Parte 1: Mapeando a interação epigenômica e transcritômica durante a formação e recuperação da memória no Engrama Hippocampal Ensemble

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Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila-Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1Picower Institute for Learning andMemória, Instituto de Tecnologia de Massachusetts, Cambridge, Massachusetts, EUA.

2Departamento de Cérebro e Ciências Cognitivas, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, EUA.

3Laboratório de Ciência da Computação e Inteligência Artificial, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, EUA.

4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, EUA.

5Broad Institute of Harvard and MIT, Cambridge, Massachusetts, EUA.

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Abstrato

O epigenoma e a arquitetura genômica tridimensional (3D) estão emergindo como fatores-chave na regulação dinâmica de diferentes programas transcricionais necessários para as funções neuronais. Aqui, utilizamos um sistema de marcação dependente de atividade em camundongos para determinar o estado epigenético, a arquitetura do genoma 3D e a paisagem transcricional de células de engrama ao longo da vida útil dememóriaformação e recordação. Nossos achados revelam quememóriaa codificação leva a um evento de iniciação epigenética, marcado por maior acessibilidade de intensificadores sem alterações transcricionais correspondentes.Memóriaa consolidação subsequentemente resulta em reorganização espacial de grandes segmentos de cromatina e interações promotor-potenciador. Finalmente, com a reativação, os neurônios do engrama utilizam um subconjunto de interações de novolong-range, onde intensificadores iniciados foram colocados em contato com seus respectivos promotores para regular os genes envolvidos na tradução de proteínas locais em compartimentos sinápticos. Coletivamente, nosso trabalho elucida a transcrição abrangente e os Usuários podem visualizar, imprimir, copiar e fazer download de textos e dados-mine o conteúdo de tais documentos, para pesquisa acadêmica, sempre sujeito às condições completas de uso:http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Correspondência para: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Contribuições do autor:

AM e L.-HT conceituaram e desenharam o projeto. AM e AZ realizaram experimentos comportamentais, ISH, imunocoloração e análise MARIS. CA realizou injeção de vírus e imunomarcações. AM e HSM realizaram experimentos ATAC-seq. AM e AZ realizaram experimentos nucleares de RNA-seq. AM, HSM e VD realizaram experimentos pc-Hi-C e Hi-C. AM, HSM, VD, RMR e JDV realizaram análise ATAC-seq. AM, RMR, HSM, VD e FG realizaram análise nuclear de RNA-seq. AM, VD, HSM e RMR realizaram análises pc-Hi-C e Hi-C. Todos os autores ajudaram a interpretar os dados. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK e LHT escreveram o manuscrito com a contribuição de todos os autores. A LHT forneceu as ferramentas e supervisionou o projeto.

Interesses competitivos:

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

a paisagem epigenômica ao longo da vidamemóriaformação e recordação no conjunto do engrama hipocampal.

A formação e preservação de memórias de longo prazo dependem da expressão gênica coordenada e da síntese de proteínas sinápticas1. Esses processos moleculares atuam dentro de uma população específica de neurônios, denominadas células de engrama2–4. Abordagens recentes usando expressão dependente de atividade de repórteres forneceram uma estrutura para explorar o conjunto de engramas5-8, mas os mecanismos moleculares que governammemóriaarmazenamento e recuperação permanecem mal compreendidos. Especificamente, as modificações epigenéticas e a arquitetura genômica 3D estão emergindo como um fator chave na regulação dinâmica da expressão gênica9-17, e há uma crescente valorização de sua importância na função neuronal, desenvolvimento e doença14, 16, 18

Aqui, utilizamos o modelo de camundongo de recombinação direcionada em populações ativas (TRAP)5,6, no qual neurônios ativados expressando o gene da proteína associada ao citoesqueleto regulado por atividade (Arc), são marcados permanentemente de maneira indutível. Neurônios ativados durantememóriacodificação, consolidação e recuperação foram classificadas e submetidas a sequenciamento de RNA nuclear (nRNA-seq), Ensaio de Cromatina Acessível por Transposase usando sequenciamento (ATAC-seq) e captura de conformação cromossômica (Hi-C). Nossos dados demonstram quememóriaA codificação leva a um aumento em todo o genoma na acessibilidade da cromatina, sem mudanças esperadas na expressão gênica. Além disso, demonstramos que a fase tardia da consolidação da memória foi associada à relocalização de grandes segmentos de cromatina (subcompartimentos) de ambientes inativos para ambientes permissivos e à reorganização do cenário de interação promotor-potenciador. Finalmente, a reativação dos neurônios durantememóriaA recordação está associada a interações denovopromotor-potenciador, utilizando um grande subconjunto de potenciadores que foram iniciados durantememóriacodificação. Essas interações promotor-potenciador estão associadas a uma mudança robusta na expressão de genes envolvidos na síntese proteica local e na morfogênese sináptica.

Resultados

Identificação temporal e espacial de células de engrama ativadas e reativadas

O rastreamento da atividade neuronal ao longo do tempo tem sido um dos maiores desafios no estudo de células de engrama, pois os marcadores de atividade neuronal, conhecidos como genes precoces imediatos (IEGs), retornam à linha de base logo após a indução1,2. Para superar essa limitação, aproveitamos o modelo TRAP5,6, que requer dois transgenes, um que expressa CreERT2 a partir de um promotor Arc dependente de atividade e outro que permite a expressão do repórter da proteína fluorescente amarela (eYFP), em um Cre- maneira dependente. A administração de tamoxifeno (TAM) aos camundongos TRAP resulta em um rótulo eYFP permanente nos neurônios Arc ativados. Sem TAM, CreERT2 é retido no citoplasma e eYFP não é expresso (Dados estendidos Fig. 1a). Camundongos TRAP foram submetidos ao paradigma clássico pavloviano de condicionamento de medo contextual (CFC) (Fig. 1a), um método comumente empregado para estudar memórias aversivas19. Aproximadamente 1,5 a 2 horas após a exposição ao FS, os cérebros foram coletados para identificar i) RNA de ligação à proteína fox-1 homólogo 3 (Rbfox3) também conhecido como NeuN plus e eYFP plus neurônios marcados que foram ativados durante a exposição inicial (ativado -precoce), que pode ser distinguido de ii) NeuN mais /eYFP- neurônios de estado basal não ativados (Basal) (Fig. 1a). Após cinco dias, na ausência de recuperação, coletamos iii) NeuN mais /eYFP mais neurônios que foram marcados no dia do treinamento, denotandomemóriaconsolidação (ativado-tardio). Em um

coorte diferente, os camundongos foram reexpostos ao estímulo condicionado e a expressão da proteína ARC endógena subsequente foi testada 1,5 a 2 horas após a reexposição. Isso possibilitou a identificação de iv) NeuN plus /eYFP plus /eYFP plus/neurônio endógeno mais engrama positivo duplo que foram ativados durante o treinamento e reativados durantememóriarecall (Reativado). Notavelmente, embora a recombinação do DNA possa não ocorrer totalmente 1,5-2 h após o FS, observamos alta co-localização (média de 84%) entre a proteína Arc endógena e o repórter Arc:eYFP (Dados Estendidos Fig. 1b), que também foi consistente com relatórios anteriores20.

Confirmarmemóriacodificação e recordação durante o CFC, o comportamento de congelamento foi registrado durante o treinamento e reexposição a pistas indutoras de medo (Dados Estendidos Fig. 1c). Consistente com as publicações anteriores6,20, nossos dados mostraram um aumento significativo no número de neurônios eYFP plus (ativado-precoce e tardio) no hipocampo, em comparação com camundongos que permaneceram virgens de CFC em sua gaiola (F (2, 70)=240.3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

A formação da memória está associada ao aumento da acessibilidade à cromatina, predominantemente em potenciadores

