Parte 2: Efeito anti-maligno da ascite de diterpenóides totais de Euphorbiae Ebracteolatae Radix é atribuível a alterações de aquaporinas através da inibição da atividade de PKC no rim

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3. Discussão

EER tem sido historicamente usado na MTC para o tratamento de distensão e edema abdominal [1]. Neste estudo, os efeitos anti-ascite do EER foram investigados usando camundongos ascíticos portadores de células tumorais H22. Camundongos ascíticos malignos são amplamente utilizados em pesquisas para estudar tratamentos de tumores e ascite [21,22]. Nossos resultados mostraram que tanto o EER quanto o TDEE podem reduzir significativamente o volume de ascite, enquanto o NTDEE não teve efeito. Esses resultados indicaram que TDEE era a fração ativa anti-ascite de EER. Estudos anteriores mostraram que os diterpenóides de EER têm atividades inibitórias sobrecélulas tumoraisin vitro [5,23]. No entanto, este estudo descobriu que eles não têm efeitos sobre a viabilidade das células tumorais, ciclo celular ou apoptose das células tumorais. Possíveis razões para esta discrepância podem incluir as diferenças nas doses e a fraca correlação entre as atividades in vivo e in vitro. A MTC considera que o EER é eficaz no tratamento do edema principalmente por regular rapidamente a excreção de urina e fezes [6]. Portanto, analisamos o efeito do TDEE no peso da urina e conteúdo de água fecal em camundongos ascíticos. Deve-se notar que o peso da urina e o peso do líquido ascítico foram influenciados pelo TDEE nas doses de 3 e 0,6g de ervas cruas/kg, enquanto o conteúdo de água fecal aumentou apenas em 3 g de ervas cruas/kg, então o TDEE principalmente diminuição do volume de ascite, reduzindo a reabsorção de água nos rins. A reabsorção renal de água desempenha um papel central na manutenção da homeostase da água corporal [16]. AQPs fornecem os principais canais para os rins reabsorverem água e concentrarem a urina [24]. Consequentemente, o estudo da expressão de AQPs pode fornecer um mecanismo para diminuir a ascite.

Vários AQPs são expressos em diferentes áreas dorim.AOP1, AOP2, AOP3, and AQP4 are localized in renal epithelial cells and are closely related to water reabsorption in the kidney [25]. AQP1 is highly expressed in both apical and basolateral membranes of the proximal tubules and control>70 por cento de absorção de água no filtrado glomerular [16]. AQP2, AOP3 e AOP4 são expressos exclusivamente nos ductos coletores, que são segmentos vitais para regular o balanço hídrico e a concentração de urina [16]. No presente estudo, o TDEE reduziu a expressão proteica de AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 em rins de camundongos. Esses achados foram confirmados pelos resultados de experimentos celulares in vitro. As atividades inibitórias de AQPs dos principais diterpenóides em TDEE foram avaliadas nas linhagens celulares do túbulo proximal e ducto coletor. Nossos resultados mostraram que os diterpenóides em TDEE reduziram os níveis de expressão de proteína AQPs e mRNA em células HK-2 e mIMCD3.

