Parte Ⅰ O quelante de ferro, PBT434, modula o tráfego transcelular de ferro em células endoteliais microvasculares cerebrais
Apr 28, 2023
Abstrato
Ferro e outros metais de transição, como cobre e manganês, são essenciais para apoiar a função cerebral, mas o acúmulo excessivo é citotóxico. Essa superacumulação de metais, principalmente ferro, é comum a vários distúrbios neurológicos; estes incluem doença de Alzheimer, doença de Parkinson, ataxia de Friedrich e outros distúrbios que apresentam neurodegeneração e acúmulo de ferro no cérebro associado. O gerenciamento do fluxo de ferro pela barreira hematoencefálica fornece a primeira linha de defesa contra o acúmulo excessivo de ferro na fisiologia normal e nessas condições patológicas. Neste estudo, determinamos que o quelante de ferro PBT434, que está sendo desenvolvido atualmente para o tratamento da doença de Parkinson e atrofia de múltiplos sistemas, modula a absorção de ferro pelas células endoteliais microvasculares do cérebro humano (hBMVEC) por quelação de Fe extracelular2 mais. O tratamento de hBMVEC com PBT434 resulta em um aumento na abundância dos transcritos para o receptor de transferrina (TfR) e ceruloplasmina (Cp). As análises de Western blot e ELISA também revelam um aumento correspondente nas proteínas. Dentro da célula, o PBT434 aumenta o nível detectável de Fe caridoso e lábil2 mais; dados indicam que este Fe2 maisé liberado da ferritina. Além disso, o PBT434 potencializa o efluxo de ferro provavelmente devido ao aumento do ferro ferroso citosólico, o substrato para o exportador de ferro, a ferroportina. O PBT434 se equilibra rapidamente e bidirecionalmente através de uma barreira hematoencefálica hBMVEC. Esses resultados indicam que o complexo de ferro PBT434-não é um substrato para a absorção de hBMVEC e, portanto, suporta um modelo no qual o PBT434 quelaria o ferro intersticial e inibiria a recaptação de ferro pelas células endoteliais da barreira hematoencefálica, como bem como inibem sua captação pelas demais células da unidade neurovascular. No geral, isso apresenta um mecanismo novo e promissor para a quelação terapêutica do ferro.
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Introdução
A terapia de quelação de metal (MCT) tem sido usada há muito tempo como tratamento para envenenamento por metais de transição e para distúrbios genéticos no metabolismo de um íon metálico essencial que leva à superacumulação do metal [1-3]. Dois exemplos desta última são a hiperacumulação de cobre na doença de Wilson [4] e de ferro na hemocromatose hereditária [5]. Tanto o cobre quanto o ferro são catalisadores do estresse oxidativo e, portanto, são citotóxicos em concentrações que excedem a capacidade da célula e do organismo de 'acompanhar' esses metais de transição redox-ativos [6, 7]. O acúmulo de ferro, em particular, é amplamente idiopático; de fato, um aumento de ferro é uma marca registrada de um cérebro envelhecido [8-10]. Patologicamente, esse acúmulo de ferro no cérebro é uma característica de mutações em genes não relacionados ao metabolismo do ferro [11-15], bem como uma variedade de outras doenças neurodegenerativas, algumas das quais carecem de uma ligação genética específica, como envelhecimento [16], doença de Alzheimer [ 17], Ataxia de Friedreich [18] e Doença de Parkinson [19]. Como um grupo, tais distúrbios podem ser considerados como neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro (NBIA), embora esse acrônimo tenha sido comumente restrito àqueles para os quais uma ligação genética foi identificada [11, 13, 14].
No caso de sobrecarga de ferro, o objetivo é 'limpar' o corpo do excesso de ferro devido a um defeito na captação ou efluxo de ferro celular. Aqui, o objetivo é competir com os quelantes de ferro fisiológicos com a droga; um composto com boa farmacocinética e alta afinidade pelo ferro ferroso é o fármaco-alvo. Como o corpo está repleto do metal essencial, há pouca preocupação em induzir uma deficiência no decorrer do tratamento. O tratamento de doenças cerebrais com terapia de quelação de ferro requer uma estratégia diferente. Este não é um problema de sobrecarga sistêmica de ferro, mas de acúmulo de ferro em áreas de patologia com sequelas prejudiciais a jusante. O acúmulo de ferro associado à idade na doença de Parkinson (DP), por exemplo, contribui potencialmente para o dano celular relacionado ao estresse oxidativo [20]. O excesso de ferro lábil promove o desdobramento incorreto da -sinucleína nos neurônios da substância negra. O uso de um quelante de alta afinidade pode levar a alguma redução na carga cerebral de ferro, mas certamente induzirá uma deficiência de ferro que, pelo menos na população idosa, é contraindicada devido à deficiência sistêmica de ferro comum nessa faixa etária [21] . Um quelante com uma afinidade ideal tem o potencial de reduzir o acúmulo de ferro, bem como o estresse oxidativo decorrente do excesso de ferro lábil e dos processos patológicos subjacentes.
