Parte um DsbA-L interage com VDAC1 na apoptose de células tubulares mediada por mitocôndrias e contribui para a progressão da doença renal aguda

Resumo

1. Fundo

demonstramos que a proteína tipo oxidorredutase tipo ponte dissulfeto A (DsbA-L) estava envolvida na progressão da fibrose renal. No entanto, a função precisa de DsbA-L na lesão renal aguda (LRA) e os mecanismos envolvidos ainda não foram elucidados.

2. Métodos

Nós ilustramos o DsbA-L interagindo com VDAC1 por co-IP (co-imunoprecipitação) in vitro e Viv e encontramos as partes de interação deles por experimento de mutação. Os achados acima foram verificados por co-localização deles. Além disso, construímos os dois modelos de camundongos PT-DsbA-L e VDAC1 KO para verificar a função de DsbAL e VDAC1 em modelos de LRA induzida por VAN, CL, P e I/R.

3. Descobertas

Os camundongos PT-DsbA-L-KO mostraram melhora da progressão de LRA induzida por I/R, VAN- e CLP por meio da regulação negativa de VDAC1. Por fim, confirmamos essas alterações nas moléculas de sinal examinando células HK-2 e biópsias renais de pacientes com LRA induzida por nefrite intersticial aguda ou isquêmica (NIA). Mecanicamente, DsbA-L interagiu com os aminoácidos 9-13 e 22-27 de VDAC1 na mitocôndria de células BUMPT para induzir apoptose de células renais e lesão mitocondrial.

4. Interpretação

Este trabalho sugeriu que o DsbA-L, localizado nas células tubulares proximais, impulsiona a progressão da IRA, regulando positivamente os níveis de VDAC1.Running Title: The Role of DsbA-L in AKI.

5. Financiamento

Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, uma concessão do Projeto Chave da inovação científica e tecnológica da província de Hunan, Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Hunan, Projeto de Cooperação e Intercâmbio Internacional, projeto do Departamento de Ciência e Tecnologia de Changsha, Fundação de Ciências Naturais da Província de Hunan, Fundamental Fundos de pesquisa para as Universidades Centrais da Central South University, Hunan Provincial Innovation Foundation Para pós-graduação na China Hunan Provincial Science and Technology Department.

Palavras-chave

DsbA-L; VDAC_I; Bax; Cyt-c; AKI

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Introdução

A lesão renal aguda (LRA), complicação clínica devastadora com altas taxas de morbimortalidade, afeta milhões de pacientes em todo o mundo(1). A LRA geralmente é induzida por sepse, agentes nefrotóxicos e lesão de isquemia-reperfusão (IRI)(2). Até o momento, os mecanismos moleculares subjacentes à IRA ainda não foram totalmente elucidados. Consequentemente, não há estratégias de tratamento eficazes disponíveis para LRA.

A lesão das células tubulares é reconhecida há décadas como um fator importante da LRA.3 Com o avanço da pesquisa, um número crescente de pesquisadores identificou que o dano mitocondrial desempenha um papel fundamental na lesão das células tubulares e que esse dano inicial é causado pelo acúmulo de ROS, produção de citocinas e morte celular (incluindo necrose e apoptose); coletivamente, todos esses processos contribuem para a IRA.4-6 Embora um corpo crescente de pesquisas tenha se concentrado nos mecanismos subjacentes ao dano mitocondrial na IRA,7- 12 o mecanismo preciso responsável pela lesão mitocondrial ainda não foi identificado.

A proteína semelhante à oxidoredutase por ligação dissulfeto A (DsbAL) foi identificada pela primeira vez como uma proteína mitocondrial em células hepáticas de ratos.13 Estudos anteriores demonstraram que a DsbA-L impedia a dieta ou a obesidade induzida por nefropatia diabética (DN), inflamação, resistência à insulina ou lesão renal.14-18 Curiosamente, nosso estudo recente descobriu que DsbA-L mediava a fibrose renal induzida por obstrução ureteral unilateral (UUO). No entanto, o papel e o mecanismo da DsbA-L tubular na LRA ainda são completamente desconhecidos.

No presente estudo, a deleção tubular proximal de DsbA-L (PT-DsbA-L-KO) em um modelo de camundongo resultou na atenuação notável de I/R, juntamente com vancomicina (VAN) - e ligadura e punção cecal (CLP LRA induzida por ). Consistentemente, DsbA-L também mediou a apoptose induzida por I/R, VAN e LPS em células epiteliais tubulares proximais renais (BUMPT) de camundongo. Curiosamente, descobrimos que DsbA-L interagia com as regiões 9-13 e 22 27 do canal 1 de ânions dependente de voltagem (VDAC1), um membro chave da família de proteínas VDAC19 21; esses efeitos foram observados em amostras mitocondriais in vivo e in vitro e em amostras de LRA humana. Além disso, demonstramos que PTVDAC1-KO também melhorou a apoptose de células renais em modelos in vitro e in vivo de LRA. Coletivamente, demonstramos que DsbA-L interagiu com VDAC1 na apoptose de células tubulares mediada por mitocôndrias e, portanto, causou a progressão da LRA.