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Os níveis de expressão relativa da proteína AQPs e mRNA de cada diterpenóide foram comparados com o grupo controle.Renalos túbulos são um componente importante da reabsorção de água. Entre os quatro diterpenóides, os diterpenóides ent-abietano jolkinolide B (1269 por cento de TDEE) tiveram o efeito mais forte na regulação de AQP1 em células HK-2. Ao compará-lo com a estrutura do composto 2, jolkinolide B (composto 3) tem dois anéis epóxi nas posições de C-11 e 14. Quando o anel epóxi em C-11 e 14 foram, respectivamente, convertidos a uma hidroxila e ligação dupla no composto 2, a atividade inibitória de AQP1 desapareceu. A concentração de urina ocorre principalmente nos túbulos coletores renais. Os resultados das células mIMCD3 mostraram que o composto diterpenóide rosano 4 e o composto lactona norditerpenóide 5 (representando 9,16 por cento e 39,26 por cento do TDEE, respectivamente) têm os efeitos inibitórios mais fortes na expressão de AQP2, AQP3 e AQP4. Os efeitos inibitórios dos diterpenóides ent-abietano foram fracos em comparação com esses dois tipos de diterpenóides. Os efeitos inibitórios de diferentes tipos de diterpenóides em vários AOPs no rim não foram os mesmos, o que pode ser devido a variações na estrutura química dos diterpenóides e no tempo de resposta dos AQPs a cada composto. No geral, esses diterpenóides podem conferir efeitos inibitórios sinérgicos de AQPs. Como as atividades desses diterpenóides foram estimadas in vitro, as atividades desses compostos após o metabolismo in vivo permanecem obscuras e, portanto, precisam de mais investigação.

Vários estudos sugeriram que PKC e PKA funcionam na regulação de AQPs [17-20]. PKC é uma família de serina/treonina quinases envolvidas em várias transduções de sinais celulares [26]. A família PKC inclui várias isoformas [26]. Após a ativação, as PKCs translocam do citosol para a membrana plasmática, ligam-se ao diacilglicerol (DAG) e, posteriormente, induzem uma série de alterações fisiológicas. A translocação de PKC do citosol para a membrana plasmática é um indicador da ativação de PKC [28]. O DAG é gerado pela hidrólise catalisada por PLC de fosfatidilinositol de membrana-4,5-bifosfato (PIP2)[27]. Em experimentos com animais, medimos os níveis de expressão de PKCo e PKC na fração de membrana. Ao mesmo tempo, também detectamos as alterações nas proteínas a montante da PKC. Os resultados sugeriram que TDEE diminuiu a expressão de PKC na membrana celular e inibiu a atividade de PKC. No entanto, nenhum efeito de TDEE no nível de fosforilação de PLC foi observado. O TDEE pode se ligar diretamente a PKC e inibir a ativação de PKC. A atividade enzimática da PKA é controlada principalmente por subunidades reguladoras que formam um complexo holoenzimático com as subunidades catalíticas [29] A liberação de subunidades catalíticas é uma marca registrada da ativação da PKA [29]. Descobrimos que o tratamento com TDEE não teve efeito na ativação da PKA. Para explorar se a inibição de AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 nos rins é mediada pelo bloqueio da ativação de sinais de PKC, usamos PMA como agonista de PKC para interferir na expressão de AOP1, AOP2, AQP3 e AQP4 em HK{ {19}} e células mIMCD3. Nossos resultados mostraram que a eufebracteolatina A (o diterpenóide do TDEE) diminuiu os níveis de expressão de AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 emcélulas renais. A inibição da expressão de AOP1, AOP2, AOP3 e AQP4 induzida pela eufebracteolatina A foi bloqueada por PMA. Assim, inferimos que o TDEE regulou a expressão de AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 inibindo a ativação de PKC. As isoformas de PKC são numerosas; O TDEE também pode regular a expressão de AQPs inibindo outras isoformas que aguardam mais pesquisas. Até o momento, as moléculas a jusante de PKC que regulam a expressão de AQPs permanecem pouco compreendidas. Na próxima etapa, focaremos nos mecanismos regulatórios a jusante da PKC.

Em resumo, o TDEE é uma fração ativa do EER contra a ascite. O TDEE consiste em diterpenóides, como os tipos de lactonas ent-abietano, Rosane e norditerpeno. TDEE e seus diterpenóides podem inibir a reabsorção e concentração de água nos rins, reduzindo os níveis de expressão de AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4, resolvendo assim a ascite. A inibição da expressão de AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 nos rins por TDEE está relacionada com a inibição da ativação de PKC. Este estudo pode fornecer a base para a aplicação clínica do EER e a identificação de drogas candidatas que conferem efeitos diurese e antiascite.