cistanche tubulosaeEfeitos de Cistanche
Um quelante aprovado para uso no tratamento da sobrecarga de ferro induzida por transfusão em pacientes com talassemia é o deferiprona (DFP, marca Ferriprox) [5, 22]. O DFP também tem sido usado no tratamento da ataxia de Friedreich [23] e da doença de Parkinson [24, 25]. Em uma meta-análise, DFP demonstrou fornecer reduções significativas no teor de ferro miocárdico, bem como maior proteção cardíaca em pacientes com talassemia do que a deferoxamina, o clássico agente quelante de ferro [5]. Por outro lado, DFP é rapidamente metabolizado pelo fígado [26] e trabalhos mais recentes mostraram quela Fe2 plus no sítio ativo de histonas lisina demetilases dependentes de ferro, uma atividade que se correlaciona com uma citotoxicidade previamente não reconhecida [27]. Esse achado ressalta uma limitação importante no uso da terapia de quelação de ferro, ou seja, a competição da droga pelo ferro fisiologicamente essencial, seja em um estoque de ferro ou em uma proteína que abriga uma espécie protética de ferro. No entanto, o DFP, por exemplo, mostrou eficácia em um tratamento experimental de Fase 2 da doença de Parkinson, conforme indicado por índices analíticos (carga de ferro cerebral reduzida por ressonância magnética ponderada em T2-) e comportamentais (função cognitiva e do neurônio motor) [ 24, 25].
A afinidade de DFP para Fe3 plus continua a ser uma preocupação, no entanto. A espécie DFP-ferro estável é o complexo tris, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Embora a neutralidade desse complexo seja ideal para mobilizar o ferro para fora da célula, a constante de estabilidade para ele, ~1037, torna o DFP um verdadeiro eliminador de ferro; neste contexto, sua inibição de uma enzima de ferro como a lisina demetilase é previsível [27]. Essa preocupação reflete a necessidade de desenvolver quelantes de ferro que tenham a permeabilidade de membrana do DFP, mas uma afinidade significativamente mais fraca para Fe2 plus e Fe3 plus. Esta última característica limita a eliminação de drogas do metal protético e o potencial termodinâmico do agente quelante para catalisar a auto-oxidação do ferro ferroso que resulta na produção de espécies reativas de oxigênio. Em essência, fortes quelantes de ferro férrico catalisam a propriedade pró-oxidante de Fe2 plus [29]. Neste estudo, relatamos como esse quelante de ferro com afinidades moderadas de ferro férrico e ferroso modula o fluxo de ferro nas células endoteliais microvasculares do cérebro que formam a barreira hematoencefálica (BHE).
Comprimidos Cistanche
Esta droga, PBT434 [5,7-dicloro-2-((metilamino)metil)-8-hidroxi-3-metilquinazolin-4 (3H)-ona, Fig. 1A] , forma um complexo de bis-ferro com constantes de estabilidade de log de ~11 e ~15 para Fe2 maise Fe3 mais, respectivamente [30]. O PBT434 evitou a perda de neurônios da substância nigra pars compacta (SNpc), reduziu o acúmulo de sinucleína nigral, reduziu o conteúdo de ferro relacionado ao modelo de doença de DP no mesencéfalo e resgatou o desempenho motor em dois modelos de camundongos com doença de Parkinson sem qualquer esgotamento aparente dos estoques de ferro sistêmico [30]. O PBT434 também é eficaz em modelos murinos de Atrofia de Sistemas Múltiplos (MSA) [30, 31], um distúrbio motor semelhante em apresentação ao Parkinson, mas caracterizado por dobramento incorreto de sinucleína e subsequente acúmulo, causando a formação de inclusões citoplasmáticas gliais que são a marca registrada patologia da doença [32]. Significativamente, o PBT434 reduziu os marcadores de estresse oxidativo em modelos de DP em camundongos [30] indicando que 1) PBT434 tinha como alvo os estoques de ferro que, de outra forma, seriam preparados para funcionar como pró-oxidantes e 2) o PBT434 não potencializou essa citotoxicidade baseada na oxidação nascente. O PBT434 concluiu satisfatoriamente um estudo de Fase 1 [33].
