Parte 2: Efeito antifibrótico da 6-Bromo-indirrubina-3 ′ -oxima (6-BIO) via regulação da proteína ativadora-1 (AP-1) E Proteína de Especificidade-1 (SP-1) Fatores de Transcrição em Células Renais

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3.3. 6-BIO atenua marcadores de fibrose e vias de sinalização associadas à fibrose nas células do túbulo proximal (HK-2) e do fibroblasto intersticial (NRK49F)

Em seguida, confirmamos o efeito de 6-BIO em células tubulares proximais e células de fibroblastos intersticiais. Observamos uma redução dependente da concentração e do tempo da expressão de mRNA de GSK3 por 6-BIO em células HK-2 e NRK49F (Fig. S2A e B), e a expressão de proteínas relacionadas a ECM e EMT envolvidas dentrorimcélulafibrosetambém foi reduzido (Fig. S2E). Além disso, a expressão aumentada de GSK3, após exposição a TGF dessas células, também diminuiu pelo tratamento com 6-BIO (Fig. S2C e D). A Fig. 3 mostra a expressão da proteína derimfibrosemarcadores em células HK-2 e NRK49F tratadas com TGF . Conforme mostrado na Fig. 3A, a expressão das proteínas PAI-1 e CTGF aumentou significativamente em resposta ao tratamento com 5 e 10 ng/mL de TGF em células HK-2 e NRK49F, respectivamente. No entanto, sua expressão reduziu notavelmente após o tratamento com 6-BIO (Fig. 3B).SMADe as vias de sinalização MAPK foram reguladas positivamente pelo tratamento com TGF, que foi revertida pelo tratamento 6-BIO (Fig. 4). Em seguida, investigamos a expressão dos fatores de transcrição AP-1 e SP-1 envolvidos na sinalização mediada por TGF em células HK-2 e NRK49F. A Fig. 4D mostra que o aumento mediado por TGF em PC-JUN e PC-FOS foi reduzido em resposta ao tratamento com 6-BIO e inibidor de JNK SP600125 e após transfecção C-JUN dominante-negativa. A Fig. 4E mostra a mudança na intensidade da proteína em relação ao controle. Além disso, o aumento mediado por TGF no nível de SP-1 foi significativamente atenuado em resposta ao tratamento com siRNA 6-BIO e SP-1 (Fig. 4F). A Fig. 4G mostra a mudança na intensidade da proteína em relação ao controle. Esses resultados sugeriram que TGF/SMADe sinalização MAPK, bem como fatores de transcrição, AP-1 e SP-1, são regulamentados pela 6-BIO.

3.4. 6-BIO atenua a expressão nuclear de proteínas PC-JUN, PC-FOS e SP-1 em células de fibroblastos tubulares proximais e intersticiais

As Fig. 5A e B mostram a localização de PAI-1 e CTGF com PC-JUN, PC-FOS e SP-1. A coloração vermelha de PC-JUN, PC-FOS e SP-1 indicou sua superexpressão no núcleo após o tratamento com TGF; da mesma forma, a coloração verde de PAI-1 e CTGF indicou sua superexpressão no citosol. No entanto, os níveis de expressão de PC-JUN, PC-FOS e SP-1 foram reduzidos pelo tratamento 6-BIO. Esses resultados sugeriram que 6-BIO afeta diretamente AP-1 e SP-1, os fatores de transcrição que regulam a expressão de PAI-1 e CTGF.

3.5. 6-BIO atenua a atividade do promotor PAI-1, CTGF, AP-1 e SP-1 em células de fibroblastos tubulares proximais e intersticiais

Em seguida, investigamos se 6-BIO inibe as atividades promotoras dos genes PAI-1, CTGF, AP-1 e SP-1. A atividade promotora de PAI-1 e CTGF aumentou em resposta ao TGF, mas foi reduzida pelo tratamento 6-BIO (Fig. 6A e B). Além disso, a diminuição foi notável quando as células foram tratadas apenas com 6-BIO do que na presença de TGF. AP-1 e SP-1 se ligam aos promotores de PAI-1 e CTGF. A Fig. 6C e 6D mostram a atividade do promotor de AP-1 e SP-1. A atividade de AP-1 e SP-1 luciferase foi aumentada pelo tratamento com TGF e diminuída por 6-BIO de maneira dose-dependente. A Fig. 6E mostra a expressão do fator de transcrição em extratos de proteínas nucleares. Assim, confirmamos que a expressão nuclear de PC-JUN, PC-FOS e SP-1 aumentou em resposta ao tratamento com TGF e foi suprimida pelo tratamento com 6-BIO. A Fig. 6F mostra a mudança na intensidade da proteína em relação ao controle. Além disso, nossos resultados sugerem que 6-BIO atua no sítio de ligação do fator de transcrição do promotor para enfraquecer a ligação de AP-1 e SP-1. Realizamos o ensaio de ligação do promotor in vitro na presença de 6-BIO para confirmar o mesmo. A ligação de proteínas nucleares e PC-JUN, PC-FOS e SP-1 foi enfraquecida pela adição de 6-BIO de maneira dependente da concentração (Fig. 3 suplementar). Esses resultados indicam que 6-BIO inibe as atividades do promotor PAI-1 e CTGF, bem como as funções AP-1 e SP-1; assim, pode ter potencial terapêutico emrimfibrose.