4. Materiais e Métodos

4.1. Produtos Químicos e Reagentes

Um kit de ensaio de albumina foi adquirido do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). O acetonitrilo grau HPLC foi adquirido da Media Co. (Anqing, China). O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) foi obtido de HyClone (Logan, UT, EUA). Meio mínimo essencial com aminoácidos não essenciais (MEM NEAA) e soro fetal bovino (FBS) foram obtidos da Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, China). Anticorpos anti-AQP1 e AQP3 de coelho foram obtidos de EnoGene Co., Ltd. (Nanjing, China). Anticorpos anti-AQP2, AQP4 de coelho e anti{11}}actina de camundongo foram adquiridos da Zen BioScience Co., Ltd. (Chengdu, China). Anticorpos anti-PKC, PKC, PLC e fosfo-PLC (Tyr783) de coelho foram adquiridos da Affinity Biosciences Co., Ltd. (Changzhou, China). Tampão de ensaio de imunoprecipitação por rádio (tampão RIPA), ciclo celular e kits de detecção de apoptose celular foram fornecidos pela Yifeixue Biotechnology (Nanjing, China). Um kit BCA foi adquirido da Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). O tampão reagente TRIzol foi adquirido da Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, EUA). As membranas de PVDF foram adquiridas da Millipore (Bedford, MA, EUA). Um kit de síntese de cDNA foi adquirido da YEASEN Biotech Co., Ltd. (Xangai, China).

4.2.Material Vegetal

O EER, a raiz do Euphorbia ebracteolato Hayata, foi adquirido da Baohetang Pharmaceutical Co., Ltd. (Bozhou, China) em 15 de setembro de 2017 e autenticado pelo professor Harbin Hu do Instituto Jiangsu de Controle de Alimentos e Medicamentos. Um espécime de comprovante (WH20170915) foi depositado no Herbário de Medicina Tradicional Chinesa da Escola de Farmácia da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing.

4.3. Extração e Isolamento de TDEE e Purificação de Diterpenóides

O EER foi pulverizado usando um moedor mecânico. O pó (100 g) foi submetido a extração sucessiva em extrator Soxhlet por 6 h com diclorometano. Depois disso, o extrato foi concentrado sob pressão reduzida, o que rendeu extrato de diclorometano. O extrato de diclorometano foi submetido a cromatografia em coluna (CC) em ODS eluindo com 40 por cento e 90 por cento de metanol sequencialmente. O eluente de metanol a 90 por cento foi recolhido, concentrado e seco para preparar o TDEE (2,4 g). Os resíduos extraídos foram fundidos e extraídos três vezes com 95 por cento de etanol. O extrato foi então combinado e evaporado até a secura para obter NTDEE (15,6 g). TEER (19,8 g) foi extraído do pó de EER (100 g) com 95 por cento de etanol. Esses extratos foram usados ​​em experimentos com animais.

Os principais compostos de TDEE foram isolados usando o seguinte processo. A raiz de EER(20 kg) foi pulverizada e extraída com diclorometano durante 72 h à temperatura ambiente por maceração três vezes. O extrato de diclorometano foi obtido e concentrado em evaporador rotativo. O resíduo foi submetido a CC em sílica gel usando um sistema de gradiente de polaridade crescente com CH, Cl e MeOH (100:0-0:100) para gerar 8 frações (Fr. 1-Fr.8) . Fr.4 foi submetido a uma coluna de gel de sílica eluindo com éter de petróleo-EtOAc (de 50:1 a 1:1), seguido por ODS de fase reversa CCelutando com MeOH-H, O de 60 por cento a 80 por cento para produzir compostos 5 e 6. Fr.5 foi cromatografado em coluna de sílica gel eluindo com éter de petróleo-EtOAc (de 35:1 a 0:1) para produzir 7 subfrações (Fr.5.1-Fr.5.7). Fr.5.3 foi separado por ODS CC eluindo com um MeOH-H2O (de 75 por cento a 100 por cento), seguido

