PARTE UM Echinacoside aumenta a quantidade de esperma em ratos ao direcionar o receptor de andrógeno hipotalâmico

Como o echinacoside estimula o estrogênio e aumenta a contagem de espermatozoides?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

A infertilidade masculina é um importante problema de saúde com uma prevalência estimada de 4,2% da infertilidade masculina em todo o mundo. Nosso trabalho inicial demonstrou que os extratos de Cistanche protegem contra danos ao esperma em camundongos e queechinacoside(ECH) é um dos principais componentes ativos. Aqui relatamos um papel essencial paraECH, um produto natural que reverte ou protege contra oligo como a aspermia em ratos.ECHfoi ensaiada por HPLC, a quantidade e a qualidade dos espermatozóides foram avaliadas e os níveis hormonais foram determinados por radioimunoensaio sorvente. A ECH reduziu os níveis de receptor androgênico (AR) e a chavegenes relacionados a esteroidogênicos conforme determinado por Western blot e análise de qPCR. A interação entreECHe AR foi avaliada por ELISA indireto e docking molecular. Os resultados mostram que ECH combinado com AR hipotalâmico no bolso de Met-894 e Val-713 inibe a transferência de AR dedo citoplasma para os núcleos do hipotálamo. Enquanto o feedback negativo da regulação dos hormônios sexuais foi inibido, o feedback positivo foi estimulado para aumentar a secreção do hormônio luteinizante e da testosterona, posteriormente aumentando a quantidade de espermatozoides. Juntos, esses dados demonstramesteECHbloqueia a atividade do AR no hipotálamo para aumentar a quantidade de espermatozoides e proteger contra a oligo aspermia em ratos.

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A produção de testosterona nas células testiculares é fortemente regulada pelo eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG) formando uma alça de retroalimentação homeostática1. O hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), secretado pelo hipotálamo, pode estimular a secreção do hormônio luteinizante (LH) da glândula pituitária, o que estimula ainda mais a produção de testosterona nas células testiculares de Leydig. A testosterona é biossintetizada por uma série de enzimas esteroidogênicas. Como uma das principais vias, a proteína reguladora aguda esteroidogênica (StAR) pode transportar colesterol de fontes intracelulares para a mitocôndria2, onde é exposto à enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol (CYP11A1), 3 -hidroxiesteróide desidrogenase (HSD3), { {10}}hidroxilase (CYP17A1) e 17 hidroxiesteróide desidrogenase (HSD 17 ) que catalisam a conversão do colesterol em testosterona3,4. A testosterona então retroalimenta negativamente o elemento HPG para regular negativamente a secreção de LH de maneira dose-dependente.

O efeito da testosterona na alça de retroalimentação do eixo HPG ocorre pela ligação ao receptor androgênico (AR), encontrado tanto no hipotálamo quanto na hipófise5. Nos camundongos, a ablação do RA e a produção mínima de testosterona fazem com que os níveis de LH e hormônio folículo-estimulante (FSH) aumentem6, sugerindo que o RA participa da regulação da alça de alimentação negativa. O mecanismo genômico clássico de sinalização da testosterona ocorre quando a testosterona se difunde na célula e se liga ao AR. Esse complexo ligante-receptor então se transloca para o núcleo, onde se liga aos elementos de resposta androgênica (AREs) nas regiões reguladoras dos genes responsivos à testosterona para modificar sua translocação. A testosterona também induz a via não clássica de ação do hormônio esteroide, caracterizada por eventos rápidos que levam à ativação de cascatas de sinalização citosólica normalmente desencadeadas por fatores de crescimento7,8. As vias clássicas e não clássicas da testosterona contribuem para manter a espermatogênese e a fertilidade. No entanto, a função do AR é mais importante na via clássica, pois a testosterona atua para aumentar a qualidade do esperma.

