Parte 1|Variação genética implica angiopoietina plasmática-2 no desenvolvimento de subfenótipos de lesão renal aguda

Pavan K. Bhatraju1,2*, Max Cohen1, Ryan J. Nagao3,4, Eric D. Morrell1, Susanna Kosamo1, Xin-Ya Chai1, Robin Nance5, Victoria Dmyterko1, Joseph Delaney5, Jason D. Christie6, Kathleen D. Liu7, Carmen Mikacenic1, Sina A. Gharib1, W. Conrad Liles8, Ying Zheng3,4, David C. Christiani9,10, Jonathan Himmelfarb2 e Mark M. Wurfel1,2

Abstrato

Fundo:Anteriormente, identificamos doisagudorimprejuízo(AKI) subfenótipos (AKI-SP1 e AKI-SP2) com diferentes riscos de maus resultados clínicos e respostas à terapia vasopressora. Biomarcadores plasmáticos de disfunção endotelial (receptor do fator de necrose tumoral-1, angiopoietina-1 e 2) diferenciaram os subfenótipos de LRA.

No entanto, não se sabe se esses biomarcadores são simplesmente marcadores ou mediadores causais no desenvolvimento de subfenótipos de LRA.

Métodos:Testamos associações entre polimorfismos de nucleotídeo único dentro doAngiopoietina-1, Angiopoietina-2,eReceptor de Fator de Necrose Tumoral 1Agenes e AKI-SP2 em 421 indivíduos criticamente doentes de ascendência europeia. Polimorfismos de nucleotídeo único de alto desempenho (FDR < 0.05)="" foram="" testados="" para="" expressão="" de="" biomarcadores="" cis="" e="" se="" o="" risco="" genético="" para="" aki-sp2="" é="" mediado="" por="" biomarcadores="" circulantes.="" também="" concluímos="" estudos="" in="" vitro="" usando="" células="" endoteliais="" microvasculares="" de="" rim="" humano.="" finalmente,="" calculamos="" a="" depuração="" renal="" de="" biomarcadores="" plasmáticos="" usando="" 20="" coletas="" de="" urina="" cronometradas="">

Resultados:Uma variante genética, rs2920656C > T, perto deANGPT2foi associado a risco reduzido de AKI-SP2 (razão de chances, 0,45; IC de 95%, 0,31–0,66; FDR ajustado=0,003) ) e angiopoietina plasmática diminuída-2 (p = 0.002). A análise de inferência causal mostrou que para cada alelo menor (T) o risco de desenvolver AKI-SP2 diminui em 16%. A angiopoietina plasmática-2 mediou 41,5 por cento do risco relacionado ao rs2920656 para AKI-SP2. As células endoteliais microvasculares do rim humano carregando o alelo T de rs2920656 produziram níveis numericamente mais baixos de angiopoietina-2 embora isso não tenha sido estatisticamente significativo (p = 0.07). Finalmente, as análises demonstraram que a angiopoietina-2 é minimamente eliminada em indivíduos criticamente doentes.

Conclusão:A análise de mediação genética fornece evidências de que a angiopoietina-2 desempenha um papel causal no risco de AKI-SP2.

Palavras-chave: Lesão renal aguda, Genética, Endotélio

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Fundo

Agudorimprejuízo(LRA) afeta 40-60 por cento dos pacientes internados na unidade de terapia intensiva (UTI) e contribui para resultados ruins a curto e longo prazo. Os estudos genéticos até o momento se concentraram em associações entre variantes genéticas e o risco de LRA comparando casos (LRA) a controles (sem LRA). No entanto, este quadro pode ser limitado porque casos deAgudorimprejuízosão altamente heterogêneos com diferentes precipitantes e perfis biológicos. A combinação desses pacientes com LRA para maximizar o tamanho da amostra pode resultar na diluição dos sinais estatísticos genéticos que podem estar presentes apenas em um subconjunto fisiopatológico distinto da população com LRA. Outra limitação é que a LRA em populações criticamente doentes é frequentemente uma complicação de insultos graves, como sepse, cirurgia, choque, pneumonia e trauma. O uso de controles sem o desenvolvimento deAgudorimprejuízopode ser problemático. Controles portadores de uma variante genética de alto risco podem não desenvolver LRA se também não experimentarem um insulto agudo semelhante aos casos e, portanto, seriam classificados como não casos, atenuando qualquer sinal de associação potencial. O uso de subfenótipos de IRA biologicamente distintos em estudos de associação genética supera limitações anteriores na fenotipagem de IRA, concentrando-se especificamente na população de IRA e comparando dois subfenótipos biologicamente distintos.