4. Discussão

Usando o modelo de rato de UUO e TGF-tratadorimderivados de túbulos proximais e linhas celulares de fibroblastos intersticiais, demonstramos que o 6-tratamento com BIO pode atenuarrimdano. O modelo UUO é um modelo animal representativo de nefropatia obstrutiva que se caracteriza porfibrose[43]. Análise histopatológica derimtecidos obtidos a partir do modelo UUO mostraram que o acúmulo de MEC e a atrofia tubular no espaço intersticial foram restaurados pelo tratamento 6-BIO. Além disso, usando TGF-tratadorimcélulas derivadas do túbulo proximal e fibroblastos intersticiais, demonstramos que o 6-tratamento com BIO pode atenuarrimdano. No modelo UUO e nas células HK-2 e NRK49F tratadas com TGF, 6-BIO inibiu a expressão derimfibrosemarcadores, bem como MAPK eSMADvias de sinalização. Além disso, o tratamento com 6-BIO reduziu a expressão das proteínas PC-JUN, PC-FOS e SP-1 induzidas por UUO e TGF , bem como a expressão nuclear e a atividade promotora de AP{{6 }} e SP-1 em células HK-2 e NRK49F tratadas com TGF- -. A inibição dos fatores de transcrição AP-1 e SP-1 pelo 6-tratamento com BIO tem sido associada à inibição do acúmulo de ECM que leva à exacerbação derimfibrose. Isto é conseguido suprimindo MAPK eSMADvias de sinalização que levam a uma redução na expressão de PAI-1 e CTGF. Nossos resultados sugerem que 6-BIO pode ser um potencial agente terapêutico contrarimdoenças, bem como para a prevençãorimdanos causados ​​por UUO e TGF.

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O derivado de indirrubina semi-sintético permeável às células 6-BIO pertence a uma família de bis-indol e ocorre naturalmente em moluscos e plantas gastrópodes comestíveis [12]. A indirrubina contém uma ligação de hidrogênio intramolecular entre a ligação dupla 2-C O e o grupo N1-H e outra ligação de hidrogênio intermolecular entre as moléculas. 6-BIO tem uma estrutura quimicamente modificada na qual a posição 6-é substituída por Br para superar a desvantagem de propriedades farmacocinéticas pobres devido à baixa solubilidade em água da indirrubina [44]. Muitas indirrubinas, devido à ligação competitiva com ATP, atuam como inibidores duplos da quinase dependente de ciclina (CDK) e da glicogênio sintase quinase{{10}} (GSK-3 ), exibindo mais de {{ 12}} vezes a seletividade sobre CDK5 [12]. Além disso, 6-BIO exibe inibição marcadamente seletiva de GSK-3 com um valor de IC50 de 0,005 μM [12]. De acordo com relatos de vários grupos, 6-BIO inibe completamente a proliferação de células MCF-7 e bloqueia a migração em aproximadamente 75 por cento em uma concentração de 10 μM e inibe a fosforilação de PDK1. Isso mostrou que 6-BIO foi inserido na bolsa de ligação de PDK1 para formar três ligações de hidrogênio com resíduos na região de dobradiça, e a bolsa de ligação acomodou prontamente os átomos de Br adicionais em 6-BIO [45]. Com essas características, o 6-BIO está sendo estudado como um novo medicamento para regular processos celulares, como inflamação relacionada ao envelhecimento, estresse oxidativo, sobrevivência celular, proliferação e apoptose em câncer, diabetes e doenças degenerativas [46,47 ]. No entanto, estudos sobre regulação gênica e mecanismos moleculares relacionados arimcélulafibrosesão escassos. Portanto, procuramos investigar se 6-BIO atenuourimfibroseinibindo a regulação do gene PAI-1 e CTGF emrimcélulas, reduzindo assim o acúmulo de MEC.

