Parte 3: O efluxo de magnésio das células de Drosophila Kenyon é fundamental para a memória de longo prazo normal e aprimorada pela dieta

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

Pls clique aqui para a Parte 2

Clique paraBenefícios do Cistanche e efeitos colaterais para a memória

foi restrito a moscas adultas, sugerindo que UEX tem um papel mais sustentado na fisiologia neuronal. Em contraste, derrubar a expressão uex nos neurônios abs ou a{0}}b0 não prejudicou o LTM. A atividade dos neurônios a0 b0 é necessária após o treinamento para consolidar o LTM apetitivo (Krashes e Waddell, 2008), enquanto a saída abc e abs KC, juntas e separadamente, é necessária para sua expressão (Krashes e Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Portanto, observar o desempenho normal do LTM em moscas com perda de função do uex nos neurônios abs e a0b0 argumenta contra uma deficiência geral da função neuronal ab ao manipular o uex.

A dieta Mg2 plus não pode melhorar o desempenho defeituoso de LTM de moscas que eram constitutivamente mutantes de uex ou abrigavam uma perda de função de uex restrita a KC. No entanto, a expressão de uex nos ab KCs de moscas mutantes de uex restaurou a capacidade do Mg2 plus de melhorar o desempenho. Portanto, os ab KCs são o locus celular para Mg2 maismemóriana mosca.

Talvez pareça contra-intuitivo que o efluxo de magnésio dirigido por UEX seja necessário em KCs para suportar omemória-aumentando os efeitos do Mg2 mais a alimentação, quando o Mg2 mais dietético eleva o KC [Mg2 mais]i. Nesta fase, só podemos especular por que isso acontece. Assumimos que o cérebro e os ab KCs, em particular, precisam se adaptar de maneira equilibrada aos níveis mais altos de Mg2+ intracelular e extracelular que resultam da suplementação dietética. Nossa imagem ao vivo de KC [Mg2 mais]i em cérebros mutantes de tipo selvagem e uex sugere que o efluxo dirigido por UEX provavelmente seja um fator essencial na manutenção homeostática ativa, e talvez evocada por estímulo, desses níveis elevados.

Vários tipos de células de mamíferos extrudam Mg2 plus de maneira dependente de cAMP, alguns minutos após serem expostos à estimulação b-adrenérgica (Romani e Scarpa, 2000; Vormann e Gunther, 1987; Jakob et al., 1989; Romani e Scarpa, 1990b; Romani e Scarpa, 1990a; Vormann e Günther, 1987; Günther et al., 1990; Howarth et al., 1994). A presença de um domínio CNBH sugere que UEX e CNNMs podem ser regulados diretamente pelo cAMP. Testamos a importância do CNBH introduzindo uma substituição de aminoácidos R622K que deve bloquear a ligação de cAMP no UEX CNBH. Essa mutação sutil aboliu a capacidade do transgene uexR622K de restaurar o desempenho de LTM em moscas mutantes uex. Também usamos CRISPR para mutar o CNBH no locus uex nativo. Embora a exclusão do CNBH de CNNM4 tenha abolido Mg2 mais a atividade de efluxo (Chen et al., 2018), moscas homozigotas para a lesão uexT626NRR eram viáveis, demonstrando que retêm um nível suficiente de função UEX. No entanto, essas moscas apresentaram comprometimento imediato e de longo prazomemória. Além disso, o desempenho das moscas uexT626NRR não pode ser melhorado pela alimentação com Mg2. Esses dados demonstram que um CNBH intacto é um elemento crítico dememória-função UEX relevante. A ligação de proteínas adaptadoras de clatrina ao CNNM4 CNBH foi implicada no direcionamento basolateral (Hirata et al., 2014), sugerindo que UEXT626NRR pode estar inadequadamente localizada em KCs. Além disso, a expressão KC da variante mutante CNNM2 E122K, que retém a função residual

mas tem um defeito de tráfego (Arjona et al., 2014), não restaurou o defeito uex LTM.

Embora tenha sido questionado se os domínios CNNM2/3 CNBH ligam nucleotídeos cíclicos (Chen et al., 2018), descobrimos que FSK evocou um aumento em ab KC [Mg2 plus]i que era sensível à mutação uex, e que UEX: :HA foi mal localizado em rut2080 adenilato ciclase (Han et al., 1992) e dnc1 fosfodiesterase (Dudai et al., 1976) aprendendo moscas mutantes defeituosas. Enquanto o rótulo UEX::HA foi distribuído uniformemente em g, abc e abs KCs em moscas do tipo selvagem, o rótulo UEX::HA foi diminuído nos g e abs KCs e foi mais forte em neurônios abc em mutantes rut2080 e dnc1. As manipulações crônicas de cAMP nos mutantes são, portanto, consistentes com o impacto de cAMP na localização UEX, talvez interagindo com o CNBH. Além disso, a localização UEX alterada pode contribuir para amemóriadefeitos de moscas rut2080 e dnc1.

