Parte dois DsbA-L interage com VDAC1 na apoptose de células tubulares mediada por mitocôndrias e contribui para a progressão da doença renal aguda

Resultados

1. A lesão isquêmica induziu a expressão de DsbA-L em células BUMPT e nos rins de camundongos e pacientes

Para investigar se a lesão isquêmica induziu a expressão de DsbA-L, esgotamos as células BUMPT de ATP por 2 h e, em seguida, permitimos que elas se recuperassem por um período total de 4 h. Os resultados de RT-qPCR e imunoblotting indicaram que a expressão de DsbA-L foi induzida em I/R 2-0, atingiu um pico em I/R 2-2 e, em seguida, reduziu gradualmente para níveis observados em I/R 2-0 (Figura 1a, e e i). A coloração de imunofluorescência de DsbA-L confirmou ainda mais esses achados e indicou que DsbA-L é predominantemente expresso no citoplasma de células BUMPT (Figura 1 m e n). Detectamos ainda a expressão de DsbA-L em camundongos C57BL/6 tratados com isquemia (28 min) e lesão de reperfusão (24 h e 48 h). Os resultados de RT-PCR e imunotransferência indicaram que a expressão de DsbA-L foi induzida tanto no córtex quanto na medula externa do rim de camundongos após 24 h de reperfusão e atingiu um pico 48 h após a reperfusão (Figura 1 b, c, f, g , j e k). Esses achados foram posteriormente confirmados pela coloração imuno-histoquímica de DsbAL (Figura 1 o e p). Por fim, investigamos se os níveis de expressão de DsbA-L foram induzidos em pacientes com LRA causada por isquemia. Esses resultados indicaram que os níveis de mRNA e proteína DsbA-L estavam notavelmente aumentados em pacientes com LRA causada por isquemia quando comparados a pacientes com LM (Figura 1. d, h e l). Esses resultados foram posteriormente validados pela coloração de imunofluorescência de DsbA-L (Figura 1. q e r).

Figura 1. DsbA-L foi induzida por I/R em células BUMPT e rins de camundongos e pacientes. O modelo I/R em células BUMPT foi induzido por 10 mM de antimicina A e 1,5 mM de ionóforo de cálcio por 2 h e recuperado por 0, 2 e 4 h. O modelo de camundongos I/R foi induzido por isquemia renal bilateral por 28 min e reperfusão por 24 e 48 h. Amostras de biópsia renal foram coletadas de pacientes com LRA induzida por I/R e pacientes com doença de alteração mínima (MCD). (ad) Detecção por RT-qPCR da expressão de DsbA-L em células BUMPT, tecido cortical renal de camundongos e fora da medula e pacientes renais com ou sem condição de I/R. (e- h) Análise de Immunoblot de DsbA-L e b-tubulina em células BUMPT sob modelo I/R em células BUMPT, tecido cortical, fora da medula e pacientes renais. (i- l) Análise densitométrica da expressão das proteínas DsbA-L e b-tubulina. (m, o e q) Imunofluorescência e coloração imuno-histoquímica de DsbA-L em células BUMPT e rins de camundongos e pacientes com ou sem condição de I/R, respectivamente. (n, p, e r) Análise de quantificação da coloração DsbA-L. Ampliação original x 400. Scar Bar:10µM em m100µM em o e q. Cada experimento (e-h, m, o e q) foi repetido 6 vezes independentemente com resultados semelhantes. Testes t de Student bicaudais foram usados ​​para comparações de dois grupos. (a- d, i- l, n, p e r). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.