por HPLC semi-preparativa (MeOH-H2O, de 75 por cento a 100 por cento) para gerar o composto 4.Fr.5.4 foi cromatografado em uma coluna de gel de sílica eluindo com éter de petróleo-EtOAc (de 30:1 a 5:1), seguido por um Sephadex LH-20(MeOH: CH2Cl, 1:1) e HPLC semi-preparativa(MeOH-H, O, de 60 por cento a 95 por cento) para gerar o composto 3.Fr. 5.6 foi purificado por ODS CC eluindo com um gradiente de MeOH-H2O de 40:60 a 100:0, seguido por Sephadex LH-20 CC (CHCl-MeOH, 1:1) para produzir os compostos 1 e 2.

4.4. Experimentos In Vivo

4.4.1. Animais e Desenho Experimental

Camundongos machos ICR (peso: 18-22 g) foram obtidos da Fazenda de Criação de Animais Qing Long Shan (Nanjing, China). Os camundongos foram mantidos em gaiolas de laboratório padrão em umidade moderada (50 por cento ± 5 por cento) em temperatura constante (22 ± 1 grau) em uma sala de ciclo claro-escuro de 12 h. Todos os animais tiveram livre acesso a ração e água durante o período experimental. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (Nanjing, China).

Um total de 90 camundongos machos foram divididos aleatoriamente em 9 grupos (n= 10). O grupo controle foi injetado intraperitonealmente com 0,2 mL de solução salina. Os camundongos dos outros grupos foram inoculados ip com células 1 × 1{{10}} grau H22 em um volume de 0,2 mL. Todas as drogas foram suspensas em água com 0,5 por cento (w/o)carboxilmetilcelulose de sódio (0,5 por cento Na-CMC). Após 24 h, os camundongos foram tratados por gavagem todos os dias de acordo com o seguinte esquema por 8 dias: os grupos normal e modelo receberam 0,5 por cento de Na-CMC. A furosemida (6 mg/kg) foi escolhida como controle positivo por ser amplamente utilizada no tratamento de doenças edematosas como a ascite pelo efeito da diurese. Os grupos TEER, TDEE e NTDEE receberam extratos correspondentes de EER (3,0 e 0,6 g de ervas cruas/kg).

4.4.2. Ensaios de peso de fluido ascítico, peso de urina e teor de água fecal

Os camundongos dos grupos modelo e tratados foram sacrificados e o líquido ascítico foi coletado da cavidade peritoneal. O fluido foi então pesado em uma balança eletrônica.

Os camundongos foram alojados em gaiolas individuais. As fezes foram coletadas em frascos pesados ​​e lacrados. Após 5 h, os frascos contendo fezes úmidas foram pesados. Em seguida, os frascos foram secos até um peso constante a 105 graus. O teor de água fecal ( por cento )=((peso dos frascos contendo fezes úmidas - o peso dos frascos contendo fezes secas)/(peso dos frascos contendo fezes úmidas - o peso dos frascos))× 100.

O peso da excreção de urina foi medido por uma modificação de um método anterior [30]. Os camundongos foram alojados em béqueres individuais. Os béqueres foram cobertos com uma rede metálica nas bocas, depois invertidos sobre as placas plásticas contendo polímero superabsorvente (SAP). Neste teste, as fezes foram limpas. Após 5h, as placas plásticas contendo SAP e urina foram pesadas. A seguinte equação foi usada para determinar o peso da urina: peso da urina (g)=peso dos pratos de plástico contendo SAP e peso da urina dos pratos de plástico contendo SAP.

4.4.3. Análise de albumina sérica

O sangue de todos os grupos foi coletado por punção orbitária e centrifugado a 5000×g por 10 min a 4 graus. A albumina sérica foi medida usando um kit de ensaio de albumina.

