Parte 2: A homoarginina melhora a nefropatia diabética independente da sintase de óxido nítrico-3

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3. RESULTADOS

3.1 Características do mouse

Camundongos diabéticos tipo selvagem e NOS3- tiveram peso corporal significativamente menor em comparação com camundongos não diabéticos após 24 semanas, o que foi significativamente aumentado pela homoarginina em camundongos diabéticos NOS3-7. A glicose no sangue foi maior em todos os tipos selvagens diabéticos e camundongos NOS3-7. A razão rim/peso corporal foi significativamente maior em camundongos diabéticos NOS3-7, enquanto o tratamento com homoarginina reduziu significativamente a razão cardíaca/peso corporal em camundongos diabéticos NOS3-. A pressão arterial sistólica foi significativamente aumentada em camundongos NOS3-7em comparação com o tipo selvagem e mostrou uma tendência de redução; embora não significativo pelo tratamento com homoarginina em NOS diabéticos3-/ camundongos. (Tabela 1).

3.2 A homoarginina reduz a albuminúria na NOS diabética3-/- camundongo

O diabetes aumentou significativamente a albuminúria em camundongos do tipo selvagem e NOS3-/ em comparação com o normal, um efeito significativamente reduzido pelo tratamento com homoarginina (Figura 1). Como os resultados observados em camundongos do tipo selvagem foram consistentes com nosso estudo anterior (Wetzel et al., 2019) sobre o efeito protetor da homoarginina em DN, analisamos apenas NOS3-/ camundongos no restante deste estudo.

3.3 A homoarginina reduz os níveis plasmáticos de BUN em camundongos diabéticos NOS3-7-

Em seguida, avaliamos os efeitos da administração de homoarginina nos níveis plasmáticos de BUN em camundongos NOS3-. Os níveis plasmáticos de BUN foram aumentados em camundongos diabéticos e reduzidos pelo tratamento com homoarginina (Figura 2).

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3.4 As expressões NOS1 e NOS2 não são alteradas em camundongos diabéticos NOS3-

Em seguida, determinamos se diabetes e/ou homoarginina alteraram a expressão de outras isoformas de NOS em rins de camundongos NOS3 -. Nossos resultados mostram que nem o diabetes nem a homoarginina afetaram a expressão do gene NOS1 ou NOS2 em camundongos NOS3-7 (Figura 3).

3.5 Homoarginina reduz patologia glomerular e fibrose em camundongos NOS diabéticos3-

A análise de seções glomerulares coradas com PAS mostrou que camundongos NOS3-- diabéticos estavam associados a aumento do volume glomerular, celularidade glomerular, espessura da membrana basal glomerular (GBM) e índice de lesão glomerular em comparação com camundongos NOS3一 não diabéticos; um efeito significativamente reduzido usando o tratamento com homoarginina (Tabela 2 e Figura 4a). Além disso, os camundongos NOS3 diabéticos apresentaram um percentual aumentado de fibrose (usando ImageJ) nas seções coradas com tricrômio de Masson (Figura 4b,c) 24 semanas após o diabetes, que foi reduzida pelo tratamento com homoarginina.

3.6 Homoarginina reduz marcadores fibróticos renais em camundongos NOS diabéticos3-/-

A análise de PCR em tempo real mostra aumentos acentuados na fibronectina renal (Figura 5a), TGF (Figura 5b), actina do músculo liso (Figura 5c) e E-caderina (Figura 5d) após diabetes em NOS3-/camundongos. A suplementação de homoarginina embotou significativamente o aumento desses marcadores de fibrose.

3.7 A homoarginina reduz a infiltração de macrófagos glomerulares em NOS diabético3-/camundongos

NOS diabéticos3-/camundongos exibiram um aumento acentuado na infiltração de macrófagos renais após diabetes (Figura 6) em comparação com camundongos não diabéticos. O tratamento com homoarginina reduziu significativamente a infiltração de macrófagos 24 semanas após o diabetes.

3.8 A homoarginina reduz a fibrose cardíaca e melhora a função cardíaca em camundongos diabéticos NOS3-7-r

Camundongos diabéticos NOS3-/ exibiram uma porcentagem aumentada de fibrose (usando ImageJ) em seções coradas com tricrômio de Masson (Figura 7a,b) 24 semanas após o diabetes, que foi reduzida pelo tratamento com homoarginina. Além disso, camundongos diabéticos NOS3-7 tiveram uma redução significativa na fração de ejeção (FE) e encolhimento fracional (FS) (Figura 7c-e) em comparação com controles não diabéticos em 22 semanas de diabetes, um efeito significativamente restaurado usando homoarginina tratamento.