Recentemente, identificamos dois subfenótipos de IRA (AKI-SP1 e AKI-SP2) aplicando a metodologia de análise de classe latente a um painel de 29 variáveis ​​clínicas e biomarcadoras em duas populações independentes de IRA em estado crítico. Notavelmente, AKI-SP2 foi associado a piores desfechos hospitalares (por exemplo, mortalidade, nova diálise e 7-dia de não recuperação renal) em comparação com AKI-SP1. Em seguida, identificamos esses subfenótipos de IRA em um estudo controlado randomizado multicêntrico previamente concluído, Vasopressina versus Infusão de Norepinefrina em Pacientes com Choque Séptico (VASST). O estudo VASST estudou se a escolha da terapia vasopressora melhorou a mortalidade em indivíduos com choque séptico. Enquanto a população AKI no ensaio clínico não teve diferença na mortalidade da terapia vasopressora, AKI-SP1 teve um benefício de mortalidade com vasopressina em comparação com AKI-SP2 não tendo diferença de mortalidade. Até onde sabemos, este é o primeiro exemplo de identificação de subgrupos de LRA responsivos ao tratamento em pacientes críticos.

Notavelmente, nenhuma variável isolada foi estatisticamente melhor do que as outras variáveis ​​para identificar LRA-SP2 (Tabela 1). Em contraste, um modelo de três variáveis, usando plasma angiopoietina-2 (ANG-2), angiopoietina-1 (ANG-1) e receptor solúvel do fator de necrose tumoral{{8 }} (sTNFR-1), teve o desempenho preditivo ideal para diferenciarAgudorimprejuízosubfenótipos (estatística C 0.93). Menor ANG-2, menor sTNFR-1 e maior ANG-1 foram associados a um menor risco de AKI-SP2. Estudos em modelos animais de LRA mostraram que esses biomarcadores plasmáticos estão envolvidos na

fisiopatologia e gravidade da LRA. No entanto, não se sabe se esses biomarcadores plasmáticos desempenham um papel causal no desenvolvimento deAgudorimprejuízosubfenótipos. A identificação de marcadores causais poderia informar alvos para o desenvolvimento de medicamentos para prevenir ou tratar o desenvolvimento deAgudorimprejuízoem pacientes críticos e pode auxiliar na estratificação de risco do paciente.

A análise de mediação genética é uma das várias abordagens de inferência causal que pode identificar o mecanismo potencial pelo qual uma variável independente (por exemplo, variante genética) afeta o resultado (por exemplo, subfenótipos de IRA) por meio de um mediador explicativo (por exemplo, biomarcador de disfunção endotelial) . Essa abordagem tem sido amplamente aplicada em dados clínicos para entender os mecanismos causais da doença. Nós hipotetizamos que loci de características quantitativas cis (QTLs) noANGPT1, ANGPT2 e TNFRSF1Agenes influenciam o desenvolvimento de subfenótipos de IRA regulando os níveis circulantes de seus respectivos biomarcadores (ANG-1, ANG-2 ou sTNFR-1).