O trabalho aqui apresentado foi concebido para interrogar o impacto que o PBT434 tem no tráfego de ferro nas células de barreira do cérebro, as células endoteliais microvasculares que, juntamente com as células gliais subjacentes, formam a barreira hematoencefálica. Esses estudos usaram uma linha celular endotelial imortalizada bem validada em formatos de cultura monocamada e transwell [34-37]. O objetivo principal desses estudos foi determinar a cinética de absorção e efluxo de ferro dessas células e sua modulação por PBT434. O modelo transwell BBB também foi usado para demonstrar o fluxo transcelular bidirecional de PBT434 através da barreira da célula endotelial. O modelo demonstrou em termos moleculares que o PBT434 inibe a absorção de ferro por quelação enquanto estimula o efluxo de ferro. Estudos de imagem celular indicam que o PBT434 acessa o mesmo pool de ferro lábil sondado por um clássico Fe2 maisagente quelante, 2,2'-bipiridina ou bipiridil, e uma sonda fluorescente para ferro ferroso. Os resultados sugerem um possível mecanismo de ação para PBT434 que inclui a inibição da captação de ferro sistêmico na BHE e subsequente sequestro de ferro cerebral no espaço intersticial.
Resultados
1. PBT434 não tem efeitos citotóxicos nas células endoteliais microvasculares do cérebro
Para determinar uma faixa apropriada de concentrações de trabalho para PBT434 em nossa cultura de células in vitro, utilizamos o ensaio MTT para monitorar a função mitocondrial hBMVEC em resposta a PBT434. Com base em relatórios anteriores [30], foram tratados com uma faixa de concentrações de PBT434 de até 100 μM por 24h. Não observamos alterações significativas na viabilidade de hBMVEC com qualquer concentração testada (Fig. 2).
2. O PBT434 é rapidamente captado e trafegado através da barreira hBMVEC
O PBT434 é um fármaco oralmente biodisponível que pode facilmente penetrar na BHE, conforme observado em estudos realizados em camundongos e humanos [30, 38, 39]. Monitoramos o acúmulo de PBT434 em hBMVEC cultivadas em monocamadas usando PBT434 marcado com 14C como radiotraçador. Os dados indicaram que na primeira fase, 14C-PBT434 se equilibrou rapidamente entre o meio de absorção e a célula. Essa absorção inicial foi seguida por um acúmulo lento adicional ao longo de 3 h, que exibiu uma taxa de 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (Fig. 3A). No protocolo de absorção, a absorção é extinta e as células são lavadas a 4˚C antes do processamento para acúmulo de 14C-PBT434 (Métodos). Em um experimento separado, examinamos o efluxo de 14C-PBT434 de hBMVEC após um período de carregamento de 30 min. No protocolo de efluxo, as células são lavadas a 25˚C. Os dados na Fig. 3B indicam que na lavagem a 25˚C, aproximadamente 92 por cento do 14C-PBT434 acumulado nas células foi perdido (cf. proteína em t=0 em 3B). Houve mais uma perda lenta do restante 14C-PBT434 (Fig. 3B). Os dados sugerem dois aspectos do acúmulo e efluxo de PBT434 por hBMVEC. O fluxo através da membrana plasmática atinge rapidamente o que parece ser um equilíbrio, seja durante a captação ou efluxo. Porém, em ambos os processos, aparece outro processo mais lento. Isso sugere que dentro da célula, alguma fração da célula PBT434 está em um local/estado que está em uma relação de estado estacionário cinético com a fração em equilíbrio com o meio extracelular. A análise cinética observada na Fig. 3B estimou que este pool de PBT434 foi representado por 27±4 pmol/mg de proteína no lisado celular quando as células foram tratadas com 20 μM de reagente.