Vários estudos usaram o modelo UUO para relatar uma correlação entre o acúmulo de MEC e doenças crônicas.rimDoença causada por intersticial tubularfibrose[43]. Além disso, PAI-1 e CTGF superexpressos estão associados ao alto acúmulo de ECM durante a progressão da doença crônicarimdoença. Assim, a identificação de uma molécula terapêutica que inibe a sinalização e a transcrição de genes associados ao aumento do acúmulo de ECM é importante para inibir efetivamenterimfibrose. Portanto, neste estudo, avaliamos 6-BIO, um dos inibidores da glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3 ), emrimfibrose.

Estudamos o efeito das proteínas PAI-1 e CTGF emrimcélulafibrosee confirmou que sua expressão foi regulada por fatores de transcrição comuns, AP-1 e SP-1. O fator de transcrição, AP-1, é um heterodímero composto por proteínas pertencentes ao JUN (C-JUN, JUNB e JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra-1 e Fra{ {6}}), ATF (fator de transcrição de ativação) e família JDP (proteína de dimerização JUN) [48]. Regula vários processos celulares, como proliferação celular, morte,

diferenciação e vascularização. Um estudo anterior relatou que a atividade AP-1 é aumentada no fígado e nos pulmões pela ativação do colágeno tipo VI e fibroblastos [49,50]. Os dois principais componentes do AP-1, C-JUN e C-FOS respondem a uma variedade de estímulos, como citocinas, fatores de crescimento e estresse [51]. Observamos aumento da fosforilação de C-JUN e C-FOS em um modelo de rato UUO e células HK{10}} e NRK49F tratadas com TGF (Figs. 2D e 4D). C-JUN e C-FOS formam heterodímeros e se ligam ao sítio de ligação AP-1 no DNA, agindo assim como fatores de transcrição para regular a expressão de outros genes. Além disso, a fosforilação de ERK1/2 e JNK ativa C-FOS e C-JUN, respectivamente. Em nosso estudo, a fosforilação de ERK1/2 e JNK, bem como C-JUN e C-FOS no núcleo foi notavelmente aumentada em resposta ao tratamento com TGF. No entanto, o 6-tratamento com BIO reverteu significativamente esses efeitos. Nosso estudo mostrou que 6-BIO inibiu eficientemente a fosforilação de ERK1/2 e JNK e diminuiu a atividade do fator de transcrição AP-1, inibindo assim a fosforilação de C-JUN e C-FOS que são seus downstream efetores. A inibição de SP-1 em astrócitos hepáticos exerce umaanti-fibróticoefeito [52]. Outro estudo mostrou que SP-1 desempenhou um papel importante nafibrose[52,53]. Portanto, avaliamos se 6-BIO poderia inibir o fator de transcrição SP-1. Observamos que a expressão da proteína SP-1 aumentou em resposta ao tratamento com TGF, bem como no modelo UUO, enquanto diminuiu após o tratamento com 6-BIO. Além disso, a expressão nuclear de SP-1 induzida por TGF foi suprimida pelo tratamento com 6-BIO. Como resultado, as atividades promotoras de PAI-1 e CTGF, que possuem sítios de ligação AP-1 e SP-1, também foram reduzidas pelo tratamento com 6-BIO (Fig. 6 ). Portanto, esses achados sugerem que a diminuição da atividade promotora de PAI-1 e CTGF pelo tratamento com 6-BIO diminuiu a expressão das proteínas PAI-1 e CTGF, e diminuiu o acúmulo de ECM, reduzindo assimrimcélulafibrose.

5. Conclusão

6-O tratamento com BIO diminuiu a expressão de PAI-1 e CTGF no modelo UUO e tratado com TGFrimcélulas. Além disso, 6-BIO inibiu a ativação induzida por TGF deSMADe sinalização MAPK, além de inibir as atividades de AP-1 e SP-1, dois dos vários fatores de transcrição que se ligam aos promotores dos genes PAI-1 e CTGF. A inibição de AP-1 e SP-1 parece ser um dos principais mecanismos pelos quais 6-BIO iniberimfibrose. Assim, nossos resultados sugerem que 6-BIO pode ser um potencial agente terapêutico contrarimdoenças.

Declaração de contribuição de autoria CRediT

Jung Sun Park: Conceituação, Metodologia, Curadoria de dados, Redação − preparação do rascunho original, Redação − revisão e edição, Visualização, Aquisição de financiamento. In Ae Jung: curadoria de dados, redação − revisão e edição. Hong Sang Choi: curadoria de dados, redação – revisão e edição. Dong-Hyun Kim: Metodologia, curadoria de dados. Hoon In Choi: Metodologia, Curadoria de Dados. Eun Hui Bae: Redação − revisão e edição, Supervisão. Seong Kwon Ma: Redação − revisão e edição,

6. Referências

A fonte é de Jung Sun Park et al on Biomedicine & Pharmacotherapy 145 (2022) 112402