PARTE UM Os glicosídeos de feniletanol protegem a hipertrofia miocárdica induzida pela constrição da aorta abdominal via ECE-1 Inibição da desmetilação e aprimoramento da via PI3K/PKB/eNOS
Mar 06, 2022
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Qiong-Ling Fan,1 Jia-Wei Wang,1 Shi-Lei Zhang et al.
Glicosídeos de feniletanoildo (CPhGs)são a base material central da atividade farmacológica emCistanche tubulosae têm uma variedade de efeitos farmacológicos. No entanto, não está claro se CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche) têm um efeito melhorador na hipertrofia miocárdica induzida por sobrecarga de pressão. Neste estudo, ratos SD machos pesando (200 ± 20) g foram estabelecidos modelos de hipertrofia cardíaca por coarctação da aorta abdominal (CAA). Após a operação, os ratos foram gavaged com o medicamento correspondente por 6 semanas (CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche) 125, 250 e 500 mg/kg/d e valsartan 8,3 mg/kg/d). Ecocardiografia, índice de peso do coração (HWI), área de secção transversal de cardiomiócitos (CSCA), área de fibrose, endotelina plasmática 1(ET-1) e níveis de fatores pró-inflamatórios foram detectados. Nossos resultados mostraram que diferentes CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo) dosagem diminuída espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo (LVPWT), diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (DVE), HWI, CSCA, área de fibrose, ET-1, fatores pró-inflamatórios, peptídeo natriurético arterial (ANP), peptídeo natriurético cerebral (BNP) ), níveis de mRNA da enzima conversora de endotelina 1(ECE-1), ciclooxigenase 2 (COX-2), níveis de proteína da caixa de grupo 1 de alta mobilidade (HMGB-1) e ECE{{8} } nível de desmetilação enquanto aumenta as frações de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF), encurtamento fracional do ventrículo esquerdo (LVFS), fosfatidilinositol fosforilado 3- quinase (p-PI3K), proteína quinase B fosforilada (p-PKB) e óxido nítrico endotelial fosforilado sintetase (p-eNOS). -e índices de CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche) O grupo 250 e 500 mg/kg foi significativamente diferente do grupo AAC; comparado com o grupo valsartan (AV), os índices do grupo CPhGs 500 mg/kg não foram significativamente diferentes. Em conclusão, os CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche) melhorou a hipertrofia miocárdica de ratos por AAC, o que pode estar relacionado à inibição da desmetilação de ECE- 1 e aumento de PI3K/PKB/eNOS.
2. Materiais e métodos
2.1. Animais.
70 ratos machos SPF SD pesando 200 ± 20 g (10 por grupo) foram fornecidos pelo Experimental Animal Center da Xinjiang Medical University (Urumqi, China). O número da licença de produção animal era SYXK(XIN)2016-0003 e o número do certificado era SCXK(XIN)2016-002. -e estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Xinjiang (número de aprovação 20180223-183). - eles foram mantidos com livre acesso à água e comida em gaiolas plásticas e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h a uma temperatura de 22 ± 2 graus e umidade de 45-55 por cento em nosso Centro Animal Experimental.
2.2. Materiais.
CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche) , cujo teor de equinácea foi superior a 40 por cento e acteosídeo foi superior a 16 por cento, foi adquirido de Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartan foi adquirido de Pequim Novartis Pharma Co., Ltd. Carboximetilcelulose sódica (CMC-Na) foi fornecido por Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd. E CPhGs foram dissolvidos em 0,5 por cento de CMC-Na.
Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche
2.3. Coarctação da Aorta Abdominal (CAA).
Após anestesia com pentobarbital sódico a 2,5 por cento (2,5 ml/kg) (Merck, Darmstadt City, Hessen, Alemanha), os ratos foram barbeados e mantidos aquecidos em almofadas de aquecimento. -en a cavidade abdominal do rato foi aberta por 2 cm no meio do abdômen em um ambiente estéril, as vísceras abdominais foram empurradas para o lado direito e a aorta abdominal foi totalmente exposta em 0,5 cm acima da artéria renal direita. A agulha número 8 foi ligada com fio número 2 em paralelo à cavidade abdominal sendo suturada [18]. As aortas abdominais dos ratos do grupo sham foram separadas sem ligadura e não houve grupo controle para a cirurgia. -e dia após a operação, AC 125 mg/kg, AC 250 mg/kg e AC 500 mg/kg foram alimentados com CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche)por gavagem; O grupo AV foi alimentado com valsartana por gavagem; e grupo controle, grupo AAC e grupo sham não foram alimentados com CPhGs ou valsartan, uma vez ao dia por 42 dias consecutivos. A dose da droga foi estabelecida com base em referências anteriores e experimentos preliminares [8].