Métodos

Populações de estudo

Relatamos anteriormente a identificação de subfenótipos de IRA usando uma coorte de UTI coletada prospectivamente: identificação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que predispõem ao risco de lesão pulmonar aguda alterada (iSPAAR). A população iSPAAR é um estudo caso-controle de todo o genoma do risco de síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) que incluiu pacientes com e sem SDRA. A população iSPAAR incluiu indivíduos de estudos de controle randomizados concluídos anteriormente e de uma coorte de UTI matriculada prospectivamente. Os detalhes do desenho do estudo para cada população inscrita no iSPAAR foram descritos anteriormente; Albuterol for the Treatment of Acute Lung Injury (ALTA), Fluid and Catheter Treatment Trial (FACTT), Enteral ômega-3 ácido graxo, ácido gama-linolênico e suplementação antioxidante em lesão pulmonar aguda (OMEGA)

e Epidemiologia Molecular de Angústia Respiratória Aguda (MEA) no Hospital Geral de Massachusetts. Dentro do iSPAAR, a inscrição no estudo ocorreu 48 h após a admissão na UTI. Na inscrição no estudo, o DNA e o plasma foram coletados para genotipagem e análise de biomarcadores seguidos porAgudorimprejuízoapuração. A IRA foi definida como um aumento na creatinina sérica (SCr) maior ou igual a 0,3 mg/dl ou 50 por cento da SCr "basal". A SCr inicial foi definida como o valor mais baixo antes da inscrição no estudo. A LRA também foi definida usando critérios de diurese modificados (débito diário em vez de a cada 6 h).

Para determinar a depuração renal de biomarcadores plasmáticos, inscrevemos uma coorte prospectiva nas unidades de terapia intensiva médica e cirúrgica de Harborview, a Critical IllnessAgudorimprejuízoCoorte (CIA). Os indivíduos eram elegíveis para inscrição se satisfizessem 2 dos 4 critérios da síndrome da resposta inflamatória sistêmica, tivessem uma infecção clinicamente suspeita e tivessem um cateter urinário de demora instalado. Uma coleta de urina cronometrada foi concluída com duração de pelo menos 2 a 4 horas e amostras de plasma com EDTA foram coletadas no início e no final da coleta de urina cronometrada. A depuração foi calculada usando a fórmula Depuração(X) = U(X) * V/ P(X), OndeU(X) representa a concentração urinária de solutoX, V indica o volume de urina durante o período de coleta de 2–4-h, eP (X) representa as concentrações plasmáticas médias de solutoX das coletas de sangue inicial e final.

Estratégia de genotipagem

A genotipagem foi realizada em 421 pacientes de ascendência europeia usando a plataforma Illumina 660 (Illumina, San Diego, CA). Os dados genotipados foram controlados por qualidade usando um filtro de taxa de chamada de amostra > 0.97, frequência do alelo menor (MAF) > 0.01 e taxa de chamada SNP > 0,95. Após o controle de qualidade, 238 SNPs ±50 kilobases deANGPT1, ANGPT2,eTNFRSF1Aforam achados. Após a poda do desequilíbrio de ligação (LD) de um r²de {{0}}.8, 48 SNPs foram removidos levando a um total de 190 SNPs usados ​​em testes de associação. A imputação foi realizada usando o painel de referência 1000 Genomes Project usando IMPUTE2 v2.3.0.

Avaliação de proteínas plasmáticas

Os biomarcadores plasmáticos e urinários foram medidos usando imunoensaios eletroquimioluminescentes (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, MD), conforme descrito anteriormente. O sangue foi coletado em tubos estéreis tratados com EDTA, a urina foi coletada em recipientes estéreis e ambos foram centrifugados imediatamente. Plasma e urina foram então aliquotados e congelados a -80 graus. As amostras foram armazenadas por diferentes durações, mas foram descongeladas em um único lote e apenas uma vez para executar as medições de biomarcadores para este estudo. Todas as medições de biomarcadores foram realizadas em duplicatas no Harborview Pulmonary Research Laboratories.

Análises in silico

Para testar SNPs para a expressão de efeitos de QTL, consultamos o Portal Genotype-Tissue Expression (GTEx).