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2. Lesão renal induzida por IR, apoptose de células tubulares e danos mitocondriais foram atenuados em camundongos PT-DsbA-LKO

Os irmãos de ninhada de camundongos PT-DsbA-L-WT e PT-DsbA-L-KO foram tratados com ou sem isquemia (28 min) e lesão de reperfusão (24 h e 48 h). Após esse tratamento, coletamos amostras de sangue e amostras de tecidos renais para exame posterior. Funcionalmente, a deterioração da função renal induzida por I/R foi caracterizada pelo aumento dos níveis de nitrogênio ureico no sangue (BUN) e creatinina nos camundongos PT-DsbA-L-WT; este efeito foi significativamente atenuado nos camundongos PT-DsbA-L-KO (Figura 2a e b). As análises de histologia e TUNEL também verificaram que I/R induziu dano tecidual notável e apoptose nos camundongos PT-DsbA-L-WT, embora isso tenha melhorado nos camundongos PT-DsbA-L-KO (Figura 2c,d,f, e g). Curiosamente, as análises de microscopia eletrônica (EM) indicaram que os camundongos PT-DsbA-L-KO mostraram atenuação acentuada do dano mitocondrial induzido por I/R (Figura 2 e e h). Immunoblotting verificou ainda que os camundongos PT-DsbA-LKO também expressaram níveis mais baixos de caspase clivada -3, taxas de acúmulo mais baixas de Bax na mitocôndria e níveis reduzidos de liberação de citocromo c (Cyt-c) no citosol (Figura 2 eu-o). Os resultados da análise de RT-qPCR demonstraram que PT-DsbA-L-KO reverteu a redução de NRF1 e PCG-1a causada pelo I/R(Figura 2 p e q), o que foi posteriormente confirmado pela análise de immunoblotting ( Figura 2 r-t). Esses dados mostraram que DsbA-L desempenhou um papel fundamental na LRA induzida por I/R.

Figura 2. Atenuação da lesão renal induzida por IR, apoptose de células tubulares, dano mitocondrial e a expressão de Bax, Cytc e caspase3 clivada em camundongos PT-DsbA-L-KO. As artérias renais bilaterais de camundongos da mesma ninhada PT-DsbA-L-KO e PT-DsbA-L-WT foram pinçadas por 28 minutos e depois liberadas por 48 horas para estabelecer um modelo de IR. (a) BUN (b) Creatinina sérica (c) Coloração de hematoxilina e eosina. (d) Seções representativas de células TUNEL-positivas. (e) Detecção por microscópio eletrônico da morfologia mitocondrial. (f) Pontuação de danos tubulares. (g) O número de células positivas para TUNEL. (h) Pontuação de lesão mitocondrial. (i) A análise de immunoblot da expressão de caspase3 clivada e DsbA-L, e a expressão de BAX e Cyt-c em frações mitocondriais e citosólicas. b-tubulina e GAPDH foram usados ​​como lisado total ou controle de carga citosólica, respectivamente. COX IV foi usado como um controle de carga mitocondrial. (j- o) Análise da imagem em tons de cinza entre eles. (p e q) Detecção por RT-qPCR da expressão de NRF1 e PCG-1a. (r) A análise de immunoblot da expressão de NRF1 e PCG-1a. (s e t) Análise da imagem em tons de cinza entre eles. Ampliação original x 400 ou x6000. Barra de cicatriz: 100µM em c&d 20µM em e. Cada experimento (ce, I e r) foi repetido 6 vezes independentemente com resultados semelhantes. ANOVA de uma via foi usada para as comparações de grupos múltiplos. (a, b,f- h, jo, pq&s- t). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-DsbA-L-WT with IR group.

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3. Apoptose induzida por I/R mediada por DsbA-L em células BUMPT