Nossos dados fisiológicos usando Magnesium Green em cultura de células de mamíferos e o repórter MagIC geneticamente codificado em ab KCs demonstram que o fly UEX facilita o Mg2 mais o efluxo. Estimular o cérebro da mosca com FSK evocou um aumento maior em ab KC [Mg2 plus]i em cérebros mutantes uex do que em controles de tipo selvagem, o que fornece a primeira evidência de que UEX limita um aumento em [Mg2 plus]i em Drosophila KCs. Nossas gravações MagIC também revelaram uma oscilação lenta (centrada em torno de 0.015 Hz, aproximadamente uma vez por minuto) de ab KC [Mg2 mais ]i que era dependente de UEX. Ainda não entendemos a função fisiológica dessa flutuação [Mg2 mais ]i, embora provavelmente reflita uma propriedade das células em nível de sistemas homeostáticos. A atividade oscilatória bioquímica desempenha um papel crucial em muitos aspectos da fisiologia celular (Nova'k e Tyson, 2008). Mais notavelmente, a flutuação cronometrada circadiana de [Mg2 mais ]i liga o metabolismo energético celular dinâmico à tradução controlada pelo relógio através da via Mg2 mais sensível mTOR (alvo mecanicista da rapamicina) (Feeney et al., 2016). É, portanto, possível que Mg2 mais oscilações lentas possam unir papéis para cAMP, UEX, fluxo de energia (Plac¸ais et al., 2017) e tradução dependente de mTOR subjacente à plasticidade sináptica relevante para LTM (Casadio et al., 1999 ; Huber et al., 2000; Beaumont et al., 2001; Hou e Klann, 2004; Hoeffer et al., 2008).

Contato para compartilhamento de reagentes e recursos

Uma lista completa de reagentes pode ser visualizada na Tabela de recursos principais.

Mais informações e solicitações de recursos e reagentes devem ser direcionadas e serão atendidas pelo contato principal, Scott Waddell (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk).

Modelo experimental e detalhes do assunto

Linhagens de moscas

Salvo indicação em contrário, as moscas foram criadas com ração padrão de fubá sob um ciclo claro-escuro de 12 horas a 60% de umidade e 25°C. As moscas de teste e controle para experimentos GAL80ts foram criadas a 18˚C. Moscas de sexo misto com 1–7-dias de idade foram usadas em experimentos.

Canton-S foi a cepa do tipo selvagem. As linhas de driver GAL4 usadas neste estudo são c739-GAL4 (McGuire et al., 2001), c305a-GAL4 (Krashes et al., 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka et al., 2004), 0770-GAL4 (Gohl et al., 2011), MB247-GAL4 (Zars et al., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) e uex-GAL4 (Kvon et al., 2014); Centro de Recursos de Drosophila de Viena, VDRC, VT23256-GAL4). As linhas UAS obtidas do centro de estoque são UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) e UAS-uexRNAi (BDSC, 36116). As várias linhagens mutantes e transgênicas são descritas, uexMI01943 (Venken et al., 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han et al., 1992) e dnc1 (Dudai et al., 1976) , tubP-GAL80ts (McGuire et al., 2003) e PhsILMiT (BDSC, 24613). As linhas de excisão uexMI01943.ex1 e uexMI01943.ex2 Minos foram geradas usando o procedimento descrito em Arc et al., 1997. O esquema de acasalamento detalhado é mostrado na Figura 2 – suplemento de figura 2A. Linhas de excisão potenciais foram estabelecidas a partir de moscas individuais exibindo o fenótipo de cor do corpo amarelo. O DNA genômico foi extraído de seis dessas linhas e o DNA que flanqueia o uexMI01943 MiMIC foi amplificado por PCR e sequenciado. As linhagens uexMI01943.ex1 e uexMI01943.ex2 foram identificadas para abrigar excisões precisas, tendo restaurado a sequência genômica selvagem. Consulte a Tabela de recursos para PCR e sequências de primers de sequenciamento. Esquema do detalhe da sequência da inserção MiMIC uexMI01943 e nas excisões é mostrado na Figura 2 - suplemento de figura 2B. Para construir moscas transgênicas UAS-uex, uma sequência de codificação uex de comprimento total (CDS) foi clonada por RT-PCR. O RNA total foi isolado de moscas do tipo selvagem usando TRIZOL (Thermo Fisher, 15596018) e transcrito reversamente em cDNA usando o sistema de síntese de primeira fita SuperScript III (Invitrogen, 18080400). Esta mistura total de cDNA foi usada como modelo para amplificar o uex CDS. Consulte a Tabela de Recursos para sequências de primers. O produto de PCR foi digerido com SacII e XhoI e então ligado nos sítios complementares de pUAST (Brand e Perrimon, 1993). O CDS uex clonado pUAST foi totalmente sequenciado e verificado para representar os 2505 pb do quadro de leitura de cDNA uex de tipo selvagem (observe que todas as quatro isoformas de mRNA uex possíveis, FlyBase Release 6, codificam a mesma proteína de 834 aminoácidos). Moscas transgênicas UAS-uex foram geradas comercialmente (Bestgene) por transformação com o vetor pUAST-uex. Mapeamos a inserção do cromossomo UAS-uex de 10 linhagens transgênicas independentes e testamos comportamentalmente três linhas, denotadas UAS-uex3M, UAS-uex5M e UAS-uex8M, com uma inserção no terceiro cromossomo. As moscas UAS-uex3M foram as utilizadas em todo o estudo e referidas como UAS-uex no manuscrito.

As moscas transgênicas UAS-uexR622K foram geradas de forma semelhante às moscas UAS-uex. Uma mutação missense foi introduzida no códon 622 de UEX dentro do domínio CNBH, imitando aquela previamente projetada no domínio de ligação a cAMP da subunidade reguladora da proteína quinase A (Bubis et al., 1988). A mutação altera o códon CGT que codifica Arg em AAA que codifica Lys. A mutação foi introduzida no uex CDS de tipo selvagem usando Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621S) conforme descrito em 'Métodos aprimorados para mutagênese direcionada ao local usando Gibson Assembly Master Mix' (Nota de Aplicação NEB). Os conjuntos de primers usados ​​são detalhados na Tabela de Recursos. O produto da montagem de Gibson foi ainda amplificado por PCR e o produto resultante foi clonado no vetor pUAST e sequenciado. As inserções de transgenes foram mapeadas como para UAS-uex e uma das duas inserções mapeadas para o terceiro cromossomo foi usada em experimentos de comportamento.