Para examinar o fluxo transcelular de PBT434, empregamos um modelo de BBB in vitro bem validado usando crescimento no lado apical de uma membrana transwell [35, 36, 40, 41]. As propriedades de barreira dessas culturas transwell foram verificadas pela quantificação de sua resistência elétrica transendotelial (TEER) e impermeabilidade ao dextrano marcado com FITC (S1 Fig). Comparamos a captação de 14C-PBT434 no lado sanguíneo luminal (ou apical) (Fig 4A) com a captação na membrana abluminal (ou basolateral, lado cerebral) (Fig 4C). No mesmo experimento, o efluxo correspondente (fluxo transcelular) foi quantificado pelo aparecimento de 14C-PBT434 na câmara de efluxo (Fig. 4 painéis B e D). As taxas desses processos são fornecidas na Tabela 1. Os dados de massa ilustrados na Fig. 4 (painéis B e D) mostram que o fluxo líquido de PBT434 através deste modelo de barreira hematoencefálica foi o mesmo nas duas direções. Havia 976±185 pmol 14C-PBT434 acumulado na câmara basal (Fig 4B) e 1033±210 pmol quantificado na câmara basal (Fig 4D). Esta quase equivalência refletiu-se também nas taxas muito semelhantes de efluxo de PBT434 nas duas membranas de barreira (Tabela 1). No entanto, houve uma absorção significativamente maior de PBT434 na membrana basolateral neste modelo de barreira, conforme ilustrado pela perda ~ 50 por cento maior de composto da câmara basal (Fig 4C) que correspondeu a uma taxa ~ 40 por cento maior de absorção celular aparente (Tabela 1). Prevê-se que uma absorção mais robusta resultará em maior acumulação. A análise das células em 3h mostrou que elas retinham ~ 6 μM PBT434, independentemente da direção do fluxo. Os valores foram 8,1± 1,3 μM (apical a basal) e 4,7±1,2 μM (basal a apical). Conforme observado acima, esta análise segue a lavagem das células antes da lise e quantificação da proteína celular total e 14C-PBT434. Além disso, o meio na câmara apical continha RPMI mais 10 por cento de FBS e 10 por cento de NuSerum, enquanto a câmara basal do 'cérebro' continha apenas RPMI (Métodos). Uma inferência razoável foi que a maior 'absorção' na membrana basal refletiu uma adsorção de PBT434 na superfície celular que foi limitada na câmara apical pela presença de componentes proteicos no soro. Ao lavar as células para acúmulo de PBT434, esse material adsorvido (que era registrado como 'absorção') foi removido. A repetição deste experimento de fluxo, mas com soro na câmara basal, demonstrou que, de fato, o soro suprimiu essa provável adsorção de PBT434 na superfície celular (Fig. S2).
3. PBT434, ao contrário do bipiridil, não limita a disponibilidade intracelular de ferro lábil
Como o PBT434 tem uma afinidade mais moderada pelo ferro em comparação com quelantes de ferro clássicos, como deferiprona ou bipiridil, examinamos como essa diferença se refletiu no efeito do PBT434 no pool de ferro lábil celular (LIP) de hBMVEC. Para fazer isso, aproveitamos o permeável, Fe2 mais-corante fluorescente específico FerroOrange, que reage com o ferro citoplasmático caritativo. Vimos uma ablação significativa de fluorescência em células quando tratadas com bipiridil, consistente com a quelação do LIP por este quelante de ferro ferroso de alta afinidade e, assim, bloqueando a ação do indicador de ferro fluorescente (Fig. 5A). Em contraste, PBT434 não competiu com FerroOrange para Fe2 mais, um comportamento consistente com sua afinidade mais moderada [30]. Os resultados mostraram que o PBT434, mas não o derivado inativo PBT434-, induziu um aumento de 34 ± 9 por cento no ferro-laranja acessível Fe2 maissugerindo que este agente quelante mobilizou ferro dentro da célula sem toxicidade concomitante. Os dados apresentados abaixo sugerem que este ferro veio da ferritina.
