PARTE Ⅰ: A administração da cepa simbiótica Lactobacillus Bulgaricus 6c3, inulina e frutooligossacarídeo diminui as concentrações de sulfato de indoxil e danos renais
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Alonso Jerez-Morales, José S. Merino, Sindy T. Diaz-Castillo & et al.
1. Introdução
Doença renal crônica(DRC) é considerada uma alteração permanente dorimestrutura, sua função ou, nos casos mais graves, ambas. A DRC afeta diretamente a saúde e a qualidade de vida do indivíduo [1,2]. No nível fisiológico, a DRC causou alterações frequentemente observadas como aumento dos níveis séricos de creatinina, cistatina e nitrogênio coruréico [2]. A vigilância intensificada e a conscientização da população aumentaram os diagnósticos de DRC chegando, por exemplo, a determinar que 15% da população dos EUA é afetada por essa patologia [3]. A progressão da doença, bem como os efeitos dos metabolitos supracitados, têm um grave impacto em múltiplos sistemas do organismo, incluindo o cardiovascular e o sistema gastrointestinal, estando a presença destes metabolitos associada a um aumento da mortalidade nos primeiros. e afetando a assimilação, motilidade e permeabilidade neste último [4,5]. As alterações gastrointestinais provocam um aumento da absorção de metabólitos no intestino contribuindo para sustentar uma inflamação sistêmica que, por sua vez, afeta a composição da microbiota normal e suas funções metabólicas, podendo causar disbiose intestinal [6].
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A associação entre DRC e disbiose intestinal pode não ser explicada apenas por mudanças na dieta, mas também pelo aumento do pH luminal, secundário ao aumento da concentração de amônio [7]. Pacientes com DRC em estágio final apresentam diferenças marcantes na abundância de vários táxons bacterianos em suas fezes quando comparados a indivíduos saudáveis [8]. Particularmente, ao nível do gênero bacteriano, os pacientes com DRC apresentam um aumento de Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto), Escherichia, Shigella e Allobaculum e uma diminuição de Akkermansia, Bifidobacterium, Clostridium IV, Lactobacillus, Lactococcus , Leuconostoc, Alkaliphilus e Pseudomonas [9-11]. Seja pela má depuração renal ou pela disbiose intestinal, há uma diminuição de gêneros bacterianos capazes de metabolizar e inibir patógenos que produzem metabólitos tóxicos, resultando no seu aumento [12]. Wong et ai. [8] demonstraram que pacientes com DRC avançada apresentaram aumento de grupos bacterianos que possuem enzimas como urease, uricase e aquelas produtoras de p-cresol e indol.
O acúmulo de metabólitos de retenção urêmica (URMs) no sangue, incluindosulfato de indoxil(IS), sulfato de p-cresil (pCS), trietilamina e N-óxido de trimetilamina (TMAO)[5] são postulados como aceleradores da DRC [13]. É(Sulfato de indoxil), o indol urêmico mais conhecido, é secretado pelos túbulos contorcidos proximais dorime origina-se do metabolismo do triptofano pela triptofanase bacteriana. A evidência de modelos animais mostra que IS(Sulfato de indoxil)pode afetar a função renal e pode danificar células dos túbulos gerando estresse oxidativo nas células endoteliais, inibindo mecanismos de reparo e favorecendo a fibrose tubular intersticial, pois aumenta a expressão gênica de TGF-1, inibidor tecidual de metaloproteinases (TIMP -1) e de colágeno [14]. No entanto, o desequilíbrio da microbiota intestinal e a produção concomitante de metabólitos tóxicos podem ser modificados. Tem sido descrito que a suplementação com certos probióticos e prebióticos pode reduzir a produção de certas toxinas urêmicas e restaurar a microbiota normal [5]. Por exemplo, estudos de meta-análise concluíram que pacientes com DRC que receberam suplementação com cepas probióticas aumentaram suas citocinas anti-inflamatórias e diminuíram seus níveis de toxinas urêmicas [15,16]. Alguns estudos relataram que a administração de simbióticos, uma combinação de probióticos e prebióticos, é capaz de diminuir a progressão da DRC com resultados favoráveis [12]. sua capacidade de diminuir a progressão da DRC [17] e reduzir URMs, como pCS e IS(Sulfato de indoxil)[18]. Panza et ai. (2017) administraram os probióticos L.acidophlilus e Bifidobacterium longum mais frutooligossacarídeos (FOS) em pacientes com DRC em estágio 2-5 e relataram que pacientes não tratados tinham significativamente mais pCS e são(Sulfato de indoxil)no sangue do que os pacientes que receberam o tratamento simbiótico [19]. Neste trabalho, primeiro avaliamos a capacidade de cepas probióticas de reduzir IS(Sulfato de indoxil)in vitro para selecionar o mais promissor. Em seguida, esta cepa foi combinada com os prebióticos inulina e frutooligossacarídeos (FOS) para obter um suposto simbiótico. Esses prebióticos foram selecionados porque mostraram que podem diminuir pCS e IS(Sulfato de indoxil)concentração no sangue [17,18]. Por fim, a eficiência do suposto simbiótico foi testada in vivo, avaliando o IS sanguíneo(Sulfato de indoxil)e níveis de creatinina erime danos cardíacos usando um modelo de rato (ratos Sprague-Dawley), incluindorimanimais deficientes (nefrectomizados) e não tratados.