3.9 Homoarginina restaura o complexo MCU e seus reguladores em camundongos Ins2Akita diabéticos

Amostras de rim derivadas de nossa publicação anterior (Wetzel et al., 2019) foram analisadas para o complexo MCU e seus reguladores. Camundongos diabéticos tiveram um aumento significativo no MCU renal e seu regulador positivo, expressão de MCUR1, juntamente com uma redução no regulador negativo de MCU renal, expressão de MICU1 (Figura 8), em comparação com controles não diabéticos às 18 semanas de idade em camundongos Ins2Ak, enquanto camundongos diabéticos tratados com suplementação de homoarginina restauraram o complexo MCU e seus reguladores a níveis normais.

3.10 Homoarginina restaura camundongos do complexo MCU e seus reguladores em NOS diabético3-7-

NOS diabéticos3-/camundongos tiveram um aumento significativo no MCU renal (Figura 9a) juntamente com uma redução significativa em seu regulador negativo, expressão MICUl (Figura 9b,c), em comparação com controles não diabéticos após 24 semanas de diabetes , enquanto camundongos diabéticos NOS3-tratados com suplementação de homoarginina restauraram o complexo MCU e seu regulador negativo a níveis normais.

4. DISCUSSÃO

A nefropatia diabética continua sendo uma complicação importante e não resolvida do diabetes. Nossa publicação anterior demonstrou que a suplementação de homoarginina confererimproteção em modelos de camundongos diabéticos (Wetzel et al., 2019). No entanto, o mecanismo exato pelo qual a homoarginina medeia esses efeitos não estava claro. O estudo atual mostra que a suplementação de homoarginina medeiarenalproteção tecidual em ND independente de NOS3, o que acabará mudando nossa compreensão do(s) mecanismo(s) pelo qual a homoarginina induz proteção renal e cardíaca em ND. O efeito protetor da homoarginina na DN pode ser mediado através da melhoria da função mitocondrial.

A disfunção endotelial, caracterizada por biodisponibilidade reduzida de NO e aumento do estresse oxidativo, é uma característica marcante do diabetes (Creager et al., 2003) e DN (Goligorsky et al., 2001). O papel da expressão e ação da NOS3 na ND é controverso; Portanto, embora a baixa ou a falta de NOS3 tenha demonstrado exacerbar a DN (Wang et al,2011; Zhao et al.,2006), uma publicação recente (Natarajan et al.,2019) mostrou que a superexpressão de NOS3 em camundongos Ins2Aki exacerba a DN provavelmente via aumento do desacoplamento de NOS3 e estresse oxidativo, em vez de aumento da produção/ação renal de NO. Como a homoarginina pode ser um substrato para NOS aumentando a L-arginina (Hecker et al.,1991; Moali et al.,1998), ela também pode mediar seu efeito via ação/produção de NO. No entanto, nossa publicação anterior mostrou que a suplementação oral de arginina surpreendentemente não preveniu ou reduziu quaisquer marcadores de lesão renal em modelos de camundongos diabéticos, apesar de aumentar com sucesso os níveis de arginina no plasma e nos rins (You et al., 2014). A interação direta entre os níveis de homoarginina e a produção de NO é controversa. A homoarginina pode reduzir a síntese de NO a partir da arginina por (a) competição de arginina e homoarginina pela captação celular por transportadores de aminoácidos catiônicos (CAT) (Chafai et al, 2017; Hagos et al., 2006); (b) por trans-estimulação de CAT, que por sua vez poderia aumentar o efluxo celular de arginina; e (c) por competição de homoarginina e arginina para NOS (Pilz et al., 2015), embora a homoarginina seja um substrato menos eficiente para esta enzima (Moali et al.,1998; Zwan et al,2013). Embora a homoarginina possa aumentar a disponibilidade de arginina e, portanto, a síntese de NO pela inibição da arginase, isso é improvável devido à fraca afinidade da homoarginina pela arginase (Marz et al, 2010). No entanto, a homoarginina pode contribuir para a síntese de NO servindo como substrato para NOS porque a homoarginina, mesmo com sua afinidade mais fraca para NOS em comparação com a arginina, pode ser metabolizada em NO e homocitrulina (Drechsler et al., 2011).