4.4.4. Ensaios de viabilidade, ciclo e apoptose de células tumorais

Depois que os camundongos foram sacrificados, o líquido ascítico contendo as células tumorais foi coletado da cavidade peritoneal e diluído 20 vezes com solução salina imediatamente. A viabilidade das células tumorais foi avaliada por coloração com azul de tripano a 0,4 por cento e contadas em um contador de células automatizado (ALIT Life Science Co., Ltd., Xangai, China).

A suspensão celular diluída (0,5 mL) foi centrifugada a 1000 g por 5 min a 4 graus C. As células foram coletadas e fixadas em etanol frio a 70 por cento a 4 graus durante a noite. Após a fixação, as células tumorais foram lavadas duas vezes em PBS e centrifugadas e, em seguida, incubadas com solução de RNase A (100 μL) por 30 min a 37 graus. Finalmente, as células foram incubadas com 400μL de iodeto de propídio

(PI) por 30 min a 4 graus no escuro e filtrada através de uma membrana de 300-malha de nylon. A porcentagem de células em diferentes fases foi analisada usando um citômetro de fluxo Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

A apoptose de células tumorais foi detectada usando um kit de Apoptose Anexina V-FITC/PI. A suspensão celular diluída (0,5 mL) foi lavada duas vezes em PBS e centrifugada a 1000g por 5 min a 4 graus. As células foram coletadas e ressuspensas em 100 uL de tampão de ligação seguido de incubação com 5 μL de Anexina V-FITC e 10 μL de solução de coloração PI por 15 min à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, 400 μL de tampão de ligação foi adicionado a cada tubo. A apoptose celular foi detectada usando um citômetro de fluxo Accuri C6.

4.4.5. Análise de Western Blot de AQPs, PKC, PKA e PLC nos Rins

Depois que os camundongos foram sacrificados, os rins foram isolados e congelados e então armazenados em -80 grau para análise de expressão de proteínas. As amostras de tecido foram homogeneizadas em tampão de lise RIPA. Após armazenamento a-20 grau durante a noite, os lisados ​​de tecido foram coletados após centrifugação por 10 min a 12,000×g. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado para a determinação das proteínas totais e fosforiladas. As proteínas de membrana foram extraídas dos rins usando um Membrane Protein Extraction Kit de acordo com o protocolo do fabricante. As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit BCA. As soluções protéicas foram desnaturadas em água fervente por 5 minutos e misturadas com tampão de carregamento 5×. Quantidades iguais de proteínas foram separadas em 10 por cento de eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) e posteriormente bloqueadas por 5 por cento de albumina de soro bovino (BSA) por 2 h. Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpos primários contra AOP1(1:2000), AOP2(1:1000), AQP3(1:2000),AQP4(1:1000), PKC (1:2000), PKC (1: 2000), PKA(1:2000), PLC(1:2000), p-PLC(1:800) e -actina (1:5000) a 4 graus durante a noite. Em seguida, as membranas foram lavadas com solução salina tamponada com Tris contendo 0,1 por cento de Tween-20(TBST), e os anticorpos primários foram detectados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (1:5000). As proteínas foram visualizadas com um reagente de quimioluminescência e um sistema de imagem de quimioluminescência Tanon 5200 (Tanon, Xangai, China). As bandas de blot foram quantificadas por densitometria usando ImageJ.