Para investigar melhor se DsbA-L medeia a apoptose em células BUMPT induzidas por I/R, nós transfectamos células BUMPT com DsbA-L siRNA e depois depletamos essas células de ATP por 2 h; as células foram então deixadas a recuperar durante 2 h. As análises de FCM descobriram que o siRNA DsbA-L atenuou significativamente a apoptose induzida por I/R em células BUMPT (Figura 3a). As análises de imunotransferência confirmaram ainda que o siRNA DsbA-L suprimiu notavelmente o aumento induzido por I/R na expressão de caspase -3 clivada, o acúmulo aumentado de Bax na mitocôndria e a liberação aumentada de Cyt-c no citosol (Figura 3b-h). Os resultados da análise RT-qPCR mostraram que I/R suprimiu a expressão de NRF1 e PCG-1a, que foi revertida pelo siRNA DsbA-L (Figura 3 i e j). Os resultados de immunoblotting foram consistentes com os achados de RT-qPCR (Figura 3 km). Em contraste, o plasmídeo DsbA-L aumentou a apoptose induzida por I/R em células BUMPT, aumentou a expressão de caspase clivada -3, aumentou o acúmulo de Bax e aumentou a liberação de Cyt-c no citosol (Figura 3 o-u). Os resultados da análise RT-qPCR indicaram que I/R suprimiu a expressão de NRF1 e PCG-1a, que foi aprimorada pelo plasmídeo DsbA-L (Figura 3 v e w). Os resultados de immunoblotting confirmaram ainda mais os achados de RT-qPCR (Figura 3 x-z). Esses dados confirmaram ainda que DsbA-L mediou o processo de apoptose, bem como a disfunção mitocondrial durante a lesão isquêmica.

Figura 3. DsbA-L mediou a expressão induzida por IR de caspase3 clivada, BAX e Cyt-c em células BUMPT. O plasmídeo e siRNA de DsbA-L foram transfectados em células BUMPT e então expostos à depleção de ATP por 2 h e recuperação por 2 h. (a&n) Análise de citometria de fluxo de apoptose de células BUMPT. (b&o) Os imunoblots analisaram a expressão de caspase3 clivada e DsbA-L, e a expressão de BAX e Cyt-c nas frações mitocondrial e citosólica. b-tubulina e GAPDH foram usados ​​como lisado total ou controle de carga citosólica, respectivamente. COX IV foi usado como um controle de carga mitocondrial. (c- h, e q- u) Análise da imagem em tons de cinza entre eles. (i,j e v, w) RT-qPCR detecta a expressão de NRF1 e PCG-1a. (kex) A análise de immunoblot da expressão de NRF1 e PCG-1a. (l, m e y,z) Análise da imagem em tons de cinza entre eles. Cada experimento (a, b, k, n, o e x) foi repetido 6 vezes independentemente com resultados semelhantes. ANOVA de uma via foi usada para as comparações de grupos múltiplos. (c- j,c-m, p- w & y, z). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

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4. DsbA-L interagiu com VDAC1 em células BUMPT que foram submetidas à depleção de ATP, bem como nos rins de camundongos e pacientes com LRA

Resultados anteriores sugeriram que o canal aniônico dependente de voltagem-1 (VDAC1), uma importante proteína da membrana mitocondrial externa, está envolvido na apoptose celular36 Nosso estudo recente relatou que DsbA-L também é expresso na mitocôndria. Portanto, levantamos a hipótese de que DsbA-L interagiu com VDAC1 para regular a progressão da LRA. Os resultados de imunoprecipitação (IP) demonstraram que o anticorpo anti-VDAC1 reduziu as proteínas VDAC1 e DsbA-L, enquanto o anti-DsbA-L precipitou DsbA-L e VDAC1 em lisados ​​inteiros de controle e grupos I/R de células BUMPT, e rins de camundongos e rins de pacientes (Figura 4a). Além disso, os lisados ​​mitocondriais de rins de camundongos de células BUMPT e rins de pacientes também foram usados ​​para o co-IP de DsbA-L e VDAC1; os achados foram consistentes com os do lisado total (Figura 4b). A estrutura de DsbA-L contém um domínio de ligação a nucleotídeos/domínio ATPase (aminoácidos 1-51), um domínio amino-terminal (NTD), uma região helicoidal para dimerização (aminoácidos 56-178) e um domínio carboxil-terminal (CTD; aminoácidos 185-216) (Figura 4c). Com base na estrutura de VDAC1, a previsão de software indicou que o domínio N-terminal (aminoácidos 1 a 25) de VDAC1 pode interagir com DsbA-L (Figura 4d). Para esclarecer quais domínios de VDAC1 podem interagir com DsbA-L, construímos três plasmídeos para HA-VDAC1 apresentando aminoácidos 1- 75, aminoácidos 76-1098 e o gene completo (Fig 4e). O anticorpo anti-HA precipitou DsbA-L em grupos apresentando VDAC1 com aminoácidos 1-75 e o gene completo, mas não com VDAC1 e o plasmídeo apresentando aminoácidos 76-1098. Isso indicou que DsbA-L interagiu com a região de VDAC1 que apresenta os aminoácidos 1-75 (Figura 4f). Para investigar melhor quais regiões específicas de VDAC1 interagiram com DsbA-L, transfectamos células BUMPT com o HA-Tag de plasmídeos VDAC1 com D9-13, 22-27, D39-45, {{59 }}, D9-13, 22-27, 39-45, 55-57. Os resultados de IP demonstraram que o anticorpo anti-HA apenas precipitou DsbA-L com os plasmídeos D39-45 e 55-57, e não os plasmídeos D9-13 e 22-27 (consulte a Figura 4g ). Isso demonstrou ainda que DsbA-L interagia com os aminoácidos 9-13 e 22-27 de VDAC1. A Figura 4g apresenta um modelo que mostra como DsbA-L interage com os aminoácidos 9-13 e 22-27 de VDAC1 (Figura 4g). Coletivamente, esses dados indicam que DsbA-L interage com os aminoácidos 9-13 e 22-27 de VDAC1.