Para examinar o mecanismo do efeito protetor da homoarginina em DN, investigamos os efeitos da suplementação de homoarginina na disfunção renal, alterações histopatológicas glomerulares e recrutamento de macrófagos em NOS3-/- e seu modelo de camundongo diabético de camarada de tipo selvagem. A suplementação de homoarginina melhorou significativamente a albuminúria diabética em camundongos diabéticos tipo selvagem e NOS3-7, confirmando nossa descoberta anterior (Wetzel et al, 2019), e foi associada a patologia glomerular reduzida e expressão de marcadores fibróticos renais em NOS diabéticos{{ 5}} camundongos.

Em conjunto, nossos resultados indicam um papel direto do efeito protetor da homoarginina na ND e apoiam o conceito de que a homoarginina medeia a proteção do tecido renal independente da NOS3. Tanto a morbidade quanto a mortalidade cardiovasculares estão aumentadas em pacientes com ND. No coração, níveis mais baixos de homoarginina estão relacionados ao aumento do espessamento ventricular esquerdo, menor FE e maior NTproBNP (Bahls et al., 2018). Inversamente, a suplementação de homoarginina preserva a função cardíaca no modelo murino de insuficiência cardíaca pós-infarto do miocárdio (Atzler et al., 2017). No presente estudo, também demonstramos que o efeito protetor da homoarginina para melhorar a função cardíaca e reduzir a fibrose cardíaca é independente da expressão de NOS3 de forma semelhante ao seu efeito no rim. No entanto, não podemos excluir o efeito hemodinâmico da homoarginina na ND, dada a sua tendência de redução da pressão arterial; embora não significativo.

O mecanismo do efeito protetor da homoarginina parece estar ligado a modulações da função mitocondrial reguladas pelo complexo MCU e seus reguladores. A disfunção mitocondrial desempenha um papel fundamental na lesão renal (Brooks et al.,2009;Coughlan & Sharma,2016;Hallan & Sharma,2016;Long et al..2016; Sharma,2015; Sun et al.2008;Wang et al. .,2012;You et al.,2016;Yu et al.,2006; Zhan et al.,2013).No rim, as células endoteliais são especialmente vulneráveis ​​à disfunção mitocondrial(Hong et al.,2012) e contribuem para o estresse oxidativo, depleção persistente de energia, comprometimento dos mecanismos de reparo dependentes de energia e morte celular na lesão renal (Funk et al., 2010; Funk & Schnellmann, 2012). MCU é um complexo multimérico envolvido na rápida absorção de Ca' nas mitocôndrias e foi demonstrado estar desregulado na patologia cardíaca (Liao et al.,2015; Luongo et al.,2015; Nemaniet al,2018; Tomar et al,2019; Woods et al,2019). A captação mitocondrial de Ca2 mais mediada pelo complexo MCU desempenha um papel crítico na transdução de sinal, bioenergética e morte celular, e sua desregulação está ligada a várias doenças humanas. Embora a apoptose de podócitos tenha sido associada à desregulação do MCU (Xu et al.,2018; Yuan et al.,2017), o papel do complexo MCU e sua interação com a suplementação de homoarginina no DN não são conhecidos. Nossos dados atuais em camundongos diabéticos demonstraram que a administração de homoarginina reduziu significativamente a expressão de MCU, aumentou o regulador negativo de MCU (MICU1) e reduziu o regulador positivo de MCU (MCUR1) em DN, e esse efeito é independente da expressão de NOS3. Portanto, especulamos que existe uma associação entre a sinalização do Ca' mitocondrial e desfechos clínicos adversos na ND. A normalização da função mitocondrial é necessária para restaurar o metabolismo oxidativo durante a ND. Estudos adicionais são necessários para confirmar o efeito direto da homoarginina na função mitocondrial.

Em conclusão, nosso estudo demonstra pela primeira vez que o mecanismo de proteção do tecido renal e cardíaco usando a suplementação de homoarginina na ND é independente da NOS3, e provavelmente é mediado pela melhora da disfunção mitocondrial. Os resultados do nosso estudo podem resultar em novas intervenções terapêuticas destinadas a aumentar a homoarginina no tratamento da ND.

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Quem mais não pode comer cistanche

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Portanto, se você precisar revigorar seus rins, Cistanche é um bom suplemento e se você tiver outras condições, use-o sob o conselho do seu médico.