Parte 2: Deficiência de DHHC21 atenua a disfunção renal durante lesão séptica

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Discussão

No presente trabalho, relatamos o DHHC21 como um novo regulador da perfusão e função renal durante a lesão séptica. Nossas novas descobertas indicam: (1) Zdhhc21devde? camundongos exibem melhor função renal e menos dano renal após lesão séptica em comparação com camundongos WT;(2) a deficiência funcional de DHHC21 preserva a perfusão do tecido renal, saturação de oxigênio e RBF na lesão séptica;(3) DHHC21-palmitoilação alAR catalisada é necessária para a ativação da via de sinalização alAR e constrição induzida por alAR das artérias renais. Este estudo fornece uma nova visão mecanicista sobre a regulação da perfusão e função renal durante a lesão séptica. Sugerimos que a deficiência funcional de DHHC21 confere efeitos protetores sobrefunção renalna lesão séptica e que a inibição de DHHC21 pode servir como estratégia terapêutica para combaterdisfunção renaldurante a lesão séptica.

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A hipoperfusão/hipóxia do tecido renal é uma das principais causas de disfunção renal durante a lesão séptica3-5. Detectamos hipoperfusão renal em camundongos após CLP evidenciada por intensidade de sinal MSOT enfraquecida da hemoglobina total, diminuição da saturação de oxigênio no tecido renal e redução do FSR após lesão séptica. Consistente com nossos achados, a redução do FSR foi observada em pacientes com sepse com lesão renal, bem como em modelos de lesão séptica em animais de grande porte7,10l1. ou mesmo RBF334 aumentado. Esses achados discrepantes podem ser atribuídos a diferentes modelos animais e métodos usados ​​para medir o fluxo sanguíneo. Por exemplo, enquanto a lesão séptica polimicrobiana induzida por CLP tem sido comumente usada, alguns estudos usam uma injeção intravenosa de Escherichia coli35.

A palmitoilação de proteínas foi recentemente relatada como um novo regulador da função proteica, envolvida na patogênese e progressão de muitas doenças. Foi identificado pela primeira vez como um novo tipo de modificação pós-traducional por Schmidt et al.3637. A descoberta da família DHHC desde então promoveu a rápida expansão desse campo38,39. Os papéis da palmitoilação e dos PATs foram relatados em inúmeras condições fisiológicas e patológicas, incluindo metabolismo lipídico,Câncer, doenças cardiovasculares, e distúrbios neurológicos23,0,4. Embora o envolvimento da palmitoilação na doença renal policística e no câncer renal tenha sido relatado anteriormente23., há estudos muito limitados examinando o papel funcional dos PATs nadoenças renais, especificamente na disfunção renal durante a lesão séptica. Até onde sabemos, somos os primeiros a investigar o papel do DHHC2l na disfunção renal na lesão séptica. Nossos achados indicam que a inibição de DHHC21 resgata grandemente a função renal e preserva a estrutura renal na lesão séptica.

Nosso estudo utilizando Zdhhc21dp/d4? camundongos demonstram que os efeitos benéficos da deficiência funcional de DHHC21 na função renal são atribuídos à sua capacidade de melhorar a perfusão do tecido renal durante a lesão séptica. Em condições basais, camundongos Zdhhc21ewaeP não apresentam sinais de desequilíbrio sal/água ou dano estrutural/funcional renal5. No entanto, a perda de função do DHHC21 suprime a redução induzida por lesão séptica do FSR, perfusão renal e saturação renal de oxigênio. O aumento da resistência vascular renal causado pela vasoconstrição renal excessiva é considerado um dos principais motivos para a perfusão tecidual renal prejudicada na lesão séptica6,9. Nossos resultados indicam o envolvimento do alAR na mediação da hipoperfusão tecidual renal induzida pela lesão séptica, como evidenciado pelo aumento da palmitoilação do alAR e pela ativação de uma via de sinalização do alAR na lesão séptica. No entanto, a deficiência funcional de DHHC21 inibe a alARpalmitoilação e resulta em uma capacidade diminuída de alAR de ativar seu efetor a jusante e mediar a vasoconstrição induzida por fenilefrina nas artérias renais.