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Materiais e métodos

1. Declaração de ética

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão do Segundo Hospital de Xiangya, República Popular da China (NO. 2018065) ​​e recrutou 18 pacientes. Todos os participantes antes da inclusão no estudo foram recrutados com consentimento informado por escrito. Todos os experimentos com animais cumpriram os princípios orientadores aprovados pelo Comitê de Ética em Cuidados com Animais do Segundo Hospital de Xiangya, República Popular da China (NO. 2020310).

2. Anticorpos e reagentes

Anti-COXIV (ab33985, RRID: AB_879754), VDAC1 (ab14734, RRID: AB_443084), and PGC-1a (ab191838, RRID: AB_2721267) antibodies were obtained from Abcam (Cambridge Science Park, Cambridge, UK). Anti-Caspase3 (9662, RRID: AB_331439) and cleavedcapase3 (9664, RRID: AB_2070042) antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-Bax (50599-2-Ig, RRID: AB_2061561), Cyt-c (10993-1-AP, RRID: AB_2090467), NRF1 (12482- 1-AP, RRID: AB_2282876), GAPDH (60004-1-Ig, RRID: AB_2107436), and b-tubulin (10094-1-AP, RRID: AB_2210695) antibodies were obtained from Proteintech (Rosemont, IL, USA). The anti-DsbA-L antibody was provided by Dr. Feng Liu(14). All secondary antibodies (MitoTracker Green FM and MitoTracker Red CMXRos) were obtained from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). The calcium ionophore was purchased from Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Antimycin A (>95 por cento puro, ab141904) e um kit de fracionamento de mitocôndria/citosol (ab65320) foram adquiridos da Abcam (Cambridge Science Park, Cambridge, Reino Unido). A sequência alvo para DsbAL de camundongo foi descrita anteriormente.22

3. A criação de modelos AKI por reperfusão isquêmica, CLP e VAN

Camundongos machos C57BL/6J (RRID: MGI:5657312) com idade de 8-10 semanas foram adquiridos da Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (flox/flox) camundongos (fornecidos pelo Dr. Feng Liu) ou VDAC1 (flox/flox) camundongos (obtidos de organismos modelo de Xangai) com camundongos PEPCK-Cre (fornecidos pelo Dr. Volker Haase (Universidade da Pensilvânia, Filadélfia, PA ) conforme descrito anteriormente.22,23 Camundongos machos (8-10 semanas de idade) foram submetidos a isquemia, CLP e LRA nefrotóxica VAN, conforme descrito anteriormente.23 27 Para LRA isquêmica, a artéria renal bilateral foi cortada continuamente para 28 min seguido de reperfusão por 24 h ou 48 h. A temperatura corporal dos camundongos foi mantida em aproximadamente 37 graus . Para LRA induzida por CLP, o ceco foi firmemente ligado em uma posição de 1,5 cm da ponta. Isso foi seguido por uma punção por 18 h. Para lesão de VAN, os camundongos foram injetados por via intraperitoneal com uma dose única de VAN na dose de 600 mg/kg por 7 dias consecutivos, conforme descrito anteriormente.28,29 Além disso, os camundongos C57BL/6 foram injetados com Plasmídeos DsbA-L ou VDAC1, ou siRNA VDAC1 (na dose de 15 mg/kg) via veia caudal duas vezes por semana22; solução salina foi usada como uma injeção de controle. Para cada estudo, analisamos as amostras juntas para evitar viés, com base nos estudos anteriores, e usamos o software PASS para determinar o tamanho da amostra (n=6). Excluímos a amostra que morreu ou falhou no estabelecimento do modelo antes do endpoint. Os camundongos experimentais foram agrupados por uma tabela de números aleatórios. Os investigadores não foram cegados durante o experimento, mas foram cegados durante a alocação, coleta de amostras e análise de dados. Todos os experimentos com animais cumpriram os princípios orientadores aprovados pelo Comitê de Ética de Cuidados com Animais do Segundo Hospital de Xiangya, República Popular da China. Os camundongos foram alojados em um ambiente 12-h de luz/escuro com livre acesso a uma dieta padrão de roedores e água.