Cultura de células

Células endoteliais microvasculares renais humanas (HKME Cs) foram purificadas de rins fetais após interrupções voluntárias da gravidez entre 100 e 135 dias após a concepção. O consentimento informado para o uso de tecidos fetais foi obtido dos pacientes. Em seguida, escolhemos aleatoriamente 9 HKMECs doadores diferentes, descongelamos e plaqueamos meio milhão de células em frascos T25 revestidos com 0,2% de gelatina e mantidos em meio basal EBM-2 contendo 1% de antibiótico-antimicótico (Life Technologies), 10% de FBS, 100 ug/mL de ECGS, 50 ug/mL de Heparina e 20 ng/mL de VEGF (P&D), por 48 h até a confluência. Às 48 h, purificamos o DNA genômico dos HKMECs e os sobrenadantes das células foram coletados. Nós genotipamos com sucesso células de 8 doadores.

Análise estatística

As variáveis ​​demográficas dos pacientes são relatadas como média mais/−desvio padrão ou como mediana e quartis. Primeiro, usamos regressão logística para testar uma associação entre os 19{11}} SNPs e o desenvolvimento de AKI-SP2 em comparação com AKI-SP1 usando um modelo genético aditivo (Golden Helix, MT). Nosso modelo foi utilizado para as seguintes covariáveis: idade, sexo, sepse e os cinco primeiros componentes principais. O método Eigenstrat v4.2 foi usado para calcular os componentes principais e os cinco primeiros foram incluídos como covariáveis. As razões de chances (ORs) são relatadas com intervalos de confiança de 95%. Para a análise entre variantes genéticas e subfenótipos de IRA, corrigimos comparações múltiplas usando um limite de taxa de descoberta falsa (FDR) de Benjamini-Hochberg < 0,10,="" que="" estima="" que="" menos="" de="" 10%="" das="" associações="" com="" um="" valor="" de="" fdr="" igual="" ou="" inferior="" este="" nível="" são="" falsos="" positivos="" [31].="" em="" uma="" análise="" de="" sensibilidade,="" um="" genótipo="" imputado="" foi="" usado="" para="" identificar="" snps="" adicionais="" associados="" a="">

Em segundo lugar, usamos o ajuste de regressão linear para idade, sexo e sepse para determinar associações entre SNPs de melhor desempenho e log₂concentrações de biomarcadores transformados. Terceiro, completamos uma análise de inferência causal para testar a associação entre variantes genéticas e AKI-SP2 e a potencial mediação da associação pelas concentrações de biomarcadores no plasma. A análise de mediação foi realizada usando a implementação não linear de modelagem de equações estruturais implementada no pacote de mediação para STATA [32, 33]. Detalhes adicionais da análise de inferência causal são fornecidos no suplemento online. Em quarto lugar, determinamos associações entre variantes genéticas e gravidade da LRA, medida pela creatinina sérica máxima, por meio de regressão logística. Detalhes adicionais de materiais e métodos são fornecidos no suplemento online. Na análise, avaliamos 190 SNPs e usamos um método conservadorvalor pde 0,05/190 =2,6 × 10^{− 4}. Dado que aproximadamente 40 por cento dos pacientes de UTI desenvolvem IRA, e uma proporção esperada de controle (AKI-SP1) para caso (AKI-SP2) de 1,5, um tamanho de amostra esperado de 421 e um MAF de pelo menos { {16}}.30, teremos 81% de poder para detectar um risco relativo de 1,5 ou mais [34]. As análises foram concluídas usando STATA (versão 15) e Goldenhelix (versão 4.0). Todos os estudos foram aprovados pela Divisão de Assuntos Humanos da Universidade de Washington. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos inscritos.

Resultados

Características das populações Dos 425 pacientes da coorte de validação em nosso trabalho anterior, 421 tinham dados de genotipagem disponíveis. As características demográficas e clínicas basais estão descritas na Tabela 1. Todos os indivíduos eram de ascendência europeia. Um total de 267 (63 por cento ) foram classificados como AKI-SP1 e 154 (37 por cento ) como AKI-SP2. Os indivíduos que desenvolveram AKI-SP2 apresentaram maior gravidade da doença na apresentação (escores médios de fisiologia aguda e avaliação de saúde crônica (APACHE) III, 111 ± 26 vs 74 ± 24), eram mais propensos a ter sepse (84 por cento vs 66 por cento) e eram mais propensos a serem tratados com vasopressores (79 por cento vs 42 por cento) em comparação com AKI-SP1.