Linhas de moscas transgênicas UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W e UAS-CNNM2T568I foram geradas por transformação com construtos pUAST contendo versões de tipo selvagem ou com mutação pontual de um cDNA CNNM2 de camundongo marcado com HA (mCNNM2:: HA), descrito em Arjona et al., 2014. Versões de tipo selvagem ou mutantes de CNNM2 foram amplificadas a partir de clones mCNNM2::HA originais em plasmídeos pCiNEO_IRES_GFP (Arjona et al., 2014). Os primers são detalhados na Tabela de Recursos. Os produtos de PCR foram digeridos com XhoI e XbaI e ligados nos sítios complementares em pUAST. As inserções de cada construção no terceiro cromossomo foram identificadas por mapeamento conforme descrito acima e foram usadas nos experimentos de comportamento. Observe que todas as construções de codificação CNNM2 usadas no estudo são marcadas com HA, embora a notação seja frequentemente omitida por brevidade.

Linhas de moscas transgênicas UAS-MagFRET-1 foram geradas por transformação com construções pJFRC-MUH contendo MagFRET-1 CDS, que foi subclonado a partir do plasmídeo pCMVMagFRET-1, descrito em Lindenburg et al. , 2013. As cartilhas estão detalhadas na Tabela de Recursos. Os produtos de PCR foram digeridos com XhoI e XbaI e ligados nos sítios complementares em pJFRC-MUH. A inserção da construção foi mediada pelo sistema de transgênese sítio-específico e o sítio de aterrissagem é attP2 (no terceiro cromossomo).

As linhagens de moscas transgênicas UAS-MagIC e UAS-MARIO foram geradas por transformação com construtos pTW contendo os CDS MagIC/MARIO, que foram subclonados a partir dos plasmídeos MagIC/ pcDNA3 e MARIO/pcDNA3, gentilmente cedidos por T. Nagai: (Maeshima et al., 2018 e Koldenkova et al., 2015). Os CDS MagIC/MARIO foram primeiramente amplificados por PCR a partir de MARIO/pcDNA3 e MagIC/pcDNA3 respectivamente e foram clonados no vetor pENTR/D-TOPO. Os primers são detalhados na Tabela de Recursos. Observe que o iniciador de sentido MARIO foi projetado para se sobrepor à sequência de pcDNA3 no local de inserção de MARIO. Os CDS MagIC/MARIO foram posteriormente clonados no vetor de destino Gateway pTW (Drosophila Gateway Vector Collection).

O locus uexD editado pelo CRISPR/Cas9 foi gerado comercialmente pela GenetiVision. O esquema de edição é mostrado na Figura 2 – suplemento de figura 2C. O locus uex fica em orientação reversa no cromossomo 2R, abrangendo uma região de 49.141 pb entre a posição 3.900.285 e 3.949.425 (FlyBase, Release 6). A descrição a seguir refere-se a essas coordenadas dentro do locus uex. Para gerar uexD, dois plasmídeos de gRNA e um plasmídeo doador de DNA de fita dupla (dsDNA) foram construídos e injetados em embriões nos-Cas9 (BDSC, 54591). Conforme indicado na Figura 2 – suplemento de figura 2C e detalhado na Tabela de Recursos, o gRNA1 upstream está no Exon 6 e tem como alvo a sequência 30.930,30.952. O gRNA2 a jusante correspondente encontra-se entre o Exon 7 e o Exon 8 entre 33.988 e 34.010. Ambos os gRNAs foram clonados individualmente em pCFD3-dU63gRNA (Addgene, 49410). O local de corte do gRNA1 deve estar entre 30.946 e 30.947, enquanto o gRNA2 deve levar a um corte entre 33.993 e 33.994. Um braço de homologia a montante de 795 pb (30.152,30.946) e um braço de homologia a jusante de 977 pb (33.994,34.970) foram clonados no plasmídeo de DNA doador. Um códon de terminação (STOP, em todos os três quadros de leitura) foi inserido entre os dois braços de homologia e seguido por um cassete GFP acionado por um promotor 3xP3. O backbone de DNA do doador foi projetado pela GenetiVision e a sequência completa do doador para a linha uexD está disponível mediante solicitação. A edição bem-sucedida foi identificada pela expressão de GFP nos olhos da mosca e confirmada por PCR genômico e sequenciamento. Nas moscas uexD, um fragmento de 3047 pb de 30.947 a 33.993 foi substituído pela sequência entre os dois braços de homologia no plasmídeo doador, principalmente o sinal STOP e o cassete GFP. O alelo uexD trunca a ORF uex. Os primers usados ​​para verificação de PCR genômica são detalhados na Tabela de Recursos. O transgene nos-Cas9 (no cromossomo X) foi removido por cruzamento.

