PARTE 1 Preparação e avaliação da administração transdérmica baseada em microemulsão de glicosídeos feniletânicos Cistanche Tubulosa

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

JIANHUA YANG1*, HUANHUAN XU1-3*, & et al.

Abstrato.

O objetivo principal do presente estudo foi desenvolver uma nova formulação de microemulsão (ME) para fornecerglicosídeo feniletanoide de cistanche(PG) para uso em clareadores de pele e protetores solares. A fase oleosa foi selecionada com base na solubilidade do fármaco, enquanto o surfactante e o cossurfactante foram selecionados com base em sua capacidade solubilizante e na eficiência com que formaram MEs. Diagramas de fase pseudoternários foram construídos para avaliar regiões ME e cinco formulações de MEs óleo-em-água foram selecionadas como veículos. Experimentos de permeação cutânea in vitro foram realizados para otimizar a formulação ME e avaliar sua permeabilidade em comparação com a solução salina. As propriedades físico-químicas do ME otimizado e a capacidade de permeação do PG(glicosídeo feniletanoide de cistancha) entregues por este ME também foram investigados. A formulação ME otimizada foi composta por miristato de isopropila (7 por cento, p/p), Cremorphor EL (21 por cento, p/p), propilenoglicol (7 por cento, p/p) e água (65 por cento, p/p). A quantidade acumulada de PG(glicosídeo feniletanoide de cistancha) que permeou através da pele de camundongo excisada quando transportado por ME foi ~ 1,68 vezes aquele quando o PG foi transportado apenas por solução salina. A quantidade cumulativa de PG na microemulsão (4149,650±37,3 µg·cm-2) foi significativamente maior que a de PG na solução salina (2288,63±20,9 µg· cm-2). Além disso, o coeficiente de permeabilidade indicou que a microemulsão otimizada foi um carreador mais eficiente para entrega transdérmica de PG do que a solução controle (8,87±0,49 cm/hx10-3 vs. 5,41±0,12 cm/hx10-3). Em conjunto, a capacidade de permeação do PG transportado por ME foi significativamente aumentada em comparação com a solução salina.

cistache

Introdução

Herba cistancha,uma erva tônica comumente distribuída em regiões desérticas, tem sido frequentemente usada na medicina tradicional chinesa. Até o momento, vários estudos foram realizados para investigar suas propriedades biofarmacêuticas, incluindo melhora da memória, potência sexual, eliminação de radicais livres e atividade antienvelhecimento (1). O principal componente de H. cistanche églicosídeo feniletanoide (PG). Estudos anteriores revelaram que o PG inibe a atividade da tirosinase, a enzima limitante da taxa de síntese de melanina no corpo humano (2). Além disso, PG(glicosídeo feniletanoide de cistancha) foi relatado como responsável pela eliminação de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (3) e pela proteção dos queratinócitos da radiação ultravioleta (UV). Portanto, este componente pode ter potencial na despigmentação da pele. A medicação tópica tem sido comumente usada em áreas cosméticas, com a droga administrada diretamente na superfície do corpo (4). Microemulsões (ME) são um novo sistema de liberação de drogas convencionalmente composto de óleo, surfactante, cossurfactante e fases aquosas (5) e tem sido relatado para melhorar a taxa e absorção de drogas lipofílicas (6). Além disso, devido à sua solubilidade satisfatória, baixa irritação da pele e alta permeabilidade, espera-se que seja utilizado na liberação tópica de fármacos (7,8). Até onde sabemos, poucos estudos foram realizados onde o PG foi administrado por meio de medicação tópica usando microemulsão. No presente estudo, um sistema de entrega de nanoemulsão óleo-em-água (O/W) para administração transdérmica foi estabelecido, e PG foi incorporado à nanoemulsão (9,10). Enquanto isso, a preparação e caracterização da nanoemulsão à base de PG foram realizadas investigando a liberação transdérmica in vitro.

Materiais e Métodos Reagentes.