Para entender melhor as forças moleculares que governam diferentes programas de transcrição, medimos as mudanças de acessibilidade da cromatina em todo o genoma em diferentes fases dememória. Os tecidos do hipocampo foram reunidos e os núcleos isolados (Dados Estendidos Fig. 2a, Tabela Suplementar 1) foram submetidos à preparação da biblioteca ATAC-seq. A análise de regiões diferencialmente acessíveis (DARs) (Diffbind, modo DESeq2) entre todas as populações (Fig. 2a) revelou que a maioria das mudanças no estado da cromatina ocorre durante a fase inicial da formação da memória, onde 7,862 regiões em todo o genoma ganham acessibilidade (Basal vs. Precoce, Tabela Suplementar 2). Em contraste, observamos mudanças relativamente mínimas no estado da cromatina ao fazer a transição de ativado-precoce para ativado-tardio (582 DARs) e entre neurônios ativados-tardios e reativados (725 DARs), com 48% de sobreposição entre eles (Dados Estendidos Fig. 2b ). Notavelmente, identificamos uma grande porcentagem (52%) de DARs ganhos de forma estável que se tornaram mais acessíveis em Ativado-precoce e permaneceram acessíveis em ambos os neurônios Ativado-tardio e Reativado (Fig. 2b,c; Tabela Suplementar 2). Curiosamente, enquanto ambas as mudanças iniciais (Basal vs. Precoce) e DARs ganhas de forma estável foram enriquecidas para regiões intergênicas, as alterações tardias de cromatina (Precoce vs. Tardia e Tardia vs. Reativada) foram enriquecidas principalmente para os sítios promotores (Fig. 2d).

A percepção funcional foi obtida avaliando como os DARs são marcados por diferentes modificações de histonas. Primeiramente, utilizamos o ChromHMM para estabelecer um modelo de estado da cromatina a partir de dois estudos independentes que utilizaram tecido hipocampal em massa antes e após o choque no pé 21,22. Em seguida, realizamos uma análise de enriquecimento de dobras (observada sobre a distribuição esperada) dos DARs para esses diferentes estados e revelamos que as alterações iniciais da cromatina e os DARs estáveis ​​foram enriquecidos para marcas de intensificadores (Fig. 2e; Dados Estendidos Fig. 2c, Tabela Suplementar 3) .

Esses resultados estão de acordo com publicações anteriores, mostrando que estimular a cultura neuronal primária induz a atividade intensificadora prolongada12,23. Em seguida, analisamos a sobreposição de loci estáveis ​​individuais com o H3K4me1 e H3K27ac21. Essas duas marcas de histonas delineiam diferentes populações de intensificadores, que podem ser 'preparados' (somente H3K4me1), 'ativos' (H3K4me1 e H3K27ac) ou 'latentes' (sem marcas)18. Os picos estáveis ​​mostraram uma distribuição entre os intensificadores iniciados e ativos (Dados estendidos Fig. 2d), onde 47 por cento desses locais foram previstos como 'latentes' (sem sobreposição entre DARs e marcas de histonas21 obtidas 1h após FS). Para confirmar nosso modelo, realizamos imunoprecipitação de cromatina (ChIP) para marcadores de histonas H3K4me1 e H3K27ac, seguida de qPCR. Quatro locais selecionados foram escolhidos a partir de nossa análise de modelagem de potencializador putativo (Dados estendidos Fig. 2d; Enhancer 1 - predito iniciado, Enhancer 2- previsto ativo, Enhancer 3 e 4 - previsto latente). De acordo com nosso modelo, identificamos dois loci 'latentes' no estado basal (Enhancers 3 e 4) que se transformaram em um estado 'ativo' durantememóriaformação (Fig. 2f). Além disso, o potencializador putativo 1 foi 'iniciado' no estado basal e tornou-se ativo, onde houve um aumento estável significativo nos marcadores H3K27ac durante a fase tardia e recuperação (Fig. 2f). Juntos, esses dados indicam que o repertório de intensificadores recém-acessíveis foi expandido nos neurônios do engrama potencializados, onde regiões latentes ou iniciadas ganharam marcas H3K4me1 e H3K27ac e, assim, tornaram-se intensificadores ativos.

Para entender o papel funcional de promotores acessíveis e regiões potenciadoras, realizamos análise de enriquecimento de motivo (Tabela Suplementar 4). Nossos dados indicam que a maioria (70%) dos motivos em promotores acessíveis são igualmente enriquecidos e foram identificados em todas as fases dememória(Dados Estendidos Fig. 2e). Em contraste, a maioria dos locais de potenciadores mostrou padrões distintos de motivos de ligação ao fator de transcrição (TF) em diferentes fases de memória. Curiosamente, os motivos ubiquamente expressos do Proto-Oncogene Jun, Subunidade do Fator de Transcrição Ap-1 (ou seja, Jun-Ap1) e da família de TFs do Fator Regulador X (Rfx), foram significativamente enriquecidos somente após a fase inicial de codificação (Dados Estendidos Fig. 2e). Foi relatado anteriormente que o complexo Jun-Ap1 desempenha um papel central na seleção de intensificadores e pode atuar como um TF pioneiro para definir locais de intensificadores durante o desenvolvimento cerebral e atividade neuronal12,24. Esses achados são consistentes com nossos dados que mostraram uma alta porcentagem de loci latentes/iniciados no estado basal (Fig. 2f, Dados Estendidos Fig. 2c,d). Assim, parece que a atividade neuronal pode desencadear a ligação de Jun-Ap1 a potenciadores latentes, que então recruta modificadores de cromatina que ativam potenciadores latentes. Da mesma forma, o enriquecimento dos motivos do fator de transcrição Yin Yang 1 (Yy1) apenas em intensificadores dos estados inicial e tardio, sugere que a organização promotor-intensificador é um processo ativo dememóriaformação, pois foi relatado recentemente que Yy1 facilita a formação dessas interações de longo alcance25. Coletivamente, esses dados sugerem que a fase inicial dememóriaA formação altera a paisagem de acessibilidade da cromatina em neurônios ativados, com mudanças estáveis ​​de longa duração ocorrendo predominantemente nas regiões intensificadoras.

Mudanças dinâmicas na arquitetura nuclear espacial e acessibilidade da cromatina durantememóriaformação correspondem com o aumento da frequência de interações promotor-potenciador durantememórialembrar

A arquitetura nuclear 3D está emergindo como um fator chave na regulação dinâmica da expressão gênica, em muitas funções neuronais26–28. Portanto, estávamos interessados ​​em delinear as mudanças precisas que ocorrem na organização espacial da cromatina durantememóriaformação e consolidação. Produzimos dados Hi-C de estado basal e eYFP mais neurônios marcados (precoce e tardio, Tabela Suplementar 5). A cromatina é segregada em dois compartimentos subnucleares espacialmente distintos, 'A' e 'B', correspondendo à cromatina transcricionalmente ativa e inativa, respectivamente15,16,26. Evidências iniciais sugerem que a atividade neuronal e a sinalização extrínseca podem induzir uma reorganização da arquitetura da cromatina 3D14,27,28. Nossa análise do estado do compartimento 15, 16,26 (Fig. 3a-c) revelou a relocalização de grandes segmentos de cromatina do ambiente inativo (B) para o ambiente permissivo (A) (e vice-versa) durante a fase inicial e tardia damemóriaformação (212 segmentos trocados de A para B, 127 de B para A, tamanho médio de ~ 436 Kbp). Curiosamente, 52 por cento das regiões na fase inicial que mudaram de B para A mantiveram esse estado na fase tardia (ou seja, permaneceram no estado A, Fig. 3b,c; Tabela Suplementar 6). Além disso, quase todas essas regiões se sobrepuseram com DARs ganhos de nossa análise ATAC-seq, confirmando a transição do subcompartimento de inativo para o ambiente permissivo (Fig. 3d). Esses dados indicam que alguns loci sofrem troca de subcompartimentos em diferentes fases da memória e, portanto, podem contribuir para mudanças de longo prazo nas propriedades e funções neuronais após a ativação inicial.

Embora nossos dados de Hi-C sugerissem uma reorganização em larga escala, não ficou claro se essa reorientação permitiu a interação de novos repertórios de promotor-intensificador e o ajuste fino de diferentes programas de transcrição (Fig. 3e). Utilizando a técnica de captura de promotor Hi-C (pc-HiC), estudamos as mudanças precisas que ocorrem nas interações promotor-potenciadores durante o processo dememóriaformação e recordação. Para este estudo, usamos "iscas" personalizadas visando ~5000 promotores29. De acordo com publicações anteriores29, detectamos ~19.000 (por grupo) interações significativas de promotores-potenciadores (67,5%) e promotores-promotores (46,2%) (Dados Estendidos Fig. 3a,b).

Uma vez que os promotores no cérebro de mamíferos podem estar sob o controle de múltiplos elementos reguladores14,30,31, analisamos a sobreposição entre todos os potenciadores que interagem e seus respectivos promotores. Descobrimos que durante cadamemóriafase, os mesmos promotores interagem com mais frequência com um subconjunto distinto de intensificadores (ou seja, único, Basal - 3243, Early - 7602, Late - 7028, Reativado - 7244; Fig. 4a,b; Extended Data Fig. 3c; Tabela Suplementar 7). Este resultado é consistente com publicações anteriores que mostram que múltiplos potenciadores envolvendo vários genes (c-Fos e Arc) são cruciais para sua ativação e sua frequência de interação com seus respectivos promotores é alterada em resposta a vários agentes despolarizantes em neurônios cultivados31. Também identificamos um subconjunto menor de interações em que os promotores estavam interagindo com os mesmos potenciadores em diferentesmemóriafases (ou seja, comum, ~31 por cento de todas as interações; Tabela Suplementar 7). Além disso, os neurônios reativados apresentaram pontuações de interação significativamente mais fortes (conforme calculado por Chicago, Fig. 4b; Dados Estendidos Fig. 3d). Portanto, embora o número de interações únicas tenha sido semelhante nos estados inicial, tardio e reativado, pontuações de interação mais fortes indicam que interações promotor-potenciador específicas ocorrem com mais frequência durante a memória.

lembrar. Esta noção foi ainda validada por experimentos 3C, com primers projetados para medir a frequência de interação entre o potenciador selecionado (E) e os promotores do gene (P) que codificam para a subunidade D do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (Eif3d) ou receptor de glutamato, ionotrópico, cainato 3 (Grik3) (Fig. 4c). Nossos dados mostraram que neurônios reativados tiveram um aumento significativo na frequência de interação entre o promotor Eif3d e o potenciador selecionado, em comparação com as outras populações (Fig. 4c). Coletivamente, esses dados indicam que as interações promotor-potenciador ocorrem com mais frequência durantememórialembrar.

Em seguida, perguntamos se as interações dinâmicas de longo alcance identificadas via pc-HiC correspondem a regiões de cromatina que se tornam mais acessíveis, conforme determinado via ATAC-seq. Isso confirmaria que o aumento da acessibilidade tem uma consequência funcional em trazer novas interações promotor-potenciador. Para conseguir isso, comparamos a sobreposição entre os intensificadores de interação em cada população de células para DARs (observados) ou um conjunto aleatório de loci genômicos acessíveis (esperado). Nossa análise revelou uma sobreposição significativa entre ambos os DARs adquiridos em neurônios ativados precoces e DARs ganhos de forma estável com os intensificadores de interação, em todas as populações de células (All Ps < 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 3e).="" em="" contraste,="" as="" mudanças="" na="" acessibilidade="" da="" cromatina="" que="" ocorreram="" durante="" a="" fase="" tardia="">memóriaconsolidação e reativação não se sobrepuseram significativamente com intensificadores de interação (Dados Estendidos Fig. 3e). Juntos, esses resultados indicam que o ganho de acessibilidade durante a codificação da memória é um evento de iniciação e esses loci iniciados se envolvem em interações promotor-potenciador funcionais de novo durante as fases posteriores dememóriaformação. Essa paisagem dinâmica é ilustrada visualizando as regiões genômicas em torno do gene eucariótico da subunidade A (Eif5a) do fator de iniciação da tradução 5 (Fig. 4d). Esta dissecção molecular temporal do tempo de vida do engrama destaca como o priming coordenado do estado epigenético de uma célula durantememóriacodificação e consolidação facilitam as interações de longo alcance durante a reativação.