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4. Cultura celular e um modelo de isquemia-reperfusão

Células BUMPT obtidas do Dr. Wilfred Lieberthal (Boston University School of Medicine) ou células HK{{0}} obtidas da Shanghai Zhongqiaoxinzhou Biotech foram cultivadas com DMEM (Gibco, 11965092) adicionado de 10 por cento de FBS (Gibco, 10100147) e 1 por cento de Penicilina-Estreptomicina (Gibco, 15140163) a 37 graus em 5 por cento de CO2. Para o modelo de célula isquêmica, as células BUMPTs foram tratadas com 10 mM de antimicina A (um inibidor do complexo mitocondrial III, Abcam, ab141904) e 1,5 mM de ionóforo de cálcio (Sigma, A23187) em Hanks' Balanced Salt Solution (Hyclone, SH30030.02) para 2 h.30 Em seguida, substituímos HBSS por meio DMEM por 0, 2 e 4 h para o estágio de reperfusão. A apoptose celular foi detectada por morfologia e immunoblotting para indicadores apoptóticos, incluindo caspase3 clivada, Bax e Cyt-c. Vários plasmídeos foram criados e transfectados em células por lipofecção: DsbA-L, HA-VDAC1-1-25, HA-VDAC1-26-366, HA-VDAC1-full length, HA- VDAC{{33 }}D9-13,22-27, HAVDAC1-D39-45,55-57 e HA- VDAC1-D9-13, 22-27 D39-45,55-57 e siRNA para DsbA-L e VDAC1. Seis a oito horas após a transfecção, o meio de cultura foi substituído por DMEM. As sequências de DsbA-L siRNA e VDAC1 siRNA para camundongos foram 50 - GCAUGGAGCAACCAGAGAUTT -30 e 50 - CCAGAGCAACTTCGCAGTT -30, respectivamente; as sequências para o siRNA NC embaralhado foram 50 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-30. As sequências de DsbA-L siRNA e VDAC1 siRNA para humanos foram 50 - UCAUUUGCCAUGUAUAGUCCU-30 e 50 -UAUUAAGCCAAAUCCAUAGCC -30, respectivamente; as sequências para o siRNA NC embaralhado foram 50 -AACCACUCAACUUUUUCC CAA -30. O modelo de IR foi então induzido quando a densidade celular atingiu 90 por cento.

5. Citometria de fluxo

A citometria de fluxo foi operada de acordo com as instruções do FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD, 556547). Células BUMPT ou HK-2 com diferentes tratamentos foram coletadas usando tripsina sem EDTA e lavadas três vezes com PBS seguido de FITC por 15min e PI por 5min em temperatura ambiente, e finalmente examinadas por citometria de fluxo.

6. Pacientes com LRA e coleta de amostras

O protocolo foi aprovado pelo Conselho de Revisão do Segundo Hospital de Xiangya, República Popular da China. Este estudo recrutou 18 pacientes, incluindo 12 homens e 6 mulheres. O princípio de recrutamento foi baseado na biópsia renal. As informações do paciente são complementadas na Tabela 1. As amostras de biópsia renal foram obtidas de pacientes que vivem com doenças de lesões mínimas (MCD) (n=6) e LRA induzida por nefrite intersticial aguda ou isquêmica (AIN) (n{{6} }). Declaramos que todo estudo está em conformidade com todos os regulamentos éticos relevantes para pesquisa com participantes humanos e foi realizado em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinque e que o estudo está em conformidade com a orientação do Ministério da Ciência e Tecnologia para a Revisão e Aprovação de Recursos Genéticos Humanos. Os critérios de inclusão e exclusão de MCD foram descritos em nosso estudo anterior.23 Para RI: Critérios de inclusão:1 Biópsia para pacientes com isquemia-reperfusão,2 Idade menor que 75 anos; Critérios de exclusão1: excluir pacientes com tumores encontrados em exames médicos pós-operatórios,2 excluir pacientes com histórico de diabetes, gota, hipertensão, tuberculose urinária ou infecção, respectivamente. Para NIA: Critérios de inclusão1: Clinicamente diagnosticado como nefrite intersticial aguda2 Pacientes com NIA confirmados por biópsia,3 Idade inferior a 75 anos; Critérios de exclusão1: Excluir pacientes com creatinina sanguínea anormal antes da admissão,2 excluir pacientes com história de diabetes, gota, hipertensão, tuberculose urinária ou infecção. Esses espécimes foram então usados ​​para coloração de HE, TUNEL e imuno-histoquímica, bem como imunoprecipitação (IP) e imunoblotting.

7. Imunoprecipitação

O citoplasma e as mitocôndrias das células BUMPT e tecido renal de camundongos e pacientes com LRA foram separados usando o Mitochondria/Cytosol Fractionation Kit (Abcam, ab65320); o kit foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos (DsbA-L, VDAC1, HA ou IgG) foram ligados às esferas magnéticas. Em seguida, adicionamos o lisado mitocôndria/citoplasma e incubamos por três horas. Em seguida, a mistura foi eluída e investigada quanto à expressão de marcadores associados por imunoblotting.

8. PCR quantitativo relativo (qPCR)

O RNA foi extraído de células BUMPT ou tecido renal pelo reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O RNA foi então transcrito reversamente na primeira cadeia de cDNA usando o kit Prime Script RT Reagent e gDNA Eraser (TaKaRa, RR037A), conforme descrito anteriormente.31'34 Em seguida, usamos o cDNA como modelo com TB green (TaKaRa, RR820A) e um Lightcycler 96 (Roche) com os seguintes pares de primers: DsbA-L: 5 - AAATATGGGGGCCTT TGGGCT-3'(avançar) e 5'- TAGCAACTCCAAGCGGTCA G-3'(reverter); e GAPDH: 5'-GGTCTCCTTGACTTCACA-3'(avançar) e 5'-GTGAGGGTC TCCTCTTCCT-3'(reverter); PGC- 1a: 5'-ATGTGTCGCCTTCTTGCTCTTCC-3 (avançar) e 5'-CTCCCGCTTCTCGTGCTCTTTG-3'(reverter); NrF1:5'-TCTGCTGTGGCCTGATGGAGA GG-3'(avançar) e NrF1:5'-GATGCTTGCGTCGTCTGGAATGG-3 (reverso);

9. BUN e detecção de creatinina

A detecção de BUN e creatinina foi realizada de acordo com o protocolo de BUN (Urea Nitrogen Content Assay Kit Beijing Boxbio Science & Technology Co, Ltd.) e Creatinine Assay kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

10. Coloração HE, coloração TUNEL, imunoquímica, imunofluorescência e imunotransferência

O tecido renal foi incluído em parafina e depois cortado em seções para vários tipos de coloração, conforme descrito anteriormente.26,35 A histologia foi avaliada pela coloração de hematoxilina e eosina. Os critérios usados ​​para classificar a lesão tubular renal foram descritos anteriormente.23 A coloração TUNEL foi usada para avaliar a apoptose nas células renais. A proporção (porcentagem) de células positivas para TUNEL em 10-20 campos microscópicos por seção de tecido foi usada como um indicador quantitativo de apoptose.26 Para a coloração imunoquímica, as seções de tecido foram incubadas durante a noite a 4 graus C com um anticorpo primário específico ( DsbA-L 1:200 ou VDAC1 1:100). Na manhã seguinte, as seções foram incubadas com um anticorpo secundário por 30 minutos a 37 graus e depois reagiram com DAB por 5-10 min. Para coloração de imunofluorescência, as seções foram incubadas com um anticorpo primário específico (DsbA-L 1:200, VDAC1 1:100) durante a noite a 4 graus, seguido por um anticorpo fluorescente secundário por 1 h a 37 graus no escuro. DAPI foi então adicionado por 3-5 min e as seções foram observadas por microscopia fluorescente. A coloração mitocondrial foi realizada por um protocolo padrão. Lisados ​​de proteína de células BUMPT ou rins foram colhidos e depois centrifugados para coletar o sobrenadante contendo as proteínas. O sobrenadante foi submetido a SDS-PAGE e depois transferido para uma membrana de PVDF. As membranas foram então incubadas com um anticorpo primário durante a noite a 4 graus, seguido por um anticorpo secundário por 1 h à temperatura ambiente. A concentração de antiCOXIV, VDAC1, PGC-1a, Bax, Cyt-c, NRF1, GAPDH e b-tubulina é de 1:1000. A concentração de anti-Caspase3 e clivado-capase3 é 1:2000.

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11. Estatísticas

Todos os dados foram apresentados como médias § DP. Testes t de Student bicaudais foram usados ​​para comparações de dois grupos. ANOVA de um fator seguida pela análise post hoc de Tukey foi usada para comparações múltiplas. O teste Kruskal Walls foi utilizado para os dados com distribuição não normal. O software Graph Pad 8.0 foi utilizado para analisar os dados e P<0.05 was considered statistically significant.

12. Papel da fonte de financiamento

Os financiadores não estiveram envolvidos no desenho do estudo, coleta de dados, análise, interpretação ou redação do manuscrito.

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Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h e Dongshan Zhang a,b *

a Departamento de Medicina de Emergência, República Popular da China

b Instituto de Medicina de Emergência e Doenças Difíceis, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410011, República Popular da China

c Departamento de Oftalmologia, República Popular da China

d Departamento de Cirurgia Urinária, República Popular da China

e Departamento de Cirurgia Torácica, República Popular da China

f Departamento de Cirurgia Geral, Segundo Hospital de Xiangya, República Popular da China

g Departamento de Saúde Pública, Central South University, Changsha, Hunan, República Popular da China

h Departamento de Endocrinologia, Shenzhen People's Hospital, The Second Clinical Medical College da Jinan University, The First Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology, Shenzhen, People's Republic of China

1 Xiaozhou Li e Jian Pan contribuíram igualmente para este estudo