Figura 4. Interação entre DsbA-L e VDAC1 em células BUMPT com ou sem depleção de ATP e rins de camundongos I/R renais e pacientes. (a&b n=3 por grupo) Todo o lisado mitocondrial foi extraído para coimunoprecipitação recíproca de DsbA-L e VDAC1 em células BUMPT tratadas com depleção e recuperação de ATP e os rins de camundongos e pacientes com LRA induzida por I/R. (cn=3 por grupo) Os domínios funcionais e a estrutura de DsbA-L. (dn=3 por grupo) O modelo de previsão da interação DsbA-L e VDAC1. (e-gn=3 por grupo) Os imunoprecipitados anti-HA foram analisados ​​para HA e então detectados para DsbA-L usando imunoblotting.

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5. Colocalização de DsbA-L ou VDAC1 na mitocôndria, e a colocalização de DsbA-L e VDAC1 em (i) células BUMPT com depleção de ATP e (ii) rins de camundongos e pacientes

Para confirmar nossos resultados de IP, realizamos um ensaio de co-localização. A microscopia confocal de imunofluorescência demonstrou que DsbA-L ou VDAC1 se localizou nas mitocôndrias das células BUMPT e nos rins de camundongos falsos e pacientes com MCD e que esse efeito foi ainda mais intensificado nas células BUMPT com depleção de ATP e nos rins de camundongos e pacientes com LRA (Figura 5 a,b,d,e,g eh). Curiosamente, a microscopia confocal de imunofluorescência verificou que o sinal de co-localização de DsbA-L e VDAC1 em células BUMPT e nos rins de camundongos falsos e pacientes com MCD era relativamente fraco. No entanto, o sinal de co-localização foi acentuadamente aumentado em células BUMPT que foram depletadas de ATP e nos rins de camundongos e pacientes com LRA (Figura 5 c, f e i). Coletivamente, esses dados fornecem mais evidências para apoiar a interação de DsbA-L e VDAC1 nas mitocôndrias.

Figura 5. Colocalização de DsbA-L e VDAC1 nas mitocôndrias de células BUMPT e rins de camundongos e pacientes com IRA. (a, d&g n=4 por grupo) Localização de DsbA-L na mitocôndria em células BUMPT com ou sem depleção e recuperação de ATP, os rins de modelos de camundongos nos grupos sham e I/R, bem como MCD e pacientes I/R. (b, e&h n=4 por grupo) Localização de VDAC1 na mitocôndria em células BUMPT com ou sem depleção e recuperação de ATP, os rins de modelo de camundongos nos grupos sham e I/R, bem como MCD e I/ R. (c, f&i n=4 por grupo) A co-localização de DsbA-L e VDAC1 na mitocôndria em células BUMPT com ou sem depleção e recuperação de ATP, os rins de modelos de camundongos nos grupos sham e I/R bem como pacientes MCD e I/R.