Variação genética próxima a ANGPT2, rs2920656, está associada a AKI-SP2

Dos 190 SNPs ±50 quilobases dos genes, 72 estavam perto de ANGPT1, 100 estavam perto de ANGPT2 e 18 estavam perto do gene TNFRSF1A. Identificamos um SNP com FDR < 0,05="" que="" foi="" associado="" a="" aki-sp2="" em="" comparação="" com="" aki-sp1="" (tabela="" 2="" e="" fig.="" 1).="" não="" foram="" observadas="" associações="" significativas="" com="" snps="" em="" ou="" perto="" de="" angpt1="" ou="" tnfrsf1a="" (tabela="" s2="" e="" s3).="" o="" snp="" que="" demonstrou="" a="" associação="" mais="" forte="" com="" o="" risco="" de="" aki-sp2="" foi="" rs2920656="" (or,="" 0,45;="" ic="" 95="" por="" cento,="" 0,31-0,66;="" p="">< 1,4="" ×="" 10-5;="" fdr="0.003)." este="" snp="" intrônico="" é="" ≈="" 30="" kb="" a="" jusante="" da="" posição="" 3'="" do="" angp="" t2="" e="" explicou="" aproximadamente="" 3="" por="" cento="" da="" variância="">

o desenvolvimento de AKI-SP2 (R2). Como apenas um pequeno número de indivíduos era homozigoto rs2920656 (n=26), também testamos associações entre rs2920656 e AKI-SP2 em um modelo genético dominante, que deu resultados consistentes resultados (OR, 0,42; IC 95 por cento, 0,28-0,64; p < 1,4="" ×="" 10-6).="" também="" testamos="" associações="" adicionais,="" potencialmente="" mais="" fortes,="" dentro="" do="" locus="" angpt2="" usando="" genótipos="" imputados,="" mas="" não="" encontramos="" associações="" mais="" fortes="" do="" que="" as="" observadas="" com="" rs2920656="" (tabela="" s4).="" em="" uma="" análise="" de="" sensibilidade,="" testamos="" se="" a="" inclusão="" de="" pacientes="" críticos="">Agudorimprejuízoinfluenciaria a associação genética. Agrupamos pacientes sem LRA e LRA-SP1 e determinamos se o rs2920656 ainda estava fortemente associado a um risco reduzido de LRA-SP2. Nesta análise, 839 pacientes não apresentavam LRA ou LRA-SP1 e 154 apresentavam LRA-SP2. O risco de desenvolver AKI-SP2 novamente foi significativamente reduzido com pelo menos um alelo T para rs2920656 (OR 0.31; IC de 95%, 0.19–0,52; p < 0,001)="" (tabela="" s5).="" em="" outra="" análise="" de="" sensibilidade,="" testamos="" se="" o="" rs2920656="" estava="" associado="" à="" diminuição="" do="" risco="" de="" lra-sp2="" em="" cada="" um="" dos="" quatro="" estudos="" diferentes="" incluídos="" no="" ispaar.="" dentro="" de="" cada="" um="" dos="" três="" ensaios="" clínicos="" randomizados="" (alta,="" factt="" e="" omega)="" e="" da="" coorte="" prospectiva="" da="" uti="" (mea),="" a="" estimativa="" pontual="" foi="" consistente="" com="" o="" alelo="" menor="" de="" rs2920656="" demonstrando="" um="" risco="" diminuído="" para="" o="" desenvolvimento="" de="" aki-sp2="" (tabela="" s6="" ).="" assim,="" rs2920656="" foi="" analisado="" adicionalmente="" para="" determinar="" a="" associação="" com="" as="" concentrações="" de="" biomarcadores="" no="">

O alelo T de rs2920656 está associado à diminuição da ANG plasmática-2

Em seguida, analisamos a associação entre rs2920656 e concentrações plasmáticas de ANG-2. Ajustando para idade, sexo e sepse, cada cópia do alelo T de rs2920656 foi associada à diminuição das concentrações plