom base nesses dados da literatura, extratos de Hibiscus sp. plantas podem ser ingredientes ativos interessantes para formulações cosméticas para a pele, protegendo as células do estresse oxidativo, da degradação do colágeno e dos efeitos nocivos da radiação UV.

Embora o gênero Hibiscus inclua muitas espécies, menos de 10% delas foram investigadas até agora [17]. Hibiscus roseus Thore(sin. H.palustris L., H.moscheutos subsp. palustris (L.) RT Clausen.) é uma espécie anherbácea perene naturalizada na Itália [22,23]A identificação e descrição de H. roseus ainda estão em debate[ 20,23]. De acordo com a literatura, a espécie H. moscheutos subsp. palustris foi introduzido muito cedo na Europa, enquanto na França foi descrito como uma nova espécie, H. roseus, por Thore em 1807 [23]. Esta espécie não foi caracterizada por sua composição fenólica e estudada por suas atividades biológicas, o que a torna uma fonte potencial não revelada de compostos bioativos para produtos de cuidados com a pele.

O uso popular em tratamentos de pele e o amplo espectro de bioatividades das espécies de Hibiscus justificam a importância de novos estudos focados neste gênero de plantas [17]. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a composição fenólica e avaliar a capacidade antioxidante, proteção solar e atividade de inibição da colagenase dos extratos etanólicos de folhas e flores de H. roseus. Nossos resultados apresentam pela primeira vez a composição fenólica e as bioatividades relacionadas ao antienvelhecimento de H. roseus, indicando o potencial desta espécie pouco investigada nas aplicações medicinais e cosméticas como aditivo antioxidante e antienvelhecimento.

2. Resultados e Discussão

2.1. Caracterização e Quantificação Fenólica

Uma análise alvo, baseada em LC-MS/MS-MRM (cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa em tandem trabalhando no modo de monitoramento de reações múltiplas), foi conduzida para tentar identificar os compostos fenólicos presentes em extratos etanólicos de H. roseus desde a composição fenólica de esta espécie ainda não foi relatada na literatura. Dezenove compostos fenólicos previamente descritos no gênero Hibiscus foram usados ​​como padrões (Tabela Suplementar S1) para desenvolver o método MRM, sendo a seleção das melhores transições desenhadas pela otimização dos parâmetros instrumentais e por dados da literatura [24].

The main classes of compounds detected in H.roseus leaf and flower extracts were chlorogenic, p-coumaric, and trans-ferulic acids derivatives and flavonoid derivatives (Figure 1,Table 1), similarly to the previous phytochemical characterization of other Hibiscus species[25-29]. Although the phenolic profile was quite similar, some qualitative differences were observed between flowers (HF) and leaves (HL)(Figure 1 and Table 1). While leaves showed richness in p-coumaric acid derivatives (Figure 1, blue line, peaks with Rt from 2 to 9 min), flowers were especially rich in flavonoid derivatives such as catechins, dihydrochalcones, and anthocyanins (Figure 1, red line, Rt>9,3 min, Tabela 1).

Treze dos dezenove compostos fenólicos alvo foram autenticamente identificados nos extratos analisados ​​por LC-MS/MS no modo MRM (Tabela 1).cistanchO MRM é um meio poderoso para a determinação simultânea de vários componentes, baseado na relação massa/carga (m/z) do íon molecular (((MH]) e seu íon filho correspondente. e sensibilidade das análises LC-MS/MS [30]Esta metodologia é muito confiável e adequada para análises de extratos de plantas e outras misturas complexas levando à mais alta especificidade, excelente sensibilidade e uma extrema capacidade de multiplexação graças à possibilidade de distinguir compostos com os mesmos íons de origem, mas fragmentos diferentes [31,32]. Usando este método, obtivemos uma redução significativa de corridas cromatográficas, maior especificidade e precisão proporcionada por uma boa separação de compostos detectados com as mesmas transições, evitando perda de sensibilidade no caso de diferentes compostos co-eluindo ou para compostos presentes em concentração muito baixa [24,334].

Entre os 13 compostos fenólicos identificados utilizando padrões autênticos (Tabela Suplementar S1), dez estavam presentes exclusivamente em extratos de flores (Figura 1 linha vermelha, Tabela 1 HF): catequina e epicatequina (picos 16b e 23), ácido clorogênico (pico 18), peonidina-3-O-glicosídeo e oenina (picos 21 e 22), ácido trans-ferúlico (pico 27), três derivados glicosídeos de kaempferol (kaempferol-3-O-rutinosídeo, kaempferol-7-O- glicosídeo e kaempferol-3-O-glicosídeo; picos 30,31b e 32) e salidrosídeo (pico 34). Além disso, floridzina (pico 33b) foi detectada apenas em extratos de folhas (Figura 1 linha azul, Tabela 1 HL), enquanto rutina e quercetina-3-O-glicosídeo (picos 26b e 28a) foram identificados em ambos os tipos de extratos (Figura 1, Tabela 1HF/HL). Derivados semelhantes de quercetina, como quercetina-3-O-sambubiósido e isoquercitrina, foram observados anteriormente em H.sabdariffa [26,29,35,36]e em extratos de H. rosa-sinensis [18]. Alguns desses glicosídeos podem corresponder aos derivados de quercetina que detectamos em H. roseus. Além disso, o tilirosídeo também foi previamente detectado em extratos fenólicos de H. flores sabdariffa [37,38]. Oenina (malvidin-3-O-glicosídeo) e peonidina-3-O-glicosídeo, as duas antocianinas aqui identificadas pela primeira vez em flores de H. roseus, eram diferentes daquelas descritas anteriormente em flores de H. sabdariffa, delfinidina 3-sambubiosídeo, delfinidina-3-glicosídeo e cianidina-3-O-sambubiosídeo [27,35,39,40]. No entanto, é importante mencionar que a parte mais estudada do flores de H. sabdariffa é o cálice (sépalas), não as pétalas como investigado aqui para H.roseus.

Além dos compostos identificados e confirmados pelos padrões alvo autênticos, outros 27 compostos foram supostamente identificados em extratos de folhas e flores de H.roseus com base em seu MRM (m/z) e seus íons filhos, considerando assim os produtos de fragmentação obtidos do precursor (Tabela Suplementar S1). Em particular, a presença de derivados de ácido p-cumárico, trans-ferúlico e clorogênico e derivados de quercetina, bem como derivados de floretina e floridzina foram encontrados em ambos os extratos (Tabela 1).

A quantificação dos fenólicos identificados nestes extratos foi realizada por análise de HPLC-DAD (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção de arranjo de diodos; Tabela 2). O teor de derivados do ácido hidroxicinâmico (THC) foi maior nas folhas do que nas flores, enquanto maiores quantidades de flavonóides (TFC) foram encontradas nas flores do que nas folhas (p.<0.001,table 2).catechin="" derivatives(tcd),dihydrochalcones(tdc),and="" anthocyanins="" (tac)="" were="" quantified="" only="" in="" flower="" extracts(table=""><0.001).therefore, flowers="" represent="" a="" greater="" source="" of="" phenolics="" compared="" to="" leaves="" (tpc,p="0.02," table="" 2).="">cistache AustráliaDa mesma forma que os extratos de H. sabdariffa, as principais classes de compostos encontrados nas folhas de H. roseus foram derivados do ácido clorogênico e p-cumárico, bem como os ácidos cafeoilquínico e p-cumaroilquínico [26,40,41]. Além disso, antocianinas foram relatadas exclusivamente em Hibiscus spp. flores e cálices, juntamente com catequinas [19,28,35].

Em contraste, o ácido ferúlico e seus derivados foram menos relatados como constituintes de Hibis-cus spp. extratos, mas podem ser de grande importância para suas atividades biológicas [6,42-44]. De fato, derivados de ácido ferúlico obtidos de diferentes espécies de Hibiscus mostraram importantes propriedades farmacológicas, como atividades antivirais e inibidoras da enzima conversora de angiotensina [43,44]. Além disso, o ácido ferúlico foi descrito como uma molécula ativa em extratos de H.mutabilis, H.taivanensis[45,46] e em extratos de cálice de H.sabdariffa [28,38].

Em relação às potenciais aplicações cosméticas, foi comprovado que o ácido ferúlico inibe a formação de melanina [6,42], enquanto os derivados do ácido p-cumárico possuem atividades de despigmentação [47,48], anti-inflamatória e inibidora da tirosinase[49]. Além disso, muitas investigações destacam papéis adicionais de flavonóis e antocianinas, que podem atuar como compostos protetores da pele, em particular inibindo a melanogênese [50,51] e através de sua ação como compostos antienvelhecimento e prevenção do melanoma [52,53]. Além disso, as aplicações potenciais de extratos de folha de H. roseus para doenças da pele também podem ser aumentadas pela presença de floridzina, que demonstrou diminuir a expressão de citocinas pró-inflamatórias induzidas por UVB na pele exposta a UV [54].

2.2. Ensaios de Atividade Antioxidante

Atualmente, está amplamente demonstrado que o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs) é responsável pelos processos de envelhecimento da pele, levando ao ressecamento, perda de tecido subcutâneo e formação de rugas [55,56]. Portanto, encontrar compostos antioxidantes naturais que possam ser aplicados em produtos de cuidados com a pele é muito importante para as indústrias cosméticas.

Nossos resultados mostraram que os extratos de folhas de H. roseus apresentaram menor atividade antioxidante (expressa em valores de ECso) do que flores (Tabela 3). 3). Esses resultados concordam com a composição e teor fenólico desses extratos (Figura 1, Tabelas 1 e 2), uma vez que os extratos de HF foram mais ricos em compostos fenólicos (Tabela 2). De fato, a análise de correlação entre os valores de ECso e o teor das diferentes classes de fenólicos mostrou-se significativa e negativa para todos os compostos, exceto para THC. Como tal, maiores quantidades de flavonóides, catequinas, antocianinas, diidrocalconas e conteúdo fenólico total contribuem para maiores capacidades antioxidantes (valores mais baixos de EC50 - Tabela 4).

Entre os flavonoides, a quercetina e seus derivados são os antioxidantes e seqüestradores de radicais livres mais bem estabelecidos, atuando também como inibidores eficazes de oxidases e lipoxigenases [57]. Além disso, diidrocalconas, como a floretina, também foram descritas como potentes antioxidantes em ensaios de eliminação de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e de eliminação de OH[58]. Além disso, antocianinas isoladas de extratos de hibisco mostraram ser os principais compostos antioxidantes em células humanas [59].

Extratos de diferentes partes de espécies de Hibiscus mostraram alta capacidade antioxidante [18,21,27,35,40]. Frações de extratos etanólicos de H. sabdariffa apresentaram valores de EC50 muito baixos em ensaios antioxidantes, que foram correlacionados ao alto teor de ácido protocatecuico [21,59], ácido clorogênico, flavonóides e antocianinas [24,60]. Além disso, um estudo em H. esculentus mostrou o potencial antioxidante in vitro de derivados de quercetina e catequinas presentes em seus extratos[61]. Finalmente, em H.acetosella, a atividade antioxidante foi fortemente correlacionada com o teor de antocianinas [62].

Os resultados de nosso estudo com extratos etanólicos de H. roseus mostraram uma atividade antioxidante cem vezes maior do que a relatada para extratos aquosos de cálice de H. sabdariffl, para os quais a CE foi próxima a 45 mg mL- em um DPPH semelhante in vitro modelo [56] No entanto, em contraste com nossos achados, o conteúdo total de flavonóides e a capacidade antioxidante de extratos de folhas de H. sabdariffa foram maiores do que os de flores[63,64]. 2.3.Fator de Proteção Solar In Vitro (FPS)

A radiação ultravioleta é um dos fatores ambientais mais prejudiciais que influenciam a saúde e a fisiologia da pele, sendo uma importante causa extrínseca do envelhecimento da pele [65,6]A exposição constante à radiação ultravioleta aumenta o risco de distúrbios de pigmentação e fotoenvelhecimento da pele[67]. Isso se deve principalmente ao aumento dos níveis de ROS, o que leva à estimulação da produção de colagenase e resulta em danos consideráveis ​​às funções celulares da pele [56]. Portanto, ingredientes de proteção UV, incluindo aqueles presentes em extratos vegetais, são amplamente aplicados em cosméticos para evitar a penetração da radiação ultravioleta na pele, mas também prevenir a produção de EROs, atuando como antioxidantes.

Um método simples para verificar a eficácia de diferentes componentes naturais como filtros UV é o ensaio do fator de proteção solar (FPS), que é um método in vitro rápido e confiável baseado na triagem da absorbância dentro da região espectral UV-B (entre 290 e 320 nm), sendo útil em uma fase inicial de seleção de ingredientes ativos de fotoproteção [69].

O alto conteúdo fenólico e atividade antioxidante de H.benefícios do cistacheroseus extracts suggest that they may have also an UV absorbing activity. Both leaf and flower extracts of H. roseus at 0.1 mgmL-1 showed comparable SPF results (p>{{0}}.05):2,6±0,15 para HL e 2,4±0,19 para HF. Esses resultados são promissores, uma vez que uma formulação padrão de filtro solar contendo 8% de homosalato (um filtro solar químico amplamente aplicado) apresentou um valor de FPS de 4 [69,70]. Os resultados aqui encontrados para H.roseus foram semelhantes aos encontrados para outras espécies de plantas[68,69,71,72] e são importantes considerando a baixa concentração dos extratos utilizados para testar esse efeito.

Os extratos de H. rosa-Sinensis já demonstraram efeitos positivos contra os danos da radiação ultravioleta na pele de camundongos por meio de proteção antioxidante [73]. Os produtos naturais que apresentam FPS juntamente com altas capacidades antioxidantes e inibição da colagenase e elastase são importantes candidatos a serem usados ​​para proteger a pele dos fotodanos e prevenir o aparecimento de rugas[66,71]. filtros e aqueles derivados de fontes naturais representa uma tendência na indústria cosmética, uma vez que os consumidores percebem esses produtos como mais seguros, devido aos efeitos colaterais dos filtros UV sintéticos[72].

O maior teor de compostos fenólicos totais dos extratos de HF (TPC;Tabela 2) pode indicar sua maior atividade de absorção de UV. No entanto, tanto os extratos de folhas quanto de flores apresentaram resultados muito semelhantes, indicando que mais do que o teor total de fenólicos, o perfil fenólico dos extratos estaria relacionado à proteção contra os raios UV. A Tabela 2) pode contribuir para aumentar o valor do FPS, uma vez que esses compostos têm uma absorção de UV em torno de 300-320 nm [74] que é, portanto, centrada na região UV-B. Por outro lado, flavonóides e antocianinas, principalmente presentes em extratos de flores, têm um espectro de absorbância mais amplo em que pelo menos duas bandas estão presentes, com a banda principal dentro ou próxima da faixa visível, em torno de 350 nm para flavonóis e 505-550 nm para antocianinas [53,69]. De fato, os derivados do ácido hidroxicinâmico são produzidos pelas plantas, especialmente por sua proteção contra a radiação UV [75]. Portanto, esses derivados do ácido hidroxicinâmico podem contribuir muito para a absorção de UV-B pela pele humana [6]. No entanto, considerando a presença de antocianinas e flavonóides que cobrem uma faixa limítrofe de absorção de comprimentos de onda, incluindo também as regiões UV-A e visível, os extratos de flores de H. roseus podem ser promissores para futuras análises e desenvolvimento de produtos cosméticos protetores solares. Além disso, a maior atividade antioxidante observada para HF (Tabela 3) poderia aumentar os efeitos de proteção solar em possíveis formulações adicionais [69].

2.4. Atividade de Inibição da Colagenase

Both H.roseus extracts showed high collagenase inhibitory activity (>80%)at0.25mg mL-1, which is comparable to that of the synthetic inhibitor 1,10-phenanthroline 1M (Figure 2). The IC50 value of both extracts were very similar( >{{0}}.05),IC50extratos de flores =0,14 ± 0,02 mg mL-1 e IC50folha extratos =0,13±0,01 mg mL-1, apesar de suas diferenças na composição e conteúdo fenólico (Tabelas 1 e 2). Isso pode ser devido às interações sinérgicas entre os fenólicos e a colagenase, que podem desempenhar um papel importante no mecanismo de inibição. Além disso, outros compostos possivelmente presentes nos extratos de H. roseus e não analisados ​​aqui podem participar da atividade anti-colagenase, incluindo vitamina E e ácido ascórbico [71,7]. Além disso, os dois compostos padrão testados, ácido clorogênico e quercetina, cujos derivados estão presentes em extratos de folhas e flores de H. roseus (Tabela 1), exibiram uma inibição da colagenase muito alta, com valores de ICso de 5,8±0,5 e 5,6±0,7ug mL -l respectivamente. Portanto, esses compostos podem ser responsáveis ​​pela atividade anti-colagenase observada. É relevante notar que diferentes classes de fenólicos, que também estão presentes em nossos extratos vegetais, já demonstraram atividade antienvelhecimento através da inibição da degradação do colágeno e contribuindo para a umidificação da pele [78]. Por exemplo, o ácido ferúlico e seus derivados comprovadamente hidratam a pele e estimulam a síntese de fibras de colágeno, sendo usados ​​em cosméticos como cremes antirrugas [6]. Além disso, os flavonóis, em particular os derivados da quercetina, são fortes inibidores da enzima colagenase [79].

Nossos resultados mostram o efeito promissor dos extratos de H. roseus contra a degradação do colágeno, que é uma das maiores proteínas responsáveis ​​por perdas na elasticidade e integridade da pele e na formação de rugas [80,81]. A enzima colagenase inibe a retenção da elasticidade da pele e resistência à tração [82]. De fato, diferentes estudos mostraram a importância dos antioxidantes naturais devido à sua eficácia em retardar o envelhecimento prematuro através da inibição da atividade da colagenase [78,83].

Estudos anteriores avaliando os efeitos das espécies de Hibiscus na estimulação da produção de colágeno e na inibição da atividade da colagenase foram realizados [56,84,85]. A inibição da atividade da colagenase de extratos aquosos de H. sabdariffa foi recentemente descrita na literatura [56]. Semelhante aos nossos achados, os autores não observaram os efeitos da inibição da colagenase em baixas concentrações dos extratos, mas apenas em concentrações significativamente altas [56]. Em um estudo diferente, o valor de ICso na inibição da colagenase de extratos etanólicos de H. sabdariffin foi de 0,75±0,04 mg mL-1[65], que é uma atividade que é quase seis vezes menor do que os descritos aqui para H. roseus.

3. Materiais e Métodos

3.1.Material Vegetal

Dez plantas de Hibiscus roseus Thore, adquiridas de um viveiro comercial em Florença (Itália), foram plantadas em vasos de 10-litros preenchidos com solo arenoso (areia/turfa,60:40,v/v) e mantidos em estufa de Departamento de Agricultura, Alimentação, Meio Ambiente e Silvicultura (DAGRI)—Universidade de Florença (UNIFD, Sesto Fiorentino (Itália,43949/N,1137/E). As plantas foram cultivadas na estufa de janeiro a julho de 2019, sob manual irrigação na capacidade de água do vaso. Destas dez plantas diferentes, folhas e flores em dois pools foram coletadas no final de julho durante o período de floração e imediatamente armazenadas a -80 grau até a extração. 3.2. Extração Assistida por Ultrassom

Amostras liofilizadas (900 mg) de flores (HF) e folhas (HL) de H.roseus foram moídas em nitrogênio líquido e extraídas com 3 × 15,0 mL de etanol 75 por cento (pH 2,5 ajustado com HCOOH) por um Extração assistida por ultrassom (EAU). A EAU foi realizada em banho ultrassônico (BioClass@CP104) com frequência constante de 39kHz e potência de entrada de 100 W, por 30 min, a 5 graus. Após centrifugação (5 min,9000 rpm,5 graus; ALC@4239R, Milão, Itália), os sobrenadantes foram particionados com 3×15mL de n-hexano para remover compostos lipofílicos que pudessem interferir na análise. A fase etanólica foi reduzida à secura, pesada em balança analítica digital (Precisa[ 125A), e o resíduo foi ressuspenso com solução acidificada metanol/água (1:1 v/v, pH 2,5 ajustado com HCOOH). O processo de extração foi realizado em triplicata.

3.3. Análise de LC-MS: Perfil Fenólico dos Extratos

A análise de LC-MS foi realizada usando um espectrômetro de massa ABSciex API3000 triplo quadrupolo (AB Sciex LC, Framingham, MA, EUA) acoplado a um sistema de HPLC Agilent 1100 com bomba binária e amostrador automático (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA, EUA ). A aquisição e a redução dos dados foram realizadas com o software Analyst 1.6.2 (AB Sciex LLC, Framingham, MA, EUA).

A separação por HPLC foi realizada em uma coluna Agilent Phenyl (3 × 10 mm;2,7 um), e os eluentes foram (A) água acidificada (a pH 2,5 ajustado com HCOOH) e (B)acetonitrila/ água (90/10, a pH 2,5 ajustado com HCOOH). Foi usado um sistema de solvente de gradiente da seguinte forma: 0-3 min,5 por cento B;3-18 min,5-40 por cento B; 18-28 min,40 por cento B;28-38min, 40-80 por cento B; 38-43min, 80 por cento B,43-45min, 80-5 por cento B, a uma taxa de fluxo de 0,4mLmin -l. A análise de MS foi realizada sob as seguintes condições experimentais: Pressão atmosférica Ionização Química (APCI) usando a interface do nebulizador aquecido; Corrente da agulha （NC）,-5 μA; Gás Nebulizador (ar), 10 (unidades arbitrárias); Gás Auxiliar (ar), 3L min-l; Temperatura de gás auxiliar (TEM), 550 graus; Gás de cortina (CUR, nitrogênio), 6 (unidades arbitrárias); Gás de colisão (CAD, Nitrogênio), 9 (unidades arbitrárias, correspondendo a 2,6 × 10 ~ pressão da célula de colisão Torr).

A identificação dos diferentes componentes fenólicos foi realizada usando uma abordagem direcionada, usando um método de monitoramento de reações múltiplas (MRM), otimizado com padrões para 19 compostos alvo (escolhidos com base em estudos anteriores da composição polifenólica de Hibiscus spp.[25,35] ): dois flavanos-3-ols(catequina e epicatequina), sete flavonóis (quercetagetina-7-O-glicosídeo, rutina, quercetina-3-O-glicosídeo, kaempferol-3-O. rutinosídeo) ( floridzina e floretina), uma oxiflavona (salidroside) e quatro antocianinas (mirtilina, kuromanin, peonidina-3-O-glicosídeo e oenina). O tempo de retenção e as transições de MRM relativas (quantificador e qualificador) foram relatados na Tabela Complementar S1. Além disso, identificações provisórias adicionais foram testadas usando uma abordagem não direcionada, varrendo o quadrupolo de m/z 100 a 100 Da.

3.4. Análise HPLC-DAD: Quantificação de Fenólicos

A análise de HPLC-DAD foi realizada para quantificar as diferentes classes de fenólicos (derivados do ácido hidroxicinâmico, catequinas, diidrocalconas, flavonóides e antocianinas) nos extratos. Alíquotas das amostras (15 μL) foram injetadas em um cromatógrafo líquido Perkin Elmer Flexar equipado com uma bomba quaternária 200Q/410 e um detector de arranjo de diodos LC 200 (DAD) (todos da Perkin Elmer", Bradford, CT, EUA). As condições cromatográficas foram as mesmas usadas para análises HPLC-MS/MS (Seção 3.3) .

Os cromatogramas foram adquiridos a 280.330.350 e a 520 nm (para a quantificação de antocianinas). A identificação e quantificação dos compostos fenólicos foram realizadas com base no tempo de retenção, características espectrais de UV e comparação com padrões, bem como com base em dados da literatura [25] e na análise LC-MS anterior. Curvas de calibração de cinco pontos com diferentes padrões (ácido clorogênico, p-cumárico, rutina, epicatequina, naringina e peonidina-3-O-glicosídeo, todos da Sigma-Aldrich"-Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) foram usadas para quantificar os diferentes polifenóis detectados e identificados nos extratos. Caso não houvesse um padrão comercial disponível, a quantificação era realizada usando a curva de calibração de padrões da mesma classe fenólica, dando um teor estimado. A linearidade das curvas foi determinada pelo coeficiente de determinação (R4), sendo superior a 0,99 para todos os padrões.

Todos os extratos foram analisados ​​em triplicata e os resultados quantitativos dos fenólicos foram dados em mg gl de peso seco (mg gl DW), expressos em teor de derivados totais do ácido hidroxicinâmico (THC), teor de flavonóides totais (TFC), derivados totais de catequinas (TCD), teor de diidrocalconas totais (IDC), teor de antocianinas totais (TAC) e teor de fenólicos totais (TPC), que foram estimados como a soma dos compostos identificados individualmente pertencentes a cada classe.

3.5. Ensaios de Atividade Antioxidante

O ensaio de atividade antioxidante foi realizado usando dois métodos diferentes: DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e o Hydroxyl Radical (OH)-Scavenging (HRS).

O método de Khandi e Charles [{{0}}] foi aplicado para o ensaio DPPH. Resumidamente, amostras diluídas dos extratos (0,5 mL) foram adicionadas a 0,5 mL de solução de DPPH (0,1 mM em metanol; Sigma-Aldrich@,St. Louis, MI, EUA), e a mistura foi deixada reagir à temperatura ambiente por 40 min no escuro. Este tempo (40 min) foi definido com base nos resultados das análises cinéticas de cada extrato e nos padrões de ácido clorogênico e rutina. Após o tempo de reação, a absorbância foi medida a 518 nm usando um espectrofotômetro PerkinElmer® Lambda 25UV/VIS. Também foram avaliadas as absorbâncias do branco (0,5 mL de metanol e 0,5 mL de amostras) e do controle negativo (0,5 mL de metanol e 0,5 mL de solução de DPPH). Todas as análises foram realizadas em triplicado. A percentagem de actividade antioxidante foi calculada como se segue (1).

4. Conclusões

Os metabólitos secundários são ingredientes ativos em potencial para novas formulações cosméticas. Dentre estes, os compostos fenólicos extraídos de plantas podem apresentar grandes propriedades antioxidantes e antienvelhecimento, sendo eficazes na inibição de enzimas dérmicas (por exemplo, colagenase) e na absorção de UV. Portanto, extratos vegetais pouco investigados, como os de H. roseus, podem representar fontes não reveladas de moléculas bioativas.

Demonstramos que as folhas e flores de H.roseus são ricas em derivados do ácido hidroxicinâmico e flavonóides, com flores com maiores quantidades de glicosídeos de kaempferol, catequinas, diidrocalconas e antocianinas, todos esses compostos ainda não são descritos na literatura para esta espécie . A grande capacidade antioxidante, especialmente dos extratos de flores, juntamente com a atividade de proteção solar e anti-colagenase de extratos de folhas e flores, apontam a promissora utilização desta espécie pouco investigada em aplicações de cuidados com a pele. Em conclusão, nossos resultados mostraram o potencial das flores e folhas de H. roseus como fontes de fenólicos, bem como a atividade de seus extratos como agentes antienvelhecimento que podem ser usados ​​como ingredientes para produtos cosméticos funcionais.

Este artigo foi extraído de Plants 2021, 10, 522. https://doi.org/10.3390/plants10030522 https://www.mdpi.com/journal/plants