"O mecanismo molecular subjacente à regulação da função alAR pelo DHHC21 ainda precisa ser totalmente elucidado. O defeito na função alAR causado pela perda de função do DHHC21 pode ser atribuído à mudança conformacional do alAR. Muitos GPCRs dependem da palmitoilação para sua adequada conformação intracelular, O palmitato anexado nas caudas C-terminais dos GPCRs se insere na membrana plasmática para criar a quarta alça intracelular, que é essencial para a interação dos GPCRs com suas proteínas parceiras e a propagação dos sinais GPCR17,4. indicou que a palmitoilação de Albar também ocorre em sua região C-terminal 44. Portanto, a falta de palmitoilação de lAR mediada por DHHC21-pode alterar a conformação intracelular de alAR, bloqueando assim a propagação de sinais de lAR. por nossos resultados mostrando que a ativação de ERK, um evento de sinalização a jusante da ativação de alAR, é inibida em camundongos Zdhhc21devider submetidos a sept lesão ic. No entanto, a topologia regulada por DHHC{11}}do alAR carboxil-terminal precisa ser confirmada usando cristalografia de raios-X.

Outro aspecto novo de nosso estudo é a utilização do MSOT para avaliar a perfusão e a função renal durante a lesão séptica. O MSOT tem sido relatado como um método sem rótulo para medir a perfusão de diferentes órgãos e uma técnica de imagem confiável para determinar a função renal2832,45. Comparado ao fluxômetro Doppler, que não permite a visualização da microvasculatura45, o MSOT gera imagens com alta resolução espacial a 150 µm enquanto fornece uma avaliação quantitativa do estado de perfusão na microvasculatura renal. O IRDye800CW solúvel em água é um marcador seguro para medir a depuração renal e não induz toxicidade em doses tão altas quanto 20 mg/kg. O movimento de duas fases de IRDye800CW que observamos é consistente com estudos publicados anteriormente. Nossos registros de MSOT indicam um maior atraso de Tmax em rins com sepse, sugerindo depuração renal prejudicada. Um estudo de nefropatia demonstra que o comprometimento da função renal detectado pela MSOT está significativamente correlacionado com o dano histológico glomerular30. Nossos dados, consistentes com publicações anteriores, sugerem que o MSOT é uma técnica minimamente invasiva e confiável para monitorar a perfusão e a função renal.

Atualmente, não há inibidores específicos de DHHC21-disponíveis. O inibidor de PAT mais comumente usado é o 2-BP, que tem um amplo efeito em vários DHHCs e também interfere no metabolismo de ácidos graxos47. Assim, o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas que visam especificamente o DHHC21 seria uma direção promissora. Vale ressaltar também que o alAR não é o único substrato do DHHC21. Vários outros substratos de DHHC21 foram recentemente identificados, incluindo a molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias (PFCA M-1), receptor de estrogênio caveolina-1, sintase de óxido nítrico endotelial (eNOS), Fyn, superóxido dismutase (SOD{{ 8}}) e PLCB122,41,4s,49, embora fora do escopo do presente estudo, não podemos descartar a possibilidade de que esses substratos também possam afetar a função renal durante a lesão séptica.

Em conclusão, o presente estudo demonstra pela primeira vez que o DHHC21 desempenha um papel crítico na regulação da perfusão renal durante a lesão séptica por meio de mecanismos envolvendo palmitoilação de alAR e vasoconstrição mediada por alAR. Além disso, a inibição de DHHC21 exerce efeitos protetores sobre a função renal durante a lesão séptica.

Materiais e métodos

Reagentes. Todos os reagentes estão listados na Tabela Suplementar S1.

Animais. Os camundongos Zdhhc21depher e seus camundongos de controle de tipo selvagem (B6C3Fe) foram adquiridos do Jackson Laboratory. O genótipo de Zdhhc21dephe? camundongos foram confirmados por sequenciamento (Genenewiz, Inc., NJ, EUA). Os primers usados ​​para sequenciamento foram: AGCTGACTGAAGGGCACC(forward) e AAAACCTGTAACGCATTTCCA (reverse)23. Os animais foram mantidos sob um ciclo claro/escuro de 12/12-h com livre acesso a comida e água. Camundongos (16-20 semanas) de ambos os sexos foram usados ​​para este estudo. Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Sul da Flórida e estão em conformidade com o Guia do NIH para Cuidados e Uso de Laboratório

Ligadura e punção cecal, Os ratos foram anestesiados com isoflurano (3 por cento de indução e 1 por cento de manutenção). Uma incisão na linha média foi feita na região abdominal raspada e o ceco foi exteriorizado, firmemente ligado a 5 mm abaixo da válvula ileocecal e perfurado duas vezes com uma agulha 20-gauge distal ao ponto de ligadura. Um mm de fezes foi extrudado de cada orifício de punção. O ceco foi então reposicionado e o abdome foi fechado em duas camadas. A solução de Ringer Lactato 37C foi aplicada topicamente para evitar a secagem do ceco. Os camundongos receberam então 37 graus 0,9 por cento de solução salina subcutânea para ressuscitação com fluidos. Uma dose pré-operatória de 0.5-1,5 mg/kg de Buprenorfina de Liberação Sustentada foi administrada para analgesia. Camundongos sham foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico, mas sem ligadura e punção cecal50,51.