O PBT434 demonstrou anteriormente restaurar a expressão da proteína ferroportina empobrecida em camundongos tratados com MPTP a um nível semelhante ao de camundongos não lesionados [30]. Este resultado, juntamente com o aumento na coloração de ferro ferroso intracelular em resposta ao PBT434, sugeriu um efeito potencial no sistema de resposta do ferro celular e na função das proteínas relacionadas ao ferro a jusante. Para avaliar isso, primeiro conduzimos a análise quantitativa de PCR (qPCR) do efeito PBT434 na abundância dos transcritos para várias proteínas de manipulação de ferro (Fig. 6). Enquanto os transcritos para a proteína de efluxo de ferro, ferroportina (Fpn), e as duas chaperonas citoplasmáticas de ferro, PCBP1 e 2 não foram afetados, a abundância dos mRNAs para o receptor de transferrina (TfR) e a ferroxidase, ceruloplasmina (Cp), não foram afetados. mudar. As transcrições de TfR e Cp aumentaram em 2,8 e 3,6-vezes, respectivamente. A expressão do receptor de transferrina (TfR) está ligada ao sistema de elemento responsivo ao ferro (IRE)/proteína reguladora do ferro (IRP) [42-44]. O aumento no mRNA de TfR sugere que o PBT434 compete com a entrega de ferro dependente de PCBP1-para a montagem do cluster Fe, S que converte o IREBP regulador de uma proteína de ligação ao RNA em aconitase citosólica [45]. Assim, o PBT434 desloca esta modulação regulatória para a ligação do RNA e a inibição correspondente da degradação do mRNA do TfR. Na deficiência de ferro celular, a expressão de Cp é, em parte, regulada pelo HIF-1 [46]. Um aumento na função do HIF-1 decorre do knock-down de sua hidroxilação pela atividade da prolil hidroxilase em uma reação dependente de ferro [47]. Como no caso do IREBP, o PBT434 parece diminuir o pool de ferro que serve como cofator na hidroxilação e degradação do HIF-1. Nesse modelo, o aumento no nível de estado estacionário desse ativador transcricional aumenta a transcrição de Cp.
Usando uma combinação de análise ELISA e western blotting, investigamos a expressão de proteínas de manipulação de ferro em PBT434 ou PBT434-met tratado com hBMVEC; exemplos das análises de WB são dados na Fig. 7A. Os dados mostraram que a abundância de monômero e dímero de TfR aumentou significativamente em 24h, assim como Cp (Fig. 7B e 7C). Ambos os aumentos foram paralelos ao aumento dependente de PBT434- nos respectivos transcritos (Fig 6). Em contraste, a expressão da proteína de efluxo de ferro, Fpn, foi insensível ao tratamento com PBT434 (Fig 7D).
Usamos ELISA como um método adicional para quantificar as mudanças de dobra indicadas pelos dados de western blot. Assim, as hBMVEC foram tratadas com PBT434 por 24 horas e os lisados celulares foram testados por ELISA para TfR (Fig. 8A). O aumento de vezes em TfR em resposta ao tratamento com PBT434 quantificado por ELISA foi equivalente ao fornecido pela análise dos western blots (Fig. 7B). O ELISA também foi usado para avaliar a abundância da proteína Cp secretada e ligada a GPI, usando células HepG2 como controle positivo. Em relação à Cp secretada no meio de crescimento, esta abordagem foi limitada porque a abundância de sCp em ambos os meios condicionados HepG2 e hBMVEC estava no limite inferior de sensibilidade deste ensaio ou abaixo dele (Fig. S3). No entanto, permitiu a avaliação da abundância de GPI-Cp. Neste método, as células foram tratadas com fosfolipase C específica para fosfatidilinositol (PI-PLC), que cliva a âncora GPI; o meio assim condicionado foi concentrado e analisado por Cp-ELISA. Embora esta abordagem tenha demonstrado que o PBT434 aumentou a quantidade de GPI-Cp nas células HepG2, novamente falhou em detectar qualquer Cp liberado pelo PI-PLC (Fig. 8B). O ELISA também forneceu um método direto para a quantificação da ferritina. Para fazer isso, hBMVEC foram carregados com 1 uM Fe-citrato por 24h, seguido de tratamento na ausência ou presença de PBT434 por mais 1 h. Os lisados celulares resultantes foram submetidos à análise ELISA para ferritina (Fig. 8C). Em contraste com o aumento de TfR, o tratamento com PBT434 derrubou a proteína ferritina (Ft) em aproximadamente 18%. De fato, essa perda de proteína Ft foi aparente após apenas 1h de tratamento com o reagente. A natureza temporal deste resultado pode ser correlacionada com o aumento de Fe2 positivo observado acima após um tratamento de 30 min com PBT434. Conforme discutido posteriormente, o knockdown da ferritina foi demonstrado após o tratamento com outros agentes quelantes Fe2 permeáveis às células [48].
4. 55Fé2 maisa absorção é inibida pela complexação com PBT434
Dado o rápido equilíbrio de PBT434 em hBMVEC dentro de 30 min, em comparação com a absorção lenta e bifásica e equilíbrio de Fe2 plus ao longo de 24h [49], hipotetizamos que PBT434 e Fe2 plus não compartilham o mesmo mecanismo de captação. Para testar isso, as monocamadas foram incubadas com 55Fe2 plus radiomarcado na ausência ou presença de PBT434 ou PBT434-met, e a captação de 55Fe2 plus durante 3 h foi monitorada (Fig. 9A). O PBT434 diminuiu significativamente a taxa de absorção de 55Fe2 plus, bem como diminuiu o acúmulo geral de 55Fe2 plus em lisados celulares (Fig. 9C). Este efeito não foi observado com o PBT434-atendido. A comparação das taxas de absorção de PBT434 com 55Fe indica que PBT434 e Fe2 plus são absorvidos por vias de transporte separadas. Além disso, a inibição da captação de 55Fe na presença de PBT434, mas não de PBT434-met, sugere que um complexo de ferro PBT434-extracelular não é um ligante para os transportadores de ferro ferroso em hBMVEC, ou seja, ZIP8, e CEP14.
Suplementos Cistanche
Para examinar melhor o papel do PBT434 no acúmulo de ferro, testamos o efeito de sua pré-exposição na captação de 55Fe2 plus. Células pré-tratadas com PBT434 que foram, após lavagem, expostas a 55Fe2 plus apresentaram um aumento na taxa de captação e acúmulo de 55Fe2 plus após 3h (Fig. 9, painéis B e D). Esse acúmulo aumentado foi mantido por pelo menos 24h. Esses dados sugerem que a pré-exposição das células ao PBT434 potencializa transitoriamente a absorção de ferro. Inesperadamente, o pré-tratamento com PBT434-também mostrou um aumento tanto na absorção quanto no acúmulo (Fig 9B), mas esse efeito não foi tão significativo ou persistente quanto o mostrado por PBT434.
Mostramos que a absorção de ferro da 59Fe-transferrina é suportada pela ferri-redução e ferro-permeação na membrana plasmática de têm [50, 51]. Um resultado experimental em apoio a este modelo de absorção de ferro TBI foi o knockdown desta absorção pela inibição da atividade da ferrirredutase extra-citoplasmática; outro resultado foi uma inibição de 60% da absorção de ferro TBI pela ferrozina, um forte agente quelante de ferro ferroso [50]. Esta última estratégia foi utilizada para demonstrar que o PBT434, mas não o PBT434-encontrado, também inibiu a absorção de ferro por TBI (Fig. 10).
5. PBT434 estimula 55Fe2 dependente de Fpn mais efluxo
PBT434 tem aproximadamente 20 por cento da capacidade de deferiprona para produzir uma estimulação aparente de Fe2 mais efluxo de células neuronais [30]. Avaliamos o efluxo de 55Fe2 plus de hBMVEC na ausência ou presença de PBT434 em células controle ou células tratadas com uma mini-hepcidina, PR73. A hepcidina é um hormônio peptídico encontrado sistemicamente e no interstício cerebral que se liga a Fpn e direciona o transportador para degradação. Os efeitos da hepcidina na função de exportação de ferro da Fpn foram extensivamente estudados [52-54]. Anteriormente, mostramos que o efluxo de Fe2 plus de hBMVEC é dependente de Fpn [35, 49]. PR73 tem um EC50 de ~4 nM para degradação de Fpn em um ensaio de repórter GFP [55]. hBMVEC em monocamadas foram carregadas com 55Fe2 plus por 24 h na ausência ou presença de PR73. O efluxo de 55Fe foi então quantificado durante um período de 5 horas na ausência ou presença contínua de PR73 em combinação com a ausência e presença de PBT434 (Fig. 11). Enquanto o PR73 derrubou o efluxo de 55Fe das culturas de controle e tratadas com PBT434-, o PBT434 suprimiu parcialmente a inibição devido à mini-hepcidina. Na ausência de PBT434, o efluxo de ferro das culturas tratadas com PR73-foi reduzido em aproximadamente 75%, enquanto o knockdown nas culturas tratadas com PBT434-foi de apenas ~50% (Fig. 11 e Tabela 2). Duas inferências podem ser feitas a partir desses resultados. Primeiro, o knockdown de Fpn por PR73 regula negativamente o efluxo de 55Fe na presença e na ausência de PBT434. Em segundo lugar, sob qualquer condição, o PBT434 suporta uma estimulação significativa, embora pequena, do efluxo de ferro.
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Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman
Departamento de Bioquímica, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, State University of New York at Buffalo, Buffalo, NY, Estados Unidos da América