2.4. Ecocardiografia.
Seis semanas após a AAC, os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico a 2,5 por cento e realizado o ecocardiograma (Philips HD11 XE, Amsterdam, Holanda). LVPWT, LVED, LVEF e LVFS foram medidos quatro vezes para calcular as médias como indicadores finais.
2.5. Índice de Peso Cardíaco (HWI).
Após a ecocardiografia, os ratos foram executados através da coleta de sangue da aorta abdominal. -Os corações dos ratos foram retirados do tórax e pesados após serem lavados com solução salina normal (4 graus) 3 vezes e drenados com papel filtro limpo. -e HWI foi calculado através da seguinte fórmula: HWI � peso do coração peso corporal. (1)
2.6. Coloração de Hematoxilina-Eosina e Masson.
-e miocárdio do ventrículo esquerdo foi fixado por paraformaldeído a 4 por cento embebido em parafina, corte transversal com espessura de corte de 4 μm, seco em estufa a 60 graus por 2 horas, e então corado com hematoxilina-eosina ou Masson (Solaibio, Beijing, China). -e estrutura do miocárdio foi observada com um microscópio de contraste de fase invertido (Leica, Frankfurt, Alemanha). O software Image J foi usado para calcular o CSAC e a área de fibrose.
2.7. Ensaio de Sorvente Imune Ligado a Enzima (ELISA).
O sangue da aorta abdominal foi extraído de ratos e colocado em um tubo de anticoagulação por 2 h em temperatura ambiente e depois centrifugado na velocidade de 3000 r/min. -e sobrenadante foi absorvido com pipetas (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e armazenado a 80 graus para teste. Plasma ET-1, interleucina 1 (IL-1 ), interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral Medicina complementar e alternativa baseada em evidências
(TNF-) (Bioss, Pequim, China) e ciclooxigenase 1 (COX-1) (Cusabio, Wuhan, China) níveis de ratos foram detectados de acordo com as instruções do kit ELISA.
2.8. PCR específico para metilação.
O DNA foi extraído do tecido miocárdico do ventrículo esquerdo de ratos por kit de extração de DNA (Tiangen Biotech, Pequim, China). -e valor de absorção (valor A) foi igual a OD260/OD280 (1,8∼1,9). 20 ul DNA genômico (500 pg-1 ug) foi modificado com ácido sulfuroso por Methylation-Gold Kit (ZYMO, Orange County, CA, EUA). -e sistema de reação MSP foi de 25 μL, incluindo 3,0 μL de molde de DNA modificado por sulfito, 2,5 μL de 10 × tampão, 2,5 μL de 2,5 mm dNTPs, 1,0 μL de primer de 10 μm, 0,1 μL de Hotstar Taq DNA polimerase (TAKARA Biotechnology) , e 14,9 μL de ddH2O. -foram 45 ciclos no total: desnaturação a 95 graus, anelamento a 55 graus e extensão a 72 graus por 30 s. Após a PCR, 5 μL do produto foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2%. -e DNA foi tratado por M. Sssl metiltransferase (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) foi usado como controle positivo de metilação, e o DNA do grupo controle normal foi usado como controle positivo de desmetilação. Finalmente, o gel de agarose foi fotografado e analisado por um sistema de imagem em gel Bio-Rad. -e o nível de desmetilação foi calculado através da seguinte fórmula:
Todos os primers projetados em Methprimer (Applied Biosystems, MA, EUA) e sintetizados pela Sangon Biotech (Shanghai, China) estão listados na Tabela 1.
2.10. Mancha Ocidental.
As proteínas foram extraídas do miocárdio ventricular esquerdo com Ripa Buffffer (Scientific) e foi adicionado inibidor de protease. A concentração de proteína foi determinada pelo método BCA (Solarbio, Pequim, China). As proteínas foram tomadas a 50 ug e desnaturadas a 100 graus C por 5 minutos. As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE, Beyotime, Xangai, China) e então transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por equipamento eletroforético (Bio-Rad, CA, EUA). Após serem bloqueadas com 3% de BSA por 2 horas à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas com anticorpo anti-PI3K, anticorpo antifosfo-PI3K, anticorpo antieNOS, anti-fosfo-eNOS (1:1000, Bioss, Pequim, China), anticorpo anti-COX-2, anticorpo anti-HMGB-1 (1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, EUA) e anticorpo anti-ECE-1 (1: 2000, Anticorpo Signalway , College Park, MD, EUA), anticorpos primários durante a noite a 4 graus. No dia seguinte, após serem lavadas com TBST 3 vezes, as membranas foram incubadas com IgG de cabra anti-coelho marcada com HRP (1: 25000, 1 h, Zhongshanjinqiao, Xangai, China) à temperatura ambiente. Após serem lavadas com TBST 3 vezes, as membranas foram visualizadas por Pierce™ ECL Western Blotting Substrate e fotografadas usando FluorChem E Imaging System (Protein Simple, EUA), que foram normalizadas para -actina como um controle interno.