Tomografia optoacústica multiespectral. Avaliação da excreção renal de IRDye800CW. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e depilados ao redor da região do tronco. Os camundongos foram fotografados usando o Altera Medical MSOT Imaging System (Munique, Alemanha) em vários comprimentos de onda: 700,730.760.775.785, 800.850 nm a uma taxa de 10 quadros/s. Os camundongos foram colocados em posição supina em um suporte e movidos ao longo do estágio linear horizontal para posicionar os rins no topo do transdutor côncavo posicionado de forma fixa. Após o registro da linha de base, 60 nmol de RDve800CW dissolvidos em 100 ul de solução salina a 0,9 por cento foram injetados por via intravenosa durante um período de 10 s. As imagens foram reconstruídas usando a fórmula de retroprojeção e processadas com análise multiespectral. Regiões de interesse (ROIs) foram desenhadas ao redor do córtex renal e região medular/pelve, e as mudanças temporais do sinal MSOT em ROIs foram descritas.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Histopatologia renal. Os rins foram fixados, cortados no plano sagital e processados ​​para inclusão em parafina. Os cortes (5 μm) foram desparafinizados, reidratados e oxidados com ácido periódico por 8 min à temperatura ambiente (RT), seguido de incubação com solução de Schiff por 25 min. Os cortes foram então contrastados com hematoxilina. As imagens foram capturadas usando Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, EUA). O dano estrutural renal foi avaliado com base nas seguintes características: anormalidade glomerular, perda da borda em escova do túbulo proximal, vacuolização, dilatação do epitélio tubular, descolamento/necrose de células tubulares e infiltração de neutrófilos. Cada recurso foi classificado em uma escala de 0-5 com base na gravidade.

Medição de creatinina e nitrogênio ureico no sangue. O sangue do camundongo foi coletado por punção cardíaca 24 h após a lesão séptica. O plasma foi gerado por centrifugação do sangue a 2500g durante 15 min à temperatura ambiente. Medição de creatinina: o plasma foi desproteinizado usando uma coluna de rotação 10-kDa; os níveis de creatinina no filtrado foram então medidos usando um kit de ensaio de creatinina. O nível de nitrogênio ureico no sangue (BUN) foi determinado usando um Kit de Detecção Colorimétrica de Nitrogênio Uréia seguindo as instruções do fabricante.

Medição de RBF e MAP. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano. O transdutor de pressão arterial foi canulado na artéria carótida. Uma incisão na linha média foi feita na área abdominal seguida de uma incisão transversal esquerda para expor a artéria renal. O FSR foi medido usando um medidor de fluxo de tempo de trânsito de ultrassom (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, EUA). Depois de colocar a sonda de fluxo ao redor da artéria renal exposta, os camundongos foram estabilizados por pelo menos 30 min. RBF e MAP foram registrados simultaneamente usando PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, EUA). Os dados foram analisados ​​usando o software LabChart Pro versão 74,55

Captura assistida por resina. As artérias renais foram coletadas e lisadas em tampão de lise (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM palmostatina B, inibidores de protease, pH 7,4）22, 56. Os lisados ​​de tecido foram incubados com tampão de bloqueio (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5 por cento SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) a 50 graus C por 30 min com vortex constante. Após precipitar com acetona fria, as proteínas foram peletizado por centrifugação a 5000g por 30 min e lavado cinco vezes com 70 por cento de acetona fria. Os grânulos de proteína foram ressuspensos em tampão de ligação (100 mM HEPES, 1,0 por cento SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4). A concentração de proteína foi determinada e normalizada entre os grupos . Cada amostra de proteína foi dividida em duas partes iguais, cada uma recebeu a mesma quantidade de esferas de isopropil sefarose 6B, Hydroxvlamina (0,2 M, pH 7,4) e NaCl (0,2 M) adicionados em cada parte, respectivamente. Após 4 h de incubação à temperatura ambiente com rotação constante, as proteínas palmitoiladas foram eluídas com DTT 50 mM em tampão de amostra 1x e coletadas para SDS-PAGE.

Manchas ocidentais. Medição de lAR palmitoilado. As amostras coletadas do RAC foram carregadas em um gel de 4-20 por cento de Tris-Glicina e transferidas para uma membrana de nitrocelulose após a eletroforese. Após bloqueio por 1 h em RT, alAR foi sondado com anticorpo primário anti-lAR de coelho (1:500) durante a noite a 4 graus. Depois de lavar três vezes com TBST, a membrana foi incubada com anticorpo secundário anti-coelho de burro IRDye800CW (1:20,{11}}) por 45 min em temperatura ambiente.