2. Resultados
2.1. Isolamento de Cepas Capazes de Reduzir IS(Sulfato de indoxil)Em vitro
De 36 amostras de laticínios, 84 cepas foram isoladas em ágar MRS suplementado com azul de bromofenol (MRS-BFB), utilizado como meio diferencial. Este meio permite diferenciar as bactérias do ácido lático. Em pH 3 as colônias serão coloridas de amarelo e em pH próximo a 5 elas serão coloridas de azul [19]. Todas as 84 cepas isoladas foram testadas in vitro para determinar sua capacidade de mediar a redução de IS(Sulfato de indoxil). Para isso, as cepas foram cultivadas em caldo MRS suplementado com 2,8 mM IS(Sulfato de indoxil)por 48 h, e então IS(Sulfato de indoxil)foi medido por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). As cepas lc2, 6c3 e VIc2 foram capazes de reduzir significativamente (p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(Sulfato de indoxil)avaliar se atuaram sinergicamente para reduzir o SI(Sulfato de indoxil). Quando todas as três cepas foram cultivadas juntas na presença de IS(Sulfato de indoxil), a concentração de IS(Sulfato de indoxil)também foi significativamente reduzido, mas inferior ao alcançado pelas cepas isoladas, descartando a possibilidade de atividade sinérgica (Tabela 1).
Tabela 1.Diminuição in vitro, sesulfato de indoxil(IS), é avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), mediada por cepas bacterianas.
2.2. Identificação das Cepas Selecionadas
As três cepas selecionadas devido à sua capacidade de reduzir IS(Sulfato de indoxil)foram identificados por sequenciamento do rRNA 16S após amplificação do DNA por PCR. A cepa 1c2 foi um coco formador de cadeia Gram-positiva que, na análise molecular, amplificou com os iniciadores LacZ para Streptococcus thermophilus. As cepas 6c3 e VIc2 foram bacilos Gram-positivos e amplificadas com primers LbG para identificar o gênero Lactobacillus. A análise do sequenciamento de 16SrRNA permitiu identificar a cepa lc2 como Streptococcus thermophilus (97,3 por cento de similaridade; Número de Acesso: AY188354.1), a cepa 6c3 como Lactobacillus bulgaricus (99,7 por cento de similaridade; Número de Acesso: CR954253) e a cepa VIc2 como Lactobacillus acidophilus ( 99,5 por cento de similaridade; Número de Acesso: AY773947.1). Apenas uma das três cepas foi selecionada para preparar o simbiótico e realizar os seguintes ensaios. A cepa Streptococcus thermophilus 1c2 foi descartada por apresentar baixa taxa de crescimento. Das duas cepas restantes, a cepa Lactobacillus bul-garicus 6c3 foi selecionada por apresentar melhor funcionalidade probiótica e características de segurança do que a cepa Lactobacillus acidophilus VIIc2.
2.3. Efeito do simbiótico na creatinina sanguínea e IS(Sulfato de indoxil)Níveis
O probiótico L. bulgaricus 6c3 foi liofilizado em associação com os prebióticos Inulina e FOS, sendo a concentração do probiótico 10 graus UFC/g de produto liofilizado. Dez gramas de simbiótico foram administrados diariamente, na água de beber, ao grupo de ratos Sprague-Dawley (Lac) tratados com simbiótico nefrectomizado. O grupo não nefrectomia não tratado (Nef) e o grupo controle não nefrectomia não receberam o simbiótico. Creatinina sérica e IS(Sulfato de indoxil)os níveis dos ratos foram medidos por HPLC no início (uma semana após a nefrectomia) e no final do ensaio. Além disso, foram registrados os hematócritos dos animais de todos os grupos. A variação dos níveis de creatinina sérica ao final do ensaio foi significativamente diferente (p<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(Sulfato de indoxil)os níveis aumentaram significativamente apenas no grupo Nef correspondente aos animais nefrectomizados (deficiência renal) que não receberam o simbiótico (38,8 por cento )(p<0.05).>(Sulfato de indoxil)os níveis mostraram um aumento não significativo de 0,5 por cento no grupo de controle e uma diminuição não significativa de 0,8 por cento no grupo Lac (Figura 2). Quando comparados os grupos de animais nefrectomizados, o grupo que não consumiu o simbiótico (Nef) apresentou um nível significativamente maior de IS(Sulfato de indoxil)em comparação com o grupo que consumiu o simbiótico (Lac). Não houve diferença significativa entre o grupo Lac e o grupo controle. A análise dos dados em busca de uma possível correlação entre creatinina e IS(Sulfato de indoxil)níveis mostraram que essa correlação não estava presente (Materiais Suplementares: Figuras S1-S3). Por fim, os resultados dos hematócritos não mostraram diferenças significativas entre os três grupos (Figura 3).
figura 1. (a) Níveis de creatinina sérica de ratos Sprague-Dawley no início e no final das 16 semanas de administração do simbiótico. (b) Diferenças das médias das concentrações finais de creatinina com intervalos de confiança simultâneos de 95 por cento de Tukey (se um intervalo não contém zero, as médias correspondentes são significativamente diferentes). Nef: ratos nefrectomizados que não receberam o simbiótico, Lac: ratos nefrectomizados que receberam o simbiótico, Controle: ratos sham-nefrectomizados.
Figura 2.(a) Sorosulfato de indoxil(IS) níveis de ratos Sprague-Dawley no início e no final das 16 semanas de administração do simbiótico. (b) Diferenças das médias para IS final(Sulfato de indoxil)concentrações com 95 por cento de intervalos de confiança simultâneos de Tukey (se um intervalo não contém zero, as médias correspondentes são significativamente diferentes). Nef: ratos nefrectomizados que não receberam o simbiótico, Lac: ratos nefrectomizados que receberam o simbiótico, Controle: ratos nefrectomizados simulados.
2.4. A análise histológica mostrou que a administração do simbiótico diminuiu a progressão da DRC
Ao final do experimento, os ratos foram eutanasiados para obtenção de amostras do lado esquerdo.rinse corações a serem processados para análise histológica. A área fibrótica foi determinada pela coloração tricrômica de Masson (MT) usando a ferramenta informática Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, EUA) para calcular a porcentagem de área danificada (ou seja, fibrótica) (Tabela 2) e por microscopia de excitação de dois fótons, método que detecta colágeno pela emissão de dois fótons, fazendo com que o colágeno gere um segundo harmônico, que pode ser visualizado por microscopia confocal obtendo uma imagem específica próxima à organização e distribuição de colágeno no interior do tecido. Ao comparar as áreas fibróticas dos rins, avaliadas pela coloração MT, foi possível observar que as áreas fibróticas foram 25% maiores no grupo Nef mas apenas 12% maiores no grupo Lac, administrado o snbiotic quando comparado ao sham- animais controle nefrectomizados. As lesões observadas com esta coloração foram localizadas na camada parietal da cápsula de Bowman e na membrana basal dos túbulos contorcidos proximal e distal dos animais dos grupos Nef e Lac. No caso do grupo Nef, incluindo os animais que não receberam o simbiótico, observou-se perda de citoplasma das células dos túbulos contorcidos com concomitante desenvolvimento de tecido fibrótico. Quando os tecidos dos rins foram analisados por microscopia de excitação de dois fótons, o colágeno foi observado em todas as amostras com conformação tipo malha. Os grupos Nef e Lac apresentaram mais lesões do que o grupo controle, no qual foi encontrada apenas uma área fibrótica (Figura 4). Não foram encontradas lesões nos corpúsculos renais em nenhuma amostra quando observadas sob microscopia de excitação de dois fótons.
Mesa 2.Porcentagem de área fibrótica no tricrômico de Masson coradorimcortes histológicos. Os resultados são expressos como média mais erro padrão.
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| Figura 3.Valores do hematócrito de ratos Sprague-Dawley ao final das 16 semanas de administração do simbiótico. Nef: ratos nefrectomizados que não receberam o simbiótico, Lac: ratos nefrectomizados que receberam o simbiótico, Controle: ratos nefrectomizados simulados. | Figura 4.Cortes histológicos de rins de ratos Sprague-Dawley.(AC): Coloração tricrômica de néfrons de Masson. Áreas fibróticas são observadas em azul (setas).(DF): mesmo tecido observado por microscopia de excitação de dois fótons. O tecido fibrótico é observado em verde. Nef: ratos nefrectomizados que não receberam o simbiótico, Lac: ratos nefrectomizados que receberam o simbiótico, Controle: ratos nefrectomizados simulados. Barra de escala∶ 100 μum para micrografias（AC） e 50 μm para micrografias （DF）. |
2.5. A administração do simbiótico não atenuou a fibrose cardíaca
No coração, a coloração de MT mostrou a presença de áreas fibróticas no tecido de ratos nefrectomizados, enquanto essas áreas estavam ausentes nos animais controle. A indução de DRC em ratos gera fibrose cardíaca que não foi prevenida pela administração do tratamento simbiótico em ratos nefrectomizados (Figura 5).
Figura 5.Coloração de tricrômio (MT) de Masson do coração de ratos Sprague-Dawley. Áreas fibróticas são coradas em azul (setas). Nef: ratos nefrectomizados que não receberam o simbiótico, Lac: ratos nefrectomizados que receberam o simbiótico. Controle: ratos com nefrectomia simulada. Barra de escala 100 um.