O benefício dos glicosídeos de feniletanoildo de cistanche
benefício cistache
3. Resultados
3.1. CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche) Função cardíaca melhorada em ratos após AAC.
-e ratos receberam gavagem a partir do dia seguinte à CAA. -o grupo controle positivo (AV) recebeu gavagem com valsartan 8,3 mg/kg/d, e o grupo CPhGs (AC) recebeu gavage com CPhGs 125, 250 e 500 mg/kg/d, respectivamente. Após seis semanas de dosagem contínua, os ratos realizaram ecocardiografia sob anestesia com pentobarbital sódico a 2,5 por cento. Dois ratos morreram após AAC: um no grupo modelo morreu no terceiro dia após AAC de edema pulmonar; outro em AC 500 mg/kg faleceu no dia seguinte à cirurgia com suspeita de estresse cirúrgico. Conforme mostrado na Figura 2, em comparação com o grupo simulado, LVED, LVEF e LVFS no grupo AAC diminuíram significativamente, mas LVPWT no grupo AAC aumentou significativamente. Comparado com o grupo AAC, LVED, LVEF e LVFS foram aumentados e LVPWT foi diminuído em graus variados em cada grupo de dose AC; para LVPWT, uma mudança significativa não foi encontrada no grupo AC 125 mg/kg, mas foi encontrada nos grupos AC 250 e 500 mg/kg. Comparado com o grupo AV, o LVPWT e LVED no grupo AC 125 mg/kg foram observados uma diferença significativa, enquanto LVPWT, LVED, LVFS e LVFS nos grupos AC 250 e 500 mg/kg não foram.
3.2. CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche) Diminuição da área de HWI, CSAC e fibrose em ratos após AAC.
-en pesamos o coração de cada rato para calcular o HWI e pegamos o tecido miocárdico para coloração de HE e Masson para observar as alterações da área de secção transversal (CSAC) e área de fibrose nos cardiomiócitos. Conforme mostrado nas Figuras 3(a), 3(d) e 3(e), em comparação com o grupo sham, o peso do coração (HW) e HWI no grupo AAC foram reduzidos significativamente; em comparação com o grupo AAC, HW e HWI nos grupos AC250 e 500 mg/kg foram reduzidos significativamente; em comparação com o grupo AV, HW e HWI aumentaram significativamente no grupo AC 125 mg/kg, mas não nos grupos AC 250 e 500 mg/kg. Nas Figuras 3(b) e 3(f ), em comparação com o grupo sham, os resultados da coloração de Masson mostraram que a área de fibrose no grupo AAC aumentou significativamente. Para a área de fibrose, houve diminuição significativa nos grupos AC 125, 250 e 500 mg/kg em relação ao grupo AAC, enquanto aumento significativo nos grupos AC 125 e 250 mg/kg e diminuição significativa nos grupos AC 500 mg/kg. kg foram encontrados quando comparados ao grupo AV. Nas Figuras 3(c) e 3(g), os resultados da coloração HE mostraram que CSAC no grupo AAC aumentou significativamente em comparação com o grupo sham; comparado com o grupo AAC, o CSAC nos grupos AC 250 e 500 mg/kg foi reduzido significativamente; em comparação com o grupo AV, no entanto, a CSAC aumentou significativamente nos grupos AC 125 e 250 mg/kg, e nenhuma diferença significativa foi encontrada no grupo AC 500 mg/kg
3.3. CPhGs(Glicosídeos de feniletanoildo de cistanche) Níveis reduzidos de mRNA de genes de hipertrofia miocárdica em tecido miocárdico de ratos após AAC.
ANP, BNP e cadeia pesada de miosina (-MHC) são importantes fatores de hipertrofia cardíaca [19, 20]. Detectamos os níveis de expressão relativa desses três genes de hipertrofia cardíaca nos tecidos miocárdicos. Conforme mostrado na Figura 4, em comparação com o grupo simulado, os níveis de expressão relativa de mRNA de ANP, BNP e -MHC no grupo AAC aumentaram significativamente; no entanto, em comparação com o grupo AAC, os níveis de expressão relativa dos três genes de hipertrofia miocárdica em AC 250 Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 5.
