Parte 1|Extrato de Herba Cistanche aumenta a geração de ATP mitocondrial em corações de ratos e células H9c2
Mar 04, 2022
Contato: emily.li@wecistanche.com
Hoi Yan Leung e Kam Ming Ko
Departamento de Bioquímica, Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, China
Palavras-chave: ATP,Cistanche deserticola, células H9c2, coração, mitocôndrias
Abstrato
Investigar a base farmacológica do "Yang- revigorante"ação de Herbal Cistanche [a planta inteira seca deCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)], na medicina chinesa, os efeitos do extrato metanólico de Herba Cistanche na capacidade de geração de ATP mitocondrial foram examinados usando um modelo de coração de rato ex vivo e um ensaio de células H9c2 in situ. O tratamento com extrato de Herba Cistanche aumentou a capacidade de geração de ATP mitocondrial do miocárdio de maneira dose-dependente em ratos, conforme avaliado por medição in vitro. A estimulação da capacidade de geração de ATP foi associada a um aumento paralelo no transporte de elétrons mitocondrial suportado pelo piruvato, mas não pelo succinato. O tratamento com Herba Cistanche também aumentou as atividades do complexo mitocondrial I e III do miocárdio, sendo a extensão da estimulação na atividade do complexo I maior. O tratamento com Herba Cistanche produziu um aumento dependente da dose e do tempo na capacidade de geração de ATP mitocondrial em células H9c2. Os resultados indicam que o tratamento com Herba Cistanche podeaumentar a geração de ATP mitocondrialem corações de ratos ex vivo e células H9c2 in situ, possivelmente atravésaumentando a fosforilação oxidativa.
Introdução
O "revigoramento yang", que incorpora o aprimoramento generalizado da função do corpo na medicina chinesa, envolve o uso de energia na condução de vários processos bioquímicos.
A este respeito, o ATP, que é a moeda universal de energia para alimentar a função celular, é gerado principalmente através da fosforilação oxidativa nas mitocôndrias. Postulamos que as ervas "Yang revigorantes"possuem a capacidade de aumentar a capacidade de geração de ATP mitocondrial(Ko et al., 2004). Isso é apoiado por nossa recente descoberta de que ervas tonificantes chinesas "revigorantes do Yang", mas não "nutridoras do Yin", podem aumentar a capacidade de geração de ATP do miocárdio em corações de camundongos ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, a planta parasita inteira seca (excluindo a flor) de Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), é classificada como'"erva tonificante tonificante do Yang na medicina tradicional chinesa (Chen, 1998), e aparece como o ingrediente mais popular em várias formulações de patentes chinesas usadas para o revigoramento do Yang". Na China e no Japão, a Herba Cistanche é amplamente utilizada para o tratamento de uma série de sintomas de deficiência de Yang. Estudos farmacológicos indicaram que Herba Cistanche poderiaeliminar radicais livres(Xiong et al., 1996),produzir sedativo(Lu, 1998),anti-envelhecimento(Lee et al., 1990),efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios(Lin et al., 2002), emelhorar a função imunológica(Wu et al., 2005). O principal ingrediente ativo de Herba Cistanche églicosídeos feniletanoides(Ouyang et al., 2003), que foram encontrados para terantibacteriano, antiestresse e antioxidante(Xiong et al., 1998), bem como efeitos antiapoptóticos em neurônios cultivados (Tian & Pu, 2005). No presente estudo, a fim de investigar a base farmacológica da ação revigorante do Yang de Herba Cistanche, foram examinados os efeitos do tratamento com Herba Cistanche na capacidade de geração de ATP em mitocôndrias isoladas de corações de ratos ex vivo e cardiomiócitos H9c2 cultivados in situ. Para explorar o mecanismo bioquímico subjacente à ação de aumento da geração de ATP, os efeitos do tratamento com Herba Cistanche no transporte de elétrons mitocondrial e nas atividades do complexo I-IV também foram examinados em corações de ratos.
Os ingredientes eficazes de Cistanche podem eliminar vários radicais livres de oxigênio ativo
Materiais e métodos
Produtos químicos, cultura de células e materiais à base de plantas
ATP, ADP e 3-[4,5-dimetiltiozol-2-il]-2,5-brometo de difenil-tetrazólio (MTT) foram adquiridos da Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EUA). A solução de luciferase (ATPlite) foi obtida da PerkinElmer (Boston, MA, EUA). O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e soro fetal bovino (FBS) foram adquiridos da GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). A linha celular H9c2 foi adquirida da ATTC (Rockville, MD, EUA). Herba Cistanche foi fornecido por um negociante de ervas local (Lee Hoong Kee). A erva foi autenticada pelo fornecedor e um espécime de comprovante (HKUSTY00301) foi depositado no Departamento de Bioquímica da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong (HKUST).
Extração de ervas
Herba Cistanche (100g) foi cortada em pedaços pequenos e então extraída por aquecimento sob refluxo em 300 mL de metanol a 65◦C por 2 h. O procedimento foi repetido duas vezes. O extracto reunido foi seco evaporando o solvente sob pressão reduzida e o extracto metanólico de Herba Cistanche foi obtido com um rendimento de 39 por cento (p/p). A análise química indicou que o extrato de metanol de Herba Cistanche continha saponinas totais, flavonóides totais, lignanas totais e polissacarídeos em concentrações de 1,62 por cento (p/p), 0,08 por cento, 0,15 por cento e 75,6 por cento, respectivamente.
Cuidados com animais
Ratos Sprague-Dawley machos adultos (8–10 semanas; 250–300g) foram mantidos sob um ciclo 12-h escuro/claro em uma sala com controle de ar/umidade a cerca de 22◦C e comida e água permitidas ad libitum nas instalações de cuidados com animais em HKUST. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Prática de Pesquisa do HKUST.
Tratamento medicamentoso
Os animais foram divididos aleatoriamente em grupos, com cinco a seis animais em cada. Nos grupos de tratamento, os ratos foram administrados intragástricamente com o extrato metanólico de Herba Cistanche (dissolvido/suspenso em água) em doses diárias crescentes ({{0}},031–0,5 g/kg) por 3 dias. Os animais controle receberam apenas água. Vinte e quatro horas após a última dosagem, o coração foi obtido de animais anestesiados com fenobarbital e submetido à análise bioquímica.
Preparação de frações mitocondriais e medição da capacidade de geração de ATP (ATP-GC) ex vivo
As amostras de tecido do ventrículo esquerdo do coração foram excisadas e lavadas com tampão isotônico gelado (0,32 M de sacarose, 1 mM de EDTA, 50 mM de Tris/HCl, pH 7,4). As frações mitocondriais cardíacas foram preparadas por centrifugação diferencial em tampão isotônico a 4◦C. Um homogenato cardíaco de 10 por cento (p/v) foi preparado homogeneizando o tecido ventricular picado com um homogeneizador de vidro de Teflon a 4000 rpm por 20-30 golpes completos. O homogenato foi centrifugado a 600 × g por 10 min para remover núcleos e detritos celulares. O sobrenadante foi então centrifugado a 8000 × g por 30 min para sedimentar as mitocôndrias (Evan, 1992). Os pellets foram ressuspensos em 1 mL do tampão isotônico e reconstituídos as frações mitocondriais. O ATP-GC mitocondrial de animais não tratados foi medido pelo método de Leung et al. (2005)
Os polissacarídeos de cistanche podem retardar a degeneração fisiológica dos órgãos e a degeneração da morfologia celular
Medição do transporte de elétrons mitocondrial
A medida do transporte de elétrons em mitocôndrias isoladas, que se baseia na redução do MTT, realizada[1] conforme descrito por Cohen et al. (1997). As mitocôndrias foram preparadas a uma concentração de proteína de 1 mg/mL com um tampão de incubação (250 mM de sacarose, 50 mM de HEPES, 10 mM de KH2PO4, 2 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, pH 7,4) . Uma alíquota (40 µL) das mitocôndrias foi misturada com 100 µL cada de 15 mM de piruvato ou 0,5 mM de succinato e 0,42 mg/mL de MTT. A mistura de reação foi incubada a 37◦C por 10 min com agitação suave. Após a incubação, a mistura de reação foi terminada pela adição de 100 µL de tampão de lise (10 por cento, p/v, dodecil sulfato de sódio e 45 por cento de dimetilformamida, ajustado para pH 4,7 com ácido acético glacial). Após repouso por 5 min, as leituras de absorbância da mistura de reação foram feitas com um leitor de placas de microtitulação (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e relatadas como a diferença entre 570 nm e 630 nm. Os dados foram expressos como uma porcentagem do valor médio do grupo controle (ou seja, Herba Cistanche não tratado).
Cultura de células
Células H9c2, uma linha celular permanente derivada de mioblastos cardíacos (Hescheler et al., 1991), foram cultivadas como monocamadas em DMEM suplementado com 10 por cento (v/v) de FBS. O meio continha glicose (4,5 g/L) e glutamina (4,5 mM), suplementado com NaHCO3 (17 mM), penicilina (100 IU/mL) e estreptomicina (100 µg/mL). Todas as células foram cultivadas sob uma atmosfera de 5 por cento (v/v) de CO2 em ar a 37◦C. O meio foi substituído por meio fresco a cada 2 ou 3 dias. Um estoque de células foi cultivado em um frasco de cultura de 75 cm2 e dividido antes da confluência em uma proporção de subcultivo de 1:10. Para o ensaio ATP-GC, as células H9c2 foram semeadas a uma densidade de 2,5 × 104 células/poço em uma placa 24-poço. Após a fixação das células, o extrato de Herba Cistanche (dissolvido em solução salina tamponada com fosfato; PBS) foi aplicado no meio e as células foram incubadas por períodos crescentes (2-16 h) de tempo. As células de controle (não tratadas) receberam apenas PBS.
Medição de ATP-GC in situ
Após os períodos indicados de incubação com extrato de HerbaCistanche em concentrações crescentes (5{{10}}–300µg/mL), foi realizado o ensaio ATP-GC. O meio foi aspirado e as células foram tratadas com digitonina (50µg/mL) em um tampão de incubação (120 mM KCl, 5 mMKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2,0,5 por cento BSA, pH 7,4) por 3 min a 37 ◦C. Após a aspiração da digitonina, glutamato (5 mM), malato (5 mM) e ADP (60 µM) foram adicionados às células para geração de ATP mitocondrial, que foi monitorada em intervalos de tempo crescentes de 0 a 15 min. A reação foi terminada pela adição de 60 µL de ácido perclórico (30 por cento, p/v), e as misturas de reação foram então centrifugadas a 600 × g por 10 min a 4◦C. Uma alíquota (120 µL) do sobrenadante foi misturada com 90 µL de KHCO3 1,4 M para neutralização. As misturas foram centrifugadas novamente a 600 × g a 4◦C, e os sobrenadantes foram medidos quanto ao teor de ATP, conforme descrito anteriormente. O ATP-GC das células não tratadas foi estimado calculando a área sob a curva do gráfico (AUC1) plotando o ATP gerado (nmol/mg de proteína) contra o tempo (0-15 min) e expresso em unidades arbitrárias. Para células tratadas com HerbaCistanche, os valores de AUC1 de tempos de incubação crescentes (3, 5, 7, 10 e 15 min) foram normalizados para um valor de controle médio respectivo de amostras não tratadas e expressos como controle percentual. Em seguida, a área sob a curva (AUC2) do gráfico que representa os valores percentuais de controle em relação ao tempo de incubação (3-15 min) foi calculada e expressa em unidades arbitrárias. Os dados dos grupos tratados com Herba Cistanche foram expressos como uma porcentagem do controle da equação:
[AUC2(HerbaCistanche − tratado)/AUC2(não tratado)]×100 por cento
Medições do complexo I-IV e atividades de citrato sintase
As atividades do complexo I-III da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) foram medidas por métodos espectrofotométricos usando substratos específicos do complexo (NADH para complexo I, succinato para complexo II e decilubiquinol para complexo III) conforme descrito (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005; Mark et al., 2001). A atividade do complexo IV foi medida usando um kit de ensaio de citocromo c oxidase da Sigma. A atividade da citrato sintase mitocondrial foi medida pelo método de Srere (1969).
Ensaio de proteínas
As concentrações de proteínas das frações mitocondriais e dos lisados celulares foram determinadas usando um kit de ensaio de proteínas BioRad usando albumina sérica bovina como padrão ({{0}},038–0,600mg/mL).
Análise estatística
Todos os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM). Eles foram analisados por análise de variância unidirecional (ANOVA). Comparações múltiplas post hoc foram feitas com LSD. Valores P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">
Resultados
Efeitos do tratamento com Herba Cistanche no ATP-GC mitocondrial miocárdico em ratos
Conforme mostrado na Figura 1, o tratamento com extrato de Herba Cistanche em doses de até 0,5 g/kg aumentou o ATP-GC mitocondrial miocárdico de maneira dose-dependente em ratos, com o grau de estimulação sendo de 89% em uma dose de 0,5 g/kg.
Efeitos do tratamento com Herba Cistanche no transporte de elétrons mitocondrial em corações de ratos
A extensão do transporte de elétrons em mitocôndrias isoladas foi medida pelo monitoramento da redução do MTT. O substrato utilizado para o ensaio foi piruvato ou succinato.
Figura 1. O efeito do tratamento com Herba Cistanche na capacidade de geração de ATP mitocondrial em corações de ratos ex vivo
Cada barra representa a média ± SEM, com n {{0}}. Os animais foram tratados oralmente com HerbaCistanche nas doses diárias indicadas durante 3 dias. A capacidade de geração de ATP foi medida conforme descrito em "Materiais e Métodos". Os dados foram expressos em porcentagem de controle em relação aos valores (AUC2) do respectivo grupo de controle não tratado. ∗Significativamente diferente do respectivo grupo controle não tratado; significativamente diferente do grupo tratado com Herba Cistanche em 0,5 g/kg.
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Figura 2. Efeitos do tratamento com Herba Cistanche no transporte de elétrons mitocondrial em corações de ratos
Cada barra representa a média ± SEM, com n {{0}}. (a) O transporte de elétrons mitocondrial suportado por piruvato (b) suportado por succinato foi medido por redução de MTT, conforme descrito em "Materiais e Métodos". Os dados foram expressos na porcentagem de valores de controle não tratados [compatível com piruvato: OD570nm− OD630nm =0.0206 ± 0,0001 (SEM), n {{ 10}}; suportado por succinato: masculino, 0,255 ±0,015, n=5]. ∗Significativamente diferente do respectivo grupo controle não tratado; significativamente diferente do grupo de 0,5 g/kg.
Conforme mostrado na Figura 2a, o tratamento com Herba Cistanche aumentou de forma dose-dependente a extensão do transporte de elétrons mitocondrial suportado por piruvato em corações de ratos, com a estimulação ideal observável em doses de 0,5 g/kg. No entanto, nenhuma mudança significativa na extensão do transporte de elétrons mitocondrial suportado por succinato foi detectada em corações de ratos tratados com Herba Cistanche (Fig. 2b).
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