Cremorphor EL e miristato de isopropilo (IPM) foram adquiridos de Sigma Aldrich; Merck Millipore (Darmstadt, Alemanha). Etanol, ácido oleico (OA) e Tween-80 foram adquiridos da Guangcheng Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). O oleato de etilo foi adquirido a Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. (Xangai, China). Todos os produtos químicos e solventes utilizados eram de grau de reagente analítico. Preparação e avaliação da entrega transdérmica à base de microemulsão de glicosídeos feniletanoides Cistanche tubulosa JIANHUA YANG1*, HUAN HUAN XU1-3*, SHANSHAN WU2, BOWIE JU2, DANDAN ZHU2, YAO YAN1, MEI WANG2 e JUMPING HU{{9} } Departamento de Farmácia, Primeiro Hospital Afiliado; 2 Departamento de Medicamentos Naturais, Faculdade de Farmácia, Universidade Médica de Xinjiang, Urumqi, Xinjiang 830011; 3 Departamento de Farmácia, Hospital Kanghua, Dongguan, Guangdong 523003, PR China Recebido em 2 de dezembro de 2015; Aceito em 29 de novembro de 2016, DOI: 10.3892/MMR.2017.6147 Correspondência para: Dr. Junping Hu, Departamento de Medicamentos Naturais, Faculdade de Farmácia, Universidade Médica de Xinjiang, 393 Xinyi Road, Urumqi, Xinjiang 830011, PR China E-mail: hujp0551 @yeah.net * Contribuiu igualmente Palavras-chave: glicosídeo feniletanoide, microemulsão, administração transdérmica, clareador da pele, protetor solar yang et al: PG BASEADO EM ME PARA APLICAÇÃO COSMÉTICA 1110 Preparação de PhGs. PhG(glicosídeo feniletanoide de cistancha) foi preparado como descrito rotineiramente (11).

O seco ao arC. tubulosafoi alimentado e extraído por percolação com 80 por cento de EtOH. O percolado foi evaporado sob pressão, seguido de filtração do fluido residual. O filtrado foi concentrado e cromatografado em uma coluna de resina macroporosa SP-825 usando 0, 30, 50, 70 e 90 por cento de EtOH em água como eluentes. Os eluentes de EtOH 30-50 por cento foram concentrados e secos para obter a fração rica em PhG. A espectrofotometria UV indicou o teor de PhG(glicosídeo feniletanoide de cistancha) foi de 87,6%. Triagem de óleos, surfactantes e cossurfactantes para ME. Testes de solubilidade foram conduzidos para selecionar componentes apropriados para a preparação de uma formulação ME com alta capacidade de carga de drogas. Neste processo, uma quantidade excessiva de PG foi adicionada em 4 ml de cada um dos seguintes reagentes: IPM, parafina líquida, OA, Cremophor EL, Tween‑80, etanol absoluto, propilenoglicol, glicerina e PEG400 , respectivamente. Em seguida, a mistura resultante foi agitada reciprocamente a 37°C por 72 h, seguida de centrifugação a 12.830 xg por 10 min. Subsequentemente, o pellet foi ressuspenso em metanol e o PG foi determinado por espectrofotometria UV a 333 nm. Soluções diluídas apropriadas de óleos, surfactantes e co-solventes em metanol serviram como controle em branco. Construção do diagrama de fases. Para obter uma faixa de concentração de componentes para o limite de microemulsão existente, diagramas de fase pseudoternários foram construídos usando um método de titulação de água conforme descrito anteriormente (12). Diagramas trifásicos foram preparados com razões em peso de 1:3, 1:1 e 3:1 de surfactante para co-surfactante. A fase oleosa e a mistura de surfactante foram então misturadas nas proporções em peso de 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 e 9:1 . A mistura de óleo e surfactante foi misturada homogeneamente e diluída gota a gota com água purificada sob agitação magnética (300 rpm) à temperatura ambiente até a obtenção de ME transparente. A concentração dos componentes foi registrada para completar o pseudo diagrama de fases ternário. Com base nesses diagramas, as concentrações apropriadas de materiais foram selecionadas para a preparação de EM à base de PG. Preparação de ME e da solução aquosa de PG. Um total de 5 MEs (ME1-5) foram selecionados de acordo com os diagramas de fase com uma proporção em peso de surfactante:Cosurfactante de 3:1 (Tabela I). Os sistemas de microemulsão foram preparados misturando óleo com a mistura de surfactante e cossurfactante, e a água foi adicionada precisamente nas fases oleosas com agitação magnética (300 r/min) a 37°C. Os sistemas foram equilibrados usando agitação magnética suave por 30 min seguido por dissolução da quantidade apropriada de PG sob ultra-som. A solução aquosa foi preparada com o mesmo teor de PG dissolvido em água purificada. Caracterização da microemulsão. O tamanho médio das gotículas e o índice de polidispersidade de MEs foram avaliados por espectroscopia de correlação de fótons (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, Reino Unido). Todas as amostras foram diluídas com água na proporção de 1:5 e filtradas através de um filtro de 0,22 µm. O teste foi realizado em uma câmara termostática a 25°C em triplicata. A morfologia das microemulsões de PG foi observada por microscopia eletrônica de transmissão (JEM-100CXII; JEOL Ltd., Tóquio, Japão). Resumidamente, uma gota de amostra diluída foi depositada em uma grade de cobre revestida com filme, seguida de coloração com uma gota de solução aquosa de ácido fosfotúngstico a 2%.