4.5. Determinação de seis principais diterpenóides em TDEE

Euphoria G, ent{{0}}l-hidroxiabicta-8(14),13(15)-dien-16,12-olide,jolkinolide B, EU-phebracteolatin A, Fischer A e jolkinolide E foram dissolvidos em acetonitrilo nas concentrações apropriadas. O TDEE também foi dissolvido em acetonitrila para detectar o conteúdo do ingrediente usando HPLC. A análise de HPLC foi realizada em um sistema de separações Waters 2695 equipado com um detector de matriz de fotodiodos (Waters, Milford, CT, EUA) e uma coluna Agilent Eclipse XDB-C18 （4,6 mm × 250 mm, 5 μm）. Uma fase móvel consistia em 0,1 por cento de água de ácido fórmico (A) e acetonitrila (B). O solvente foi desenvolvido com uma taxa de fluxo de 1 mL/min usando o seguinte programa de gradiente:0-25 min, 65 por cento B;25-40 min, 65 por cento -85 por cento B;{{25 }} min, 85 por cento -100 por cento B. O volume de injeção foi de 10μL. A temperatura da coluna era de 30 graus e foi utilizado um comprimento de onda de 265 mm.

4.6. Experimentos in vitro

4.6.1. Cultura de células

As células HK-2 e mIMCD3 foram adquiridas da Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, China). Todas as células foram cultivadas em uma incubadora em uma atmosfera de 5 por cento de CO2 a 37 graus até 90 por cento de confluência e depois tratadas com diferentes compostos e gerenciadas para os experimentos. As células HK-2 foram cultivadas em MEM NEAA suplementado com 10 por cento de FBS e 1 por cento de antibióticos, enquanto as células mIMCD3 foram cultivadas em um meio DMEM contendo 10 por cento de FBS e 1 por cento de antibióticos.

4.6.2. Análises de Western Blot e transcrição reversa quantitativa-PCR (qRT-PCR) de AQPs

As células HK{0}} e mIMCD3 foram semeadas (5 × 105/poço) em 6-placas de poço por 24 e 12 h antes do tratamento. As células foram tratadas com diferentes compostos por 8 h em 5 por cento de CO, uma incubadora a 37 graus. As células tratadas com 0,1 por cento de dimetilsulfóxido foram usadas como controle de veículo. Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes em PBS frio, colhidas por raspagem em tampão de lise RIPA e depois lisadas. Após armazenamento a -20 grau durante a noite, os lisados ​​foram clarificados por centrifugação a 12,000×g por 10 min, e os sobrenadantes foram coletados e usados ​​em análise de Western blot. Western blot foi realizado como descrito anteriormente nos experimentos com animais neste artigo.

Para o isolamento de RNA total. Após incubação com diferentes compostos por 8 h, as células foram lavadas com PBS e dissolvidas em tampão reagente TRIzol, e o RNA foi isolado de acordo com as orientações do fabricante. O cDNA foi sintetizado a partir de uma quantidade igual de RNA usando um kit de síntese de cDNA. A mistura de reação para gRT-PCR foi preparada pela adição de cDNA, primers direto e reverso mencionados na Tabela 1, água DEPC e master mix verde SYBR. Um instrumento Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR foi usado para análise de expressão gênica. As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 graus por 5 minutos seguido de 40 ciclos de 95 graus por 10 segundos e 60 graus por 34 segundos. Finalmente, os dados de PCR foram analisados ​​por métodos de TC duplo delta em uma planilha do Microsoft Excel.

4.6.3. Efeito do PMA agonista de PKC na Expressão de Proteína AQPs em Células Renais

As células HK-2 e mIMCD3 foram plaqueadas em 6-placas de poço a uma densidade de 5×10 graus células/poço. Após a fixação das células, as células foram pré-incubadas com ou sem agonista de PKC 200 nM （PMA） por 1,5 h e, em seguida, tratadas com eufebracteolatina A （2,5 μM） por 8 h. A extração de proteínas totais e de membrana e a análise de Western blotting foram realizadas conforme descrito em detalhes anteriormente.

4.7. Análise Estatística

O software de análise SPSS 19.0 foi usado para análise estatística. Os dados foram analisados ​​usando ANOVA de uma via ou um teste de soma de classificação. Os dados numéricos foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Diferenças com p<0.05 were="" considered="" statistically="">