Medição da fosforilação de ERK. As artérias renais foram lisadas em 1×RIPA contendo inibidores de protease e fosfatase. A membrana foi sondada com anticorpos anti-ERK (1:1{13}}) de coelho e ERK antifosforilado de camundongo (1:1000). Os anticorpos anti-ratinho de burro IRDye800CW e anti-coelho de burro IRDye680RD foram usados ​​para incubação secundária (1:20.000). As membranas foram fotografadas e analisadas usando Li-COR Odyssey CLx.

Avaliação da vasorreatividade via miografia com fio. Artérias renais de camundongos. As artérias renais ({0}} μm de diâmetro) foram isoladas de camundongos WT e Zdhhc21dp/de e submersas em solução salina fisiológica oxigenada gelada (95 por cento O,/5 por cento CO.) (PSS,13{ {47}} NaCl mM, KCl 4,7 mM, KH 1,18 mM, PO, MgSO.7H,O 1,17 mM, NaHCO 14,9 mM, glicose 5,5 mM, EDTA 0,026 mM e CaCl 1,6 mM, pH 7,4). Segmentos de vasos (~ 2 mm de comprimento) foram montados na câmara de miografia de fio (Living Systems Instrumentation, VT, EUA) entre dois fios de tungstênio (30 um de diâmetro). A tensão isométrica foi registrada usando o condicionador de sinal Living Systems (MYO-SC-1) acoplado ao software LabScribe v4 iWorks. Após equilibrar por 30 min a 37 graus Cin PSS, o procedimento de normalização foi realizado para determinar a circunferência interna ideal L,=0.9×L(Lo=circunferência interna que corresponde à pressão transmural de 100 mmHg) . Em seguida, a viabilidade do vaso foi testada com 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH,PO.1,17 mM MgSO.7H,O,14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glicose, 0,026 mM EDTA, 1,6 mM CaCl,pH 7.4). Artérias que não responderam ao KPSS foram descartadas. As artérias foram tratadas com concentrações crescentes de fenilefrina（10 nM-30 μM）. A integridade endotelial foi então avaliada usando acetilcolina（10 μM）. As curvas de concentração-resposta foram construídas.

Pequenas artérias dos rins humanos. Pequenas artérias (~1000 um de diâmetro) foram dissecadas de rins humanos viáveis ​​intactos que foram rejeitados para cirurgia de transplante. Segmentos de vasos (~ 2 mm de comprimento) foram montados nas barras I (250 um de diâmetro) da câmara de miografia com fio. Procedimentos semelhantes de equilíbrio e normalização foram realizados em artérias humanas. Em seguida, as artérias foram incubadas com veículo controle (0,02 por cento de DMSO em PSS) por 1 h. Os vasos foram então testados quanto à viabilidade com KPSS 60 mM e tratados com concentrações crescentes de fenilefrina (10 nM-30 uM). Após a lavagem, os vasos foram incubados com 2-BP(100 uM) por 1 h; a viabilidade do vaso foi então testada novamente com 60 mM KPSS com 100 uM 2-BP. As pequenas artérias com resposta nula ou reduzida ao KPSS foram descartadas. As artérias foram então desafiadas com as mesmas concentrações de fenilefrina seguida de acetilcolina (10 uM). As curvas de concentração-resposta das artérias tratadas com controle de veículo ou 2-BP foram construídas e comparadas.

Imunofluorescência. Artérias renais humanas foram fixadas em formalina a 10 por cento por 48 h, embebidas em parafina e seccionadas. As lâminas foram então desparafinizadas, reidratadas e permeabilizadas com PBS contendo 0,05 por cento de Triton X-1002. Após o bloqueio, as lâminas foram marcadas com anticorpos anti-DHHC21 de coelho e anti-lAR de cabra (1:100) durante a noite a 4 graus C. Após a lavagem, a incubação do anticorpo secundário foi feita com anti-coelho de burro Alexa Fluor 488 e burro anti-cabra Alexa Flúor 568 (1:500). Após a montagem com o meio de montagem ProLong Diamond com DAPI, as lâminas foram fotografadas com microscópio confocal de varredura a laser invertido espectral Leica SP8.

Análise estatística. Informações detalhadas (por exemplo, o nome do teste, teste post-hoc, valor n, nível alfa, valor p) para cada teste estatístico estão listadas na Tabela Suplementar S2. Todos os dados atendem à suposição de distribuição normal. O teste de normalidade foi realizado usando o teste Shapiro-Wilk com nível alfa definido em 0.05. As comparações entre dois grupos foram analisadas usando o teste t de Student (bicaudal), e três grupos ou mais foram comparados por ANOVA de uma via com análise post-hoc de Tukey. A comparação das curvas da miografia com fio foi realizada usando ANOVA de duas vias.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">