6. Apoptose de células BUMPT mediada por VDAC1-mediada por isquemia-reperfusão

Em seguida, tentamos determinar se VDAC1 estava envolvido no processo de apoptose induzida por I/R em células BUMPT. Os resultados da imunotransferência indicaram que a expressão de VDAC1 foi induzida em I/R 2-0 e atingiu um pico em I/R 2-2, antes de reduzir gradualmente para os níveis observados em I/R 2-0 ( Figura 6 aeb). A análise de FCM mostrou que I/R induziu apoptose em células BUMPT; este efeito foi atenuado pela aplicação de VDAC1 siRNA (Figura 6c). Os resultados de imunotransferência verificaram ainda que o siRNA de VDAC1 melhorou acentuadamente o aumento induzido por I/R na expressão de caspase -3 clivada, o acúmulo aumentado de Bax na mitocôndria e a liberação aumentada de Cyt-c no citosol (Figura 6d- k). Por outro lado, as alterações acima foram intensificadas pela superexpressão do plasmídeo VDAC1 (Figura 6 l-s). Juntos, esses dados demonstraram que VDAC1-mediava a apoptose induzida por I/R em células BUMPT.

Figura 6. A expressão induzida por IR de caspase3 clivada, BAX e Cyt-c em células BUMPT foi mediada por VDAC1. O siRNA ou plasmídeo de VDAC1 foi transfectado em células BUMPT e então exposto à depleção de ATP por 2 h e recuperação por 2 h. (a) Análise de imunotransferência de VDAC1 e b-tubulina em células BUMPT. (b) Análise da imagem em tons de cinza entre eles (c) Análise por citometria de fluxo da apoptose das células BUMPT. (d) Os imunoblots analisaram a expressão de caspase3 clivada, VDAC1 e DsbA-L, e a expressão de BAX e Cyt-c nas frações mitocondrial e citosólica. b-tubulina e GAPDH foram usados ​​como lisado total ou controle de carga citosólica, respectivamente. COX IV foi usado como um controle de carga mitocondrial. (ek) Análise da imagem em tons de cinza entre eles. (i) Análise de citometria de fluxo de apoptose de células BUMPT. (m) Os immunoblots analisam a expressão de caspase3 clivada, VDAC1 e DsbAL, e a expressão de BAX e Cyt-c em frações mitocondriais e citosólicas. b-tubulina e GAPDH foram usados ​​como lisado total ou controle de carga citosólica, respectivamente. COX IV foi usado como um controle de carga mitocondrial. (ns) Análise da imagem em tons de cinza entre eles. Cada experimento (a,c,d,l & m) foi repetido 6 vezes independentemente com resultados semelhantes. Testes t de Student bicaudais foram usados ​​para comparações de dois grupos. (b), ANOVA de uma via foi usada para as comparações de grupos múltiplos. (e- k e n- s). # p<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.# P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

extrato de cistanche

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h e Dongshan Zhang a,b *

a Departamento de Medicina de Emergência, República Popular da China

b Instituto de Medicina de Emergência e Doenças Difíceis, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410011, República Popular da China

c Departamento de Oftalmologia, República Popular da China

d Departamento de Cirurgia Urinária, República Popular da China

e Departamento de Cirurgia Torácica, República Popular da China

f Departamento de Cirurgia Geral, Segundo Hospital de Xiangya, República Popular da China

g Departamento de Saúde Pública, Central South University, Changsha, Hunan, República Popular da China

h Departamento de Endocrinologia, Shenzhen People's Hospital, The Second Clinical Medical College da Jinan University, The First Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology, Shenzhen, People's Republic of China

1 Xiaozhou Li e Jian Pan contribuíram igualmente para este estudo