As moscas uex::HA editadas por CRISPR/Cas9-foram geradas pela WellGenetics usando o sistema ScarlessDsRed desenvolvido pelo laboratório de Kate O'Connor-Giles (plasmídeo original não publicado doado para Addgene, #80822). Uma etiqueta 6XHA foi fundida no quadro ao terminal carboxi de UEX inserindo a sequência de codificação 6XHA imediatamente antes do códon STOP nativo no locus uex (Figura 3 - suplemento de figura 1A). O processo envolveu duas etapas principais. Na etapa 1, uma tag 6XHA juntamente com um transposon pBAC contendo um cassete DsRed foram inseridos no quadro com o códon STOP de uex usando a edição de genoma mediada por CRISPR/Cas{11}}por reparo dirigido por homologia (HDR) usando 1 gRNA e um doador de plasmídeo dsDNA. O gRNA fica a 50 pb do códon uex STOP e deve direcionar um corte entre 48.587 e 48.588. O gRNA foi clonado em um plasmídeo pCFD3-dU63gRNA. Um braço a montante de 1.200 pb (47.438,48.637) e um braço a jusante de 1.033 pb (48.641,49.673) foram clonados no plasmídeo de DNA doador com o esqueleto pUC57-Kan (2.579 pb). Consulte a Tabela de recursos para gRNA e sequências de primers. Uma mutação do Protospacer Adjacent Motif (PAM) (TCC para TCG, 48.581,48.583) foi introduzida no doador para promover HDR. Uma etiqueta 6XHA, seguida por um transposon pBAC contendo um cassete DsRed acionado pelo promotor 3XP3, foi inserido entre os dois braços de homologia. Um motivo de reconhecimento de pBAC TTAA é incorporado no códon STOP de 6XHA. A sequência completa do doador está disponível mediante solicitação. Os plasmídeos doadores e gRNA foram injetados em embriões nos-Cas9 (NIG-FLY, CAS0002). A edição bem sucedida foi identificada pela expressão de DsRed nos olhos da mosca e confirmada por PCR genômico e sequenciamento. Seis linhas positivas independentes foram identificadas e quatro passaram na validação de PCR. Dessas quatro linhas, mais uma passou na validação de sequenciamento e é a linha intermediária representada na Figura 3 – suplemento de figura 1A. Desta linha foram estabelecidos quatro estoques isogenizados e balanceados. Na etapa 2, o marcador de seleção DsRed foi excisado por transposição PiggyBac (PBac) com a linha auxiliar Tub-PBac (BDSC, 8285). Cinco linhagens viáveis ​​homozigóticas com excisão bem sucedida foram validadas por PCR genômico e sequenciamento. Um designado uex::HA foi usado em experimentos no manuscrito.

Para construir as moscas uexT626NRR editadas por CRISPR/Cas{{0}}, projetamos e clonamos um gRNA e projetamos e ordenamos (Sigma) um oligodesoxinucleotídeo de fita simples (ssODN). As sequências de gRNA e ssODN são detalhadas na Tabela de Recursos. Como planejamos fazer uma única substituição de aminoácido R622K no domínio UEX CNBH, o doador ssODN de 120 pb foi centrado no códon R622 e carrega a alteração do códon CGT para AAA (em 31.179,31.181) correspondente a R622K. O local de corte esperado do gRNA (entre 31.192 e 31.193) está a apenas 11 pb do ponto de mutação esperado. Para aumentar a probabilidade de HDR, que é supostamente baixo usando ssODN como doador, comercialmente (GenetiVision) injetamos material de edição em 250 embriões lig4 KO vasa-Cas (Zimmer et al., 2016). Obtivemos 37 moscas G0 viáveis ​​dos embriões injetados. Um total de 224 moscas G1 foram submetidas a PCR genômica de mosca única e sequenciamento para rastrear a mutação esperada. Primers detalhados na Tabela de Recursos. Identificamos 59 linhas editadas putativas da triagem de primeira rodada, e dessas 12 foram confirmadas. Apesar de usar lig4 KO vasa-Cas9, detectamos apenas eventos de junção final não homóloga (NHEJ) em vez de mutações pontuais mediadas por HDR. Das 12 linhagens editadas, seis eram homozigotas letais e as outras seis eram viáveis. Em quatro das linhagens viáveis ​​homozigóticas, encontramos uma substituição de G por T na posição 31.192 juntamente com uma inserção de 6 pb no quadro de ATCTTC entre 31.192 e 31.193. Esta edição NHEJ corresponde ao T626 ! Alteração do NRR na sequência de proteínas do UEX (Figura 5A). O cromossomo X vasa-Cas9 foi removido dessas linhas por cruzamento e uma linha chamada uexT626NRR foi usada nos experimentos de comportamento no manuscrito.

Detalhes do método

Experimentos comportamentais

Para experimentos comportamentais em labirinto em T, foram usadas moscas de sexo misto de 1–7-dias de idade. Os odores eram 4-metilciclohexanol (MCH) e 3-octanol (OCT), diluídos ~1:103 (especificamente, 9 ml de MCH ou 7 ml de OCT em 8 ml de óleo mineral). Todos os experimentos foram realizados a 23˚C e 55–65 por cento de umidade relativa.

Apetitivo imediato e posteriormemóriaos experimentos foram realizados essencialmente como descrito (Krashes e Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Lotes de 100 a 120 moscas foram mantidos em jejum por 21 a 23 horas antes do treinamento em frascos de inanição de 35 ml contendo ~ 2 ml de 1 por cento de ágar (como fonte de água) e um papel de filtro de 2 cm 4 cm. Papéis de açúcar (5 cm 7,5 cm) para treinamento foram preparados embebendo com 4 ml de sacarose 2 M e secando durante a noite. Papéis de água do mesmo tamanho foram embebidos em água e deixados durante a noite. Para o treinamento apetitivo, as moscas foram transferidas de um tubo de inanição para um tubo de treinamento com papel 'água' seco e imediatamente acopladas ao braço de treinamento do labirinto em T e expostas ao odor CS por 2 min, seguidos de 30 s de ar puro. As moscas foram então transferidas para outro tubo de treinamento com papel de açúcar seco, fixado ao labirinto em T e exposto ao CS mais odor por 2 min. Imediatomemóriafoi testado transportando moscas para o ponto de escolha T e permitindo-lhes 2 min para escolher entre os dois fluxos de odor. Para testar 24 horasmemória, as moscas foram removidas do tubo de treinamento e transferidas para frascos padrão de farinha de milho por 1 hora, depois transferidas de volta para frascos de inanição por 23 horas até o teste. O Índice de Desempenho foi calculado como o número de moscas no braço CS mais o número no braço CS, dividido pelo número total de moscas. MCH e OCT foram usados ​​alternadamente como CS plus ou CS e uma única amostra, ou n, representa o Índice de Desempenho médio de dois grupos treinados reciprocamente.

Para testes de comportamento após Mg2 mais alimentação, moscas de 1–2-dias de idade foram alojadas em frascos com Mg2 mais comida suplementada por 1–5 dias antes de serem deixadas de lado para treinamento e testes apetitivos, conforme descrito acima. Para fazer 80 mM [Mg2 plus] alimento, 40 ml de solução 1 M de MgCl2 foram adicionados a 460 ml de alimento líquido normal para moscas; O alimento 1 mM [Mg2 plus] foi feito diluindo 0,5 ml de MgCl2 1 M em 39,5 ml de água MilliQ e adicionando-o a 460 ml de alimento líquido. Os alimentos foram aliquotados e resfriados para solidificar. Os alimentos suplementados com MgSO4 e CaCl2 foram preparados da mesma forma.

Aversivo imediato e 24hmemóriaos experimentos foram conduzidos conforme descrito anteriormente (Hirano et al., 2013; Perisse et al., 2016; Tully e Quinn, 1985). Grupos de 100 a 120 moscas foram treinados com um ciclo de treinamento aversivo ou cinco ciclos espaçados por intervalos de 15 minutos entre as tentativas (treinamento espaçado). Para imediato aversivomemória, moscas foram testadas após treinamento de um ciclo. Aversivo 24 horasmemóriafoi testado usando dois protocolos diferentes. No protocolo facilitado pelo jejum, as moscas passaram fome por 16 horas antes do treinamento de um ciclo (Hirano et al., 2013). Para o treinamento espaçado, as moscas não passaram fome antes do treinamento. As moscas foram alimentadas com ração normal para moscas por 24 horas após treinamento facilitado em jejum e espaçado, antes de serem testados paramemóriaatuação. Durante cada ciclo de treinamento aversivo, as moscas foram expostas por 1 min a um primeiro odor (CS plus ) emparelhado com doze choques elétricos de 90 V em intervalos de 5 s. Após 45 s de ar limpo, um segundo odor (CS ) foi apresentado por 1 min sem choque. O Índice de Desempenho foi calculado como o número de moscas no braço CS menos o número no CS mais

braço, dividido pelo número total de moscas. MCH e OCT foram usados ​​alternadamente como CS plus ou CS e uma única amostra, ou n, representa o Índice de Desempenho médio de dois grupos treinados reciprocamente.

Os testes de acuidade sensorial (Figura 2 – fonte de dados 1) foram realizados conforme descrito (Keene et al., 2004; Keene et al., 2006; Schwaerzel et al., 2003) com modificações. Para testar a acuidade olfativa, moscas não treinadas tiveram 2 minutos para escolher entre um odor diluído usado no condicionamento e ar borbulhado através de óleo mineral no labirinto T. Um Índice de Evitação foi calculado como o número de moscas no braço de ar menos o número no braço de odor, dividido pelo número total de moscas. A prevenção de choque elétrico foi realizada e calculada de forma semelhante. Moscas não treinadas escolheram por 1 min entre dois tubos contendo redes elétricas, mas apenas um estava conectado à fonte de energia. Um índice de evasão foi calculado como o número de moscas no braço não eletrificado menos o número no braço eletrificado, dividido pelo número total de moscas. Para avaliar a acuidade do açúcar, moscas famintas tiveram 2 minutos para escolher entre um braço do labirinto em T contendo um papel de açúcar seco e o outro contendo um papel de filtro de 'água' seco. Ambos os trabalhos foram preparados como no apetitivomemóriaensaios. Um Índice de Preferência foi calculado como o número de moscas no braço de açúcar menos o do outro braço, dividido pelo número total de moscas. Descobrimos que manter a luz acesa na sala comportamental e ter fluxo de ar passando pelos tubos de teste melhorou muito o Índice de Preferência em moscas do tipo selvagem e, portanto, aplicamos essas condições para todos os testes de preferência de açúcar.

Anticorpo anti-UEX e western blot

Um anticorpo policlonal UEX foi desenvolvido comercialmente pela Eurogenec. Dois peptídeos foram sintetizados como antígenos: Peptídeo 1H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) e Peptídeo 2H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) e injetados em coelhos. Apenas o Peptídeo 2 induziu uma resposta imune robusta e foi processado posteriormente. O soro final foi purificado contra o Peptídeo 2 e usado para análise de Western blot como uma diluição de 1:2000.

Para cada amostra em Western blot, as proteínas foram extraídas de 20 cabeças de mosca homogeneizando completamente em 120 ml de tampão de amostra de proteína contendo uma mistura de 30 ml de 2-mercaptoetanol (Bio-Rad), 270 ml 4 Tampão de amostra Laemmli (BioRad) e 900 ml de Água Livre de Nuclease (Invitrogen). As amostras foram então fervidas em um bloco de calor de 100°C por 3 min e centrifugadas por 10 min antes do carregamento. Um volume de amostra equivalente a quatro cabeças foi carregado em cada faixa de gel SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para a membrana de PVDF e bloqueadas em 5% de leite desnatado por 1 hora a 25°C com agitação de 35 rpm. A membrana foi então incubada em solução anti-UEX (anti-UEX de coelho 1:2000 em 5% de leite desnatado) durante a noite a 4°C com agitação de 35 rpm. A membrana foi lavada rapidamente três vezes seguidas de 3 10 lavagens min em solução de TBST (100 ml de solução de TBS 10, BioRad, diluída em 900 ml de água MilliQ, com 0,1 por cento de Tween 20) e depois incubada com HRP-conjugado solução de anticorpo secundário (1:5000 de anti-coelho de cabra em 5% de leite desnatado) por 1–2 horas a 25˚C com agitação de 35 rpm. A membrana foi novamente lavada rapidamente por três vezes seguidas de 3 10 lavagens min em TBST. As bandas de proteína foram visualizadas usando o substrato de transferência ocidental Pierce ECL (Life technologies, 32134). A membrana foi então removida usando a solução Millipore ReBlot Plus Mild (Merck, 2502), bloqueada novamente em 5% de leite desnatado e sondada com anticorpo primário anti-Tubulin de camundongo (1:2000, Sigma, T6199) e anti-Tubulina de cabra conjugado com HRP correspondente. anticorpo secundário de camundongo (1:5000) seguindo o protocolo detalhado acima.

Imunocoloração

A imunocoloração foi realizada conforme descrito (Wu e Luo, 2006). Cérebros de 1- a 5-moscas adultas de um dia de idade foram dissecados em PBS e fixados por 20 min em PBS com 4% de paraformaldeído em temperatura ambiente. Eles foram então lavados duas vezes brevemente em 0,5 por cento PBT (2,5 ml Triton-X100 em 497,5 ml PBS) e três lavagens de 20 min. Os cérebros foram então bloqueados por 30 min à temperatura ambiente em PBT contendo 5% de soro de cabra normal e depois incubados com anticorpos primários e secundários com rotação suave (35 rpm) a 4°C por 1 ou 2 dias. Os anticorpos primários foram anti-GFP de coelho (1:250; Invitrogen A11122) e anti-HA de coelho (1:250, NEB 3724T). Anti-coelho de cabra conjugado com Alexa 488 (1:250; Invitrogen, A11034) foi o anticorpo secundário. Antes e depois da incubação do anticorpo secundário, os cérebros foram submetidos a duas lavagens rápidas seguidas de três lavagens de 20 minutos em 0,5 por cento de PBT. Os cérebros corados foram montados em lâminas de vidro em Vectashield (Vector Labs H1000) e fotografados usando um microscópio confocal Leica TCS SP5 com ampliação de 40 (HCX PL APO 40, objetiva de imersão em óleo 1,3 CS, Leica). As pilhas de imagens foram coletadas em resolução 1024 1024 com passos de 1 mm e processadas usando Fiji (Schindelin et al., 2012). Para quantificação na Figura 3G e H, ROIs retangulares de aproximadamente 40 25 mm para o globo, ou ROIs redondos com um diâmetro de 15 mm para ab, a'b' e EB foram desenhados manualmente em uma única seção de uma varredura z-stack do cérebro da mosca. Os ROIs correspondentes também foram desenhados no protocérebro medial superior (SMP) como uma região de controle de fundo, e a fluorescência média foi calculada usando ImageJ. A intensidade ROI dos lobos MB e o EB foram normalizados para a respectiva intensidade SMP. Uma média entre os cérebros esquerdo e direito foi usada para um único ponto de dados. Para quantificação nas Figuras 7C e D, as ROIs são indicadas nas figuras e a intensidade da ROI foi calculada de forma semelhante aos resultados na Figura 3H. Na Figura 7C, uma linha foi traçada através da parte mais larga da ponta do lóbulo a. O perfil de intensidade desta linha foi obtido através do ImageJ. Trinta pontos de dados no meio de tal perfil abrangendo cerca de uma linha de 15 mm foram extraídos para cada perfil de linha. O perfil foi ainda normalizado para o valor médio dos primeiros cinco pontos de dados (F0) e calculado como (F F0)/F0. Os valores médios desses perfis normalizados de diferentes cérebros foram plotados (Figura 7C, painel do meio). Os perfis esquerdo e direito dos cérebros foram calculados e exibidos separadamente. Na Figura 7D, as intensidades relativas de diferentes ROIs representando diferentes regiões são somadas para gerar uma medida de intensidade total para o MB.

O construto de expressão de cDNA CNNM4 humano usado para investigar Mg2 mais efluxo em cultura de células é o descrito anteriormente (Yamazaki et al., 2013). Uma construção expressando Drosophila uex foi gerada pela inserção de uma etiqueta FLAG na frente do códon STOP do uex CDS. Os cDNAs CNNM4 e uex marcados com FLAG foram subsequentemente inseridos na tag pCMV -4A (Agilent) para expressão em células HEK293. As células HEK293 foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (Nissui) suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino (FBS) e antibióticos. Os plasmídeos de expressão foram transfectados com Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Para imunocoloração, as células foram fixadas com 3,7 por cento de formaldeído em PBS por 20 min e então permeabilizadas com 0,2 por cento de Triton X-100 em PBS por 5 min, ambos em temperatura ambiente. Em seguida, eles foram bloqueados com PBS contendo 3% de FBS e 10% de albumina de soro bovino (tampão de bloqueio) por 1 hora à temperatura ambiente. As células foram então incubadas durante a noite a 4˚C com anticorpo anti-FLAG de coelho (F7425, Sigma-Aldrich) diluído em tampão de bloqueio, lavadas 3 com PBS e incubadas por 1 h em temperatura ambiente com Alexa 488-anti-conjugado IgG de coelho (Invitrogen) e rodamina-faloidina (para visualização de F-actina, Invitrogen) diluídos em tampão de bloqueio. Após três lavagens com PBS, as lamínulas foram montadas em lâminas e fotografadas com um microscópio confocal (FluoView FV1000; Olympus).

A imagem Mg2 plus com Magnesium Green foi realizada conforme descrito (Yamazaki et al., 2013), com pequenas modificações. Para evitar a diminuição potencial de [Mg2 mais ]i com as proteínas expressas, as células HEK293 transfectadas foram cultivadas em meio de crescimento suplementado com 40 mM MgCl2 até a imagem. As células foram então incubadas com tampão de carregamento Mg2 plus (78,1 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5,5 mM glicose e 5,5 mM HEPES-KOH [pH 7,4]), incluindo 2 mM Magnesium Green-AM (Invitrogen), por 30 min a 37˚C. As células foram então lavadas uma vez com tampão de carregamento e visualizadas com um microscópio Olympus IX81 equipado com uma câmera ORCA-Flash 4.0 CMOS (Hamamatsu) e uma lâmpada de mercúrio SHI-1300L (Olympus). A fluorescência foi medida a cada 20 s (excitação em 470–490 nm e emissão em 505–545 nm) sob o controle do software Metamorph (Molecular Devices). O tampão foi então alterado para Mg2 mais tampão livre (MgCl2 no tampão de carregamento foi substituído por NaCl 60 mM). Os dados são apresentados como gráficos de linha (média de 10 células). Após a imagem, as células foram fixadas com PBS contendo 3,7 por cento de formaldeído e submetidas à microscopia de imunofluorescência para confirmar a expressão da proteína.

Mg2 baseado em FRET mais medições de concentração em cérebros de moscas fixos

Moscas com um a dois dias de idade com genótipo c739; UAS-MagFRET-1 foram alojados em frascos com 1 mM ou 80 mM [Mg2 plus] de alimento por 4 dias antes de serem coletados. Cérebros de moscas foram dissecados em PBS e fixados por 20 min em PBS com 4% de paraformaldeído em temperatura ambiente. Eles foram então lavados duas vezes brevemente em 0,5 por cento de PBT (2,5 ml de Triton-X100 em 497,5 ml de PBS) e três lavagens de 10 min. Os cérebros foram então montados em lâminas de vidro em Vectashield (Vector Labs H1000) e fotografados usando um Slicescope Scientifica de campo amplo com uma objetiva de imersão em água de 40, 0,8 NA e uma câmera Andor Zyla sCMOS com o software Andor Solis (v4.27). Para obter a razão FRET que indica a concentração de Mg2 mais do neurônio ab, séries temporais foram adquiridas alternadamente entre o canal cerúleo e o canal citrino a 3 Hz com 512 512 pixels e 16 bits. O comprimento de onda de excitação para ambos os canais é de 436 nm, enquanto o filtro de emissão para cerúleo é de 460 a 500 nm e o de citrino é de 520 a 550 nm. A aquisição da série começa no canal cerúleo e dura 5 s, depois muda para o canal citrino e dura mais 5 s, e esse ciclo é repetido por mais duas vezes. Um total de 30 s (90 quadros) de pilha de imagens foi adquirido para cada cérebro. As pilhas de imagens foram posteriormente analisadas usando ImageJ e scripts Matlab personalizados. Em resumo, as ROIs retangulares (Figura 1E, painel esquerdo) foram desenhadas manualmente nos lóbulos ab (um em um lóbulo e um no lóbulo b para cada hemisfério) e fora dos lóbulos ab (um para cada hemisfério) como controle de fundo. A intensidade de fluorescência do canal cerúleo foi calculada dividindo cada ROI de lóbulo vertical ou horizontal pela ROI de fundo e calculada a média entre os dois hemisférios para cada lóbulo e calculada a média ao longo dos 15 quadros para cada ciclo. O do canal citrino foi obtido de forma semelhante. Uma razão de FRET foi obtida a partir das intensidades acima, ainda calculadas em média entre os três ciclos de aquisição, representados como um ponto de dados na Figura 1E (painel direito).

Mg2 confocal mais imagem em explante de cérebro de mosca

Cérebros de explantes expressando c739-UAS-MagIC acionado por GAL4 foram colocados na parte inferior de uma placa de micropoços com fundo de vidro de 35 mm (Parte No. P35G-1.5–14 C, MatTek Corporation), abaixo do extracelular solução tampão salina (NaCl 103 mM, KCl 3 mM, N-Tris 5 mM, trealose 10 mM, glicose 10 mM, sacarose 7 mM, NaHCO3 26 mM, NaH2PO4 1 mM, CaCl2 1,5 mM, MgCl2 4 mM, osmolaridade 275 mOsm [ pH 7,3]) após a dissecção em tampão sem cálcio (Barnstedt et al., 2016). Para determinar a sensibilidade de Mg2 plus de UAS-MagIC, bem como a resposta de UAS-MagIC a outros produtos químicos, como EDTA, EGTA e CaCl2 (Figura 8B), os cérebros foram incubados na solução tampão salina com 20 mg/ml de digitonina para 6 min antes da imagem (Koldenkova et al., 2015). Para investigar a flutuação de Mg2 plus em resposta à aplicação de Forskolin (FSK) (Figura 8C-I), os cérebros foram colocados na solução tampão salina sem digitonina ou incubação. Em ambas as situações, a solução salina refere-se ao tampão (com ou sem digitonina) no qual o cérebro está submerso.

A imagem foi realizada em um microscópio confocal LSM780 (Zeiss) com uma objetiva de 20 ar usando o software ZEN 2011. A parte de Vênus do MagIC foi excitada com um laser de 488 nm e sua emissão foi coletada na faixa de 520-560 nm. O mCherry foi excitado com um laser de 561 nm e sua emissão foi coletada na faixa de 600 a 640 nm. As séries temporais foram adquiridas a 0,5 Hz com 512 512 pixels e 16 bits. Após 60 s de medição de linha de base Venus/mCherry, 2-20 ml de solução salina ou outra solução química relevante foram adicionados através de uma micropipeta ao prato com captura de imagem constante. Os efeitos dos agentes aplicados na emissão de Vênus/mCherry foram então registrados por 15 a 20 minutos.

As pilhas de imagens foram posteriormente analisadas usando ImageJ e scripts Python personalizados. Em resumo, as ROIs retangulares foram desenhadas manualmente nos neurônios ab (uma para cada hemisfério, Figura 8A), e outra ROI do mesmo tamanho foi desenhada no meio, mas fora dos MBs como controle de fundo. A intensidade de fluorescência do canal Vênus (ou mCherry) foi calculada subtraindo a ROI de fundo das ROIs do cálice, respectivamente, e calculada a média entre os dois hemisférios. Isto é referido como 'Rel. Intensidade (au)' na Figura 8D e E. A razão entre a intensidade de Vênus e mCherry foi calculada como 'MagIC Ratio' na Figura 8B e C e Figura 8F e G. Para a Figura 8H, a intensidade para os dois canais foi calculada separadamente. Neste caso, 'Rel. Intensidade (DF/F0)' refere-se à intensidade de fluorescência relativa normalizada para a intensidade média do período de linha de base F0, calculada como (FF0)/F{{9} }. A intensidade relativa DF/F{10}} de Vênus foi usada para calcular o PSD (Figura 8I) por meio da função python psd (em matplotlib.pyplot), que adotou o método do periodograma médio de Welch (Bendat et al., 2000).

Transcrição reversa e PCR quantitativo em tempo real

Para cada amostra, 120 moscas foram congeladas em nitrogênio líquido e suas cabeças foram homogeneizadas completamente em reagente TRIzol (Invitrogen). O RNA total foi extraído usando um kit Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) seguindo as instruções do fabricante. O cDNA foi sintetizado usando o sistema de síntese SuperScript III First-Strand (Invitrogen). Cinco amostras independentes foram preparadas para cada tratamento ou genótipo diferente. A PCR quantitativa foi realizada em triplicado para cada amostra de cDNA em um instrumento LightCycler 480 (Roche) usando SYBR Green I Master Mix (Roche). As curvas de fusão foram analisadas após a amplificação e os amplicons foram visualizados por eletroforese em gel de agarose para confirmar a especificidade do primer. Os níveis de transcrição relativos foram calculados pelo método 2-DDCt (Livak e Schmittgen, 2001), e a média geométrica dos valores de Ct de três genes de referência (Gapdh, Tbp e Ef1a 100E) foi usada para normalização. Os primers são detalhados na Tabela de Recursos.

PCR inversa

A PCR inversa foi usada para mapear a posição de inserção do MiMIC em moscas uexMI01943. O DNA genômico foi preparado a partir de 15 moscas adultas. O DNA equivalente a duas moscas foi então digerido em uma reação de restrição de 25 ml com Mbo I e 10 ml do produto foram ligados durante a noite a 4°C durante a noite para circularizar os fragmentos; 5 ml do produto de ligação foram usados ​​para PCR inversa. O produto de PCR foi purificado usando a reação Exo/SAP (Thermo Fisher, 78201) antes de ser sequenciado. A sequência foi comparada com o genoma de D. melanogaster (FlyBase, Release 6) por BLAST e combinada uniformemente com a região 3.882.886,3.882.641 em 2R, consistente com a inserção relatada de uexMI01943 em FlyBase. Os primers são detalhados na Tabela de Recursos.

Predição e alinhamento do domínio da proteína

O alinhamento da sequência de proteínas foi realizado usando Geneious R10.2.2. A previsão do domínio da proteína foi realizada com InterPro (Finn et al., 2017; Jones et al., 2014) e Phyre2 (Kelley et al., 2015). O alinhamento do domínio da proteína e da estrutura foi realizado usando TM-align (Zhang e Skolnick, 2005). A visualização da estrutura da proteína foi renderizada no Chimera 1.11.2 (Pettersen et al., 2004).

Quantificação e análises estatísticas

Os dados de comportamento foram analisados ​​usando Excel e Prism 6. Os dados de imagem foram analisados ​​usando ImageJ e scripts MATLAB ou Python personalizados. Testes t bicaudais não pareados foram usados ​​para comparar dois grupos, e ANOVA unidirecional seguido de um teste post-hoc de Tukey foi usado para comparar vários grupos. O limiar de significância estatística foi fixado em p<>

Reconhecimentos

Agradecemos a FJ Arjona e JGJ Hoenderop pelos clones murinos do CNNM2 e comentários sobre o manuscrito. Somos gratos a T Nagai pelos clones de MagIC e MARIO e ao Bloomington Stock Center e VDRC pelas moscas. Agradecemos a P Cognigni, Y Huang, R Brain, R Szoke-Kovacs e M Goodwin pelo suporte técnico e outros membros do grupo Waddell pela discussão. Agradecemos a N Halidi, C Monico e a Micron Advanced Bioimaging Unit (apoiada pelo Wellcome Strategic Awards 091911/B/10/Z e 107457/Z/15/Z) por seu apoio e assistência neste trabalho. O EM foi financiado por uma bolsa de longo prazo EMBO (ALTF 184-2109). KDJ reconhece o apoio do Rhodes Trust. A SW foi financiada por uma Wellcome Principal Research Fellowship (200846/Z/16/Z) e uma ERC Advanced Grant (789274).