Echinacoside(ECH) é um dos componentes bioativos derivados das espécies de plantas medicinais Echinacea9 e Cistanche10. Com um amplo espectro de atividades farmacológicas, os extratos de Echinacea são um dos suplementos fitoterápicos mais populares na Europa e nos EUA, principalmente devido às suas propriedades antioxidantes11 e sua capacidade de prevenir o resfriado comum12. Interessantemente,Cistancheextratos eECHtêm sido tradicionalmente usados ​​como agente tônico para curar disfunções reprodutivas e aumentar a atividade sexual masculina na medicina tradicional chinesa10. Alguns produtos OTC da extração de Cistanche foram desenvolvidos como suplementos nutritivos e estão ganhando popularidade nos mercados de alimentos saudáveis ​​da China e alguns outros países asiáticos (China Food and Drug Administration)13. No entanto, os mecanismos subjacentes daECHação permanecem obscuras. A infertilidade masculina é um importante problema de saúde com uma prevalência estimada de 4,2% da infertilidade masculina em todo o mundo14. O diagnóstico da infertilidade masculina atualmente é baseado no estudo da qualidade espermática incluindo a análise de parâmetros seminais como concentração, motilidade e morfologia espermática15. O bisfenol A (BPA) que imita o estrogênio é um contaminante ambiental amplamente difundido que tem sido estudado por seu impacto na fertilidade masculina em várias espécies de animais e humanos16. O BPA interrompe o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, inibe a expressão de enzimas esteroidogênicas testiculares e a síntese de testosterona nos filhotes machos17, causando um estado de hipogonadismo hipogonadotrófico18. Neste estudo, investigamos os efeitos deECHsobre a qualidade do esperma e os níveis hormonais. Além disso, o BPA foi escolhido como agente modelo de lesão espermática para estudar ainda mais o efeito protetor doECHcontra a má qualidade do esperma.

Resultados ECH aumenta a quantidade de esperma. Os números de espermatozóides na cauda do epidídimo, viabilidade espermática e motilidade espermática são apresentados na Tabela 1. O tratamento com 80mg/kg de ECH e 15mg/kg de propionato de testosterona (TP) aumentou significativamente a contagem de espermatozóides do epidídimo. No entanto, não houve diferença significativa na viabilidade espermática e na motilidade espermática.

A ECH aumenta os níveis de testosterona e LH no soro, encéfalo, hipófise e testículos. O tratamento com ECH aumentou notavelmente os níveis de LH no soro, encéfalo mais hipófise e testículos (Fig. 1A). No grupo ECH(H), os níveis de LH aumentaram significativamente em 1.1-vez no soro, 1.4-vez no encéfalo mais hipófise e 1.2-vez no testículo. A testosterona foi significativamente aumentada em 1,5 e 1.{10}}vez no encéfalo mais hipófise e testículo, respectivamente, mas não no soro após o tratamento com ECH(H). Após o tratamento com TP, os níveis de testosterona aumentaram significativamente em 1,6, 1,8 e 1,{16}}vez no soro, encéfalo mais hipófise e testículo.

ECH increased steroidogenic enzyme gene expression. ECH significantly increased the expressions of key steroidogenic enzymes in the testis (Fig. 1B). The mRNA levels of CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2, and HSD17β in the ECH(H) group were increased more than 3-fold, while the levels of StAR mRNA showed no significant differences with all ECH treatments (p>0.05). TP não alterou significativamente a expressão de CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 e HSD17. Isso se reflete em uma análise abrangente do mapa de calor do efeito da ECH na expressão da enzima esteroidogênica, indicando que a ECH aumentou significativamente os níveis de mRNA de CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 e HSD17, e particularmente HSD3 1/ 2 (Fig. 1C).

A ECH pode atravessar a barreira hematoencefálica e, em menor grau, a barreira hematotesticular. Para avaliar a alça de retroalimentação androgênica no eixo HPG, a capacidade da ECH de entrar no hipotálamo foi avaliada em uma série de estudos farmacocinéticos. As concentrações de ECH foram detectadas no hipotálamo após 12h de administração oral única de 30mg/kg de ECH, e a ECH mostrou penetrância marcada no hipotálamo com a razão hipotálamo/plasma média de 33,92 por cento (Fig. 2A). Os valores de T1/2 foram 2,61±0,42 he 1,88±0,22 h no plasma e no hipotálamo, respectivamente (Fig. 2B). No entanto, o acesso muito limitado de ECH no testículo foi detectado usando HPLC. As concentrações de ECH nos testículos foram 0.083 ug/mL, 0,043 ug/mL e 0,028 ug/mL em 0,5h, 1h e 1,5h, respectivamente, após o tratamento .

A ECH reduz a translocação do AR hipotalâmico para o núcleo. Para testar o efeito da ECH na translocação de AR, a expressão de AR no citoplasma e núcleo do testículo e hipotálamo foi determinada usando análise de Western blot. Conforme mostrado na Fig. 3A, a proteína AR regulada negativamente por ECH nos núcleos hipotalâmicos em cinco vezes em comparação com o grupo controle. O tratamento com enzalutamida, um inibidor de AR, diminuiu os níveis de proteína AR nos núcleos hipotalâmicos em 4.8-vezes. Notavelmente, o AR citoplasmático foi maior com o tratamento com ECH e o tratamento com enzalutamida do que os controles, sugerindo que o ECH bloqueia o transporte de AR do citoplasma para o núcleo no hipotálamo. Como esperado, a ECH não inibe o transporte de AR do citoplasma para o núcleo no testículo (Fig. 3B).

A ECH aumentou as expressões de genes relacionados ao eixo HPG. A ECH aumentou significativamente as expressões de LH , LHR, GnRH 1 e Gnrhr nos pools de mistura de encéfalo mais hipófise, no entanto, não houve diferença significativa nos níveis de GnRH 1 após o tratamento com TP. A análise do mapa de calor mostra que as expressões de GnRH 1 e LH foram mais altas entre os genes relacionados ao eixo HPG.

AR é um alvo de ECH. Para confirmar as relações entre ECH e AR, ECH-Ovalbumina (ECH-OVA) foi sintetizada com sucesso (Fig. 5A, B). O peso molecular de ECH-OVA é maior que OVA, então eles têm diferentes taxas de mobilidade (Fig. 5A), e o pico de absorbância de ECH-OVA está entre ECH e OVA (Fig. 5B),

sugerindo que ECH foi conjugado com sucesso com OVA. Os resultados indiretos de ELISA (Fig. 5C), mostram que o anticorpo anti-AR é capaz de detectar a proteína AR presente em poços contendo ECH-OVA (indicado pelo anticorpo anti-OVA), sugerindo que a ECH pode se ligar à proteína AR. ECH combina com bolso AR de Met-894 e Val-713. O composto ECH foi encaixado no sítio AF2 na superfície do AR humano e o modo de ligação teórico de ECH e AR foi mostrado na Fig. 5D. O composto ECH adotou uma conformação compacta de ligação no bolso do AR humano. Os dois grupos fenil da ECH se ligam ao domínio hidrofóbico da bolsa AR e mantêm contatos hidrofóbicos próximos com os resíduos Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 e Ile-898, enquanto os outros dois lados da ECH foram posicionados na entrada do bolsão e fizeram apenas alguns contatos. A análise detalhada mostrou que tanto Met-894 (comprimento de ligação: 2,4Å) quanto Val-713 (comprimento de ligação: 2,7Å) formaram ligações de hidrogênio com os grupos hidroxi1 da ECH, que foi a principal interação entre ECH e AR humano. A ECH atenua os danos reprodutivos induzidos pelo BPA. Para investigar o efeito da ECH no dano reprodutivo, a qualidade do esperma e os níveis de hormônios sexuais e enzimas esteroidogênicas foram examinados em camundongos induzidos por BPA. Conforme mostrado na Fig. 6, o tratamento com BPA diminuiu significativamente a contagem de espermatozóides e a motilidade dos espermatozóides em 26,5 por cento e 39,2 por cento, respectivamente. A administração de ECH impediu a diminuição na contagem de espermatozoides e na motilidade dos espermatozoides em 35,5% e 30,1%, respectivamente. A administração de BPA também resultou em uma diminuição significativa na secreção de LH e T, e a ECH aumentou consideravelmente os níveis de LH e T em 24,1 por cento e 18,3 por cento, respectivamente, em comparação com o tratamento com BPA sozinho (Fig. 6A, B). Os níveis de mRNA de StAR, CYP17A1, 3 -HSD e 17 -HSD no tratamento com BPA-ECH foram significativamente aumentados em comparação com o tratamento com BPA (Fig. 6C, D).