Os diâmetros médios de gotículas das microemulsões foram determinados por instrumento de espectroscopia de correlação de fótons (BI{{0}}SM; Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, EUA) à temperatura ambiente. A viscosidade dos veículos ME foi medida a 25˚C, usando o viscosímetro digital NDJ-8S (Shanghai Precision and Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) com um no. 1 rotor ajustado a 60 rpm. determinação de pH. Os valores de pH dos MEs foram determinados a 25˚C usando o acidímetro digital Phs‑3C (Shanghai REX Instruments Factory, Xangai, China). Os índices de refração foram medidos com um refratômetro termostático Abbe (Optical Instrument Factory, Xangai, China). Preparação de tecidos de pele. Camundongos Kunming machos pesando 20 g foram adquiridos do Experimental Animal Center da Xinjiang Medical University (Xinjiang, China). 10 camundongos (6 semanas de idade) foram submetidos à alimentação adaptativa por 1 semana em um ciclo de 12 h claro/12 h escuro, à temperatura ambiente (24±2˚C), com umidade de 50±15%. Todos os animais tiveram acesso a uma dieta padrão e água. O cabelo foi removido com uma máquina de cortar cabelo elétrica. Após anestesia terminal com hidrato de cloral (10 por cento) por injeção subcutânea, os tecidos da pele foram excisados ​​da região abdominal e a gordura subcutânea e o tecido conjuntivo foram removidos. Os tecidos foram colocados em geladeira a 4°C durante a noite. Os protocolos do estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Xinjiang (Xinjiang, China). Estudo de permeação in vitro. Os experimentos de permeação foram conduzidos como descrito anteriormente (12). A pele excisada foi fixada entre o doador e a câmara receptora de uma célula de difusão vertical com uma área de difusão efetiva de 2,8 cm2. A câmara receptora foi preenchida com soro fisiológico fresco e normal. A célula de difusão foi mantida a 37°C usando um banho de água recirculante e a solução nas câmaras receptoras foi agitada continuamente a 200 rpm. Em seguida, a formulação de teste (1,0 ml) foi colocada suavemente na câmara doadora. Em seguida, 3 ml da solução na câmara receptora foram removidos e substituídos por igual volume de soro fisiológico fresco em intervalos predeterminados (0, 2, 4, 6, 8, 10 e 24 h). A amostra obtida da câmara receptora foi usada para determinar PG(glicosídeo feniletanoide de cistancha)níveis usando espectroscopia UV em um comprimento de onda de 333 nm. A quantidade cumulativa de PG que permeou através da pele de camundongo excisada foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:

Onde Qn foi a quantidade acumulada em um determinado tempo t, Cn é a concentração de droga da solução receptora em cada tempo de amostragem, Ci é a concentração de droga da amostra, S é a área de difusão efetiva (S{{0 }}.8 cm2 ), e V0 e Vi são os volumes da solução receptora e da amostra, respectivamente. O valor acumulado (Qn) de PG(glicosídeo feniletanoide de cistancha)permeado foi plotado em função do tempo (t) para cada formulação. A taxa de permeação de PG em um estado estacionário (Jss, µg/cm-2 /h-1 ) através da pele de camundongo foi calculada a partir da inclinação da porção linear dos gráficos do tempo Qnversus. O coeficiente de permeabilidade (Kp, cm/h) foi calculado de acordo com a seguinte fórmula:

Onde Kp é o coeficiente de permeabilidade, Jss é o efluxo calculado no estado estacionário, e C0representa a concentração do fármaco que permaneceu constante no veículo. Estudo de retenção de pele. As seções a seguir detalham a comparação do comportamento de permeação ex vivo, quantidade cumulativa, taxa de permeação, coeficiente de permeabilidade e características de retenção na pele entre formulações de ME otimizadas (teor de PG, 2 por cento, p/p) e a solução aquosa. No final do experimento de permeação, o nível residual do fármaco na pele foi determinado usando um método de homogeneização. Após lavagem com solução salina normal, a pele foi cortada em pequenas seções e colocada em um tubo de vidro contendo 3 ml de metanol em banho de gelo. A amostra foi homogeneizada com uma velocidade de 12{10}}00 r/min. rpm por 2 min e, em seguida, centrifugado a 12.830 xg horizontalmente por 30 min a 25˚C. O sobrenadante foi passado por um filtro microporoso (0,45 µm), e o PG(glicosídeo feniletanoide de cistancha)os níveis no sobrenadante foram determinados por espectroscopia de UV a um comprimento de onda de 333 nm. Estudo de estabilidade. A estabilidade física do ME carregado com PG foi investigada através da clareza, análise do tamanho das partículas e separação de fases, que foi observada a 2‑8˚C e à temperatura ambiente durante 3 meses. A centrifugação foi realizada a 12.830 xg por 30 min a 25˚C para avaliar a estabilidade física do ME. A separação de fases e a concentração de PG foram investigadas mensalmente para julgar a temperatura ideal de armazenamento. A estabilidade química foi avaliada em formulações carregadas com droga, armazenadas a 2‑8˚C e à temperatura ambiente, com o teor de PG determinado por espectrofotometria UV a 333 nm. Teste de sensibilidade da pele. Testes de sensibilidade cutânea foram realizados em coelhos (pesando 2,02,5 kg) para avaliar o potencial irritante da aplicação tópica da formulação desenvolvida conforme descrito anteriormente (13). Nove coelhos Holland (16 semanas de idade; pesando 2,0-2,5 kg; 5 machos e 4 fêmeas) foram obtidos do Centro Animal Experimental da Universidade Médica de Xinjiang. Os animais foram submetidos à alimentação adaptativa por 1 semana em ciclo de 12h claro/12h escuro, à temperatura ambiente (24±2˚C), com umidade de 50±15 por cento. Todos os animais tiveram acesso a uma dieta padrão e água. A embolia aérea foi usada para o sacrifício. Os protocolos utilizados no presente estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Xinjiang (Xinjiang, China). Os pêlos das costas foram removidos ~24 h antes da administração das formulações ME. Os animais foram divididos nos seguintes grupos: Um grupo ME otimizado (n=3), com administração tópica de ME otimizado contendo 2 por cento (p/p) de PG; um grupo PG salina (n=3), com administração tópica de solução salina contendo 2 por cento (p/p) de PG; e grupo controle de soro fisiológico (n=3), sujeito à administração tópica de soro fisiológico. A administração foi realizada duas vezes ao dia durante 5 dias. Os animais foram observados quanto a quaisquer sinais de coceira ou alterações na pele, incluindo eritema, pápula, descamação e ressecamento (14). Após a retirada da droga, a observação para administrações únicas ou múltiplas foi continuada por 3 dias. Os escores de irritação da área de teste foram avaliados julgando a extensão do eritema e edema de acordo com os seguintes critérios: 1, nenhuma reação visível; 2, uma leve reação; 3, reação moderada e 4, reação grave (15,16). Finalmente, as pontuações totais de irritação para cada condição foram calculadas usando a seguinte equação:

Análise estatística. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. A análise dos dados foi realizada por meio de uma análise de variância unidirecional seguida do teste de diferença menos significativa. Os dados foram analisados ​​usando o software SPSS versão 19.0 (IBM SPSS, Armonk, NY, EUA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultados e discussão

Triagem de óleos, surfactantes e co-surfactantes para ME. PG(glicosídeo feniletanoide de cistancha)foi quase insolúvel em parafina líquida e ácido oleico, mas foi observada solubilidade moderada em IPM (Tabela II). O IPM aumenta o coeficiente de difusão na pele e resulta no aumento do coeficiente de permeação (17,18). Além disso, o IPM é comumente selecionado para a preparação de MEs devido às suas propriedades de aumento de permeação e biocompatibilidade bem conhecidas. A seleção do surfactante é fundamental para a formulação bem-sucedida de MEs, pois contribui para a redução da tensão interfacial, formando um filme na interface óleo-água (19). No presente estudo, o PG apresentou uma maior solubilidade em Cremophor-EL (40,193 mg/ml; Tabela II) em comparação com Tween-80 (28,051 mg/ml; Tabela II). Portanto, CremophorEL foi selecionado para uso em estudos posteriores devido ao seu perfil de solubilidade e seu baixo nível de toxicidade como surfactante não iônico. Além disso, sua solução aquosa demonstrou boa solubilidade do PG. A maior solubilidade do PG entre os cotensioativos foi observada no propilenoglicol (48,714 mg/ml; Tabela II). Além disso, o propilenoglicol tem a capacidade de formar MEs com IPM e CremophorEL. Juntos, IPM, CremophorEL e propilenoglicol foram usados ​​como fase oleosa, surfactante e cosurfactante, respectivamente, para a formulação de MEs carregados com PG. Construção de diagramas de fases pseudoternários. No presente estudo, diagramas de fase foram construídos para selecionar a faixa de concentração dos componentes para as microemulsões, e as áreas marcadas indicam a região O/WME clara (Fig. 1). Uma estreita relação entre o efeito de hidratação do estrato córneo e a permeação dérmica foi relatada anteriormente (20), e a atividade termodinâmica de drogas em MEs foi uma força motriz significativa por trás da liberação e penetração de drogas na pele (20,21). ). A atividade termodinâmica de drogas em ME com menor teor de mistura de surfactante demonstrou ser uma importante força motriz para a liberação e penetração da droga na pele (22,23).

The decreased concentration of surfactant in dispersed systems may also increase the rate of drug release and its permeation in the skin (24,25). Thus, the water content ranged between 50 and 70%, while that of the surfactant and cosurfactant ranged between 20 and 45%. The microemulsion domain was determined by visual inspection for clarity and fluidity. The rest of the region in the phase diagrams represents turbid and conventional emulsions based on visual observation (Fig. 1). No liquid crystalline structure was observed using the cross polarizer. The area of the O/W ME region was expanded following the increase of the Km value (Fig. 1). These findings were consistent with previous studies, which demonstrated that a higher level of surfactant reduces interfacial tension of the colloidal solution more effectively, thereby improving the fluidity of the interface and increasing the entropy of the system (21,24). Thus, it is reasonable to speculate that the effect of CremophorEL on ME regions depends on the other ME components, especially the cosurfactant. The combination of short to medium carbon chain length alcohols, including propylene glycol, with single-chain surfactants, may lower interfacial tension due to increased fluidity at the interface. Additionally, medium carbon chain length alcohols may induce elevation of miscibility of the aqueous and oily phases due to the partitioning behavior between the two phases. Finally, in the presence of a Km ratio of 3:1, the ratio of the surfactant mixture to oil was 1:9 or 2:8. MEs prepared with a ratio of surfactant mixture to oil >2:8 eram turvas e instáveis ​​(Fig. 2).

As composições finais de ME1-5 estão listadas na Tabela I. Preparação e caracterização de ME. As propriedades físicas de ME1-5 estão listadas na Tabela III. Os sistemas dispersos eram macroscopicamente idênticos, homogêneos e transparentes, sem precipitados. Os tamanhos médios de gotículas desses MEs variaram entre 30,56 e 79,21 nm (Fig. 3; Tabela III), com valores de índice de polidispersidade variando entre 0,187 e 0,321 (Tabela III). Isso indicou um ME uniforme com uma distribuição de tamanho estreita. Além disso, o tamanho das gotas aumentou em proporção com o teor de óleo, mas diminuiu com o teor da mistura de surfactante. Este fenômeno pode ser atribuído à expansão do núcleo de óleo ME, e a alta concentração de surfactante reduzindo fortemente a tensão interfacial óleo-água para reduzir o tamanho das gotículas. Além disso, a viscosidade ME foi elevada como resultado do aumento do nível de surfactante e diminuição da água. Os valores de pH de todos os MEs ficaram dentro da faixa apropriada de 5.0-7.5 (Tabela III) e, portanto, foram compatíveis com os dos tecidos da pele. Em relação à estabilidade física, não foi observada separação de fases, quebra ou precipitação do fármaco em nenhum dos MEs testados, indicando que os MEs possuíam estabilidade termodinâmica satisfatória frente à centrifugação. O teste de solubilidade do corante revelou que um corante solúvel em água (laranja de metila) distribuiu-se uniformemente por todo o sistema ME, o que implicou que o ME formado era do tipo O/W (dados não mostrados). As micrografias revelaram gotículas individuais ME5 separadas com um contorno esférico (Fig. 4). Exvivo estudo de permeação cutânea. Os perfis de permeação de todos os veículos testados seguiram a cinética de liberação de ordem zero (26,27) e ME5 forneceu o maior fluxo transdérmico de PG (86,795±0,23 µg/cm{{28 }} /h-1; Fig. 5; Tabela III). No presente estudo, foram determinados os efeitos do teor de óleo e da mistura de surfactante na permeação cutânea do PG. Os resultados indicaram que os surfactantes aumentam a permeação da pele aumentando a fluidez da membrana, a solubilização do fármaco e a extração de lipídios do estrato córneo. A taxa de permeação de ME5 (86,795±0,23µg/cm-2 /h-1) foi significativamente aumentada em comparação com as taxas de permeação de ME1 (69,57±{ {48}},78, P=0.0094), ME2 (44,326±0,84, P{{50}}) .0052), ME3 (79,859±0,12, P=0,039) e ME4 (58,332±0,39 µg/cm-2 /h-1 , P=0.0063, Fig. 5; Tabela III) Isso foi consistente com os resultados de um estudo anterior, no qual a atividade termodinâmica da carga de droga ME pode diminuir com o aumento dos níveis de surfactante (12,28 ). A viscosidade de ME5 (30,43±0,12 mPa.s) foi menor em comparação com os outros ME1 (80,51±0,87 mPa.s, P=0,0076), ME2 (47,52±0,54 mPa.s, P{{88 }}.0089), ME3 (60,49±1,34 mPa.s, P=0.0094) e ME4 (43,27±0,21 mPa.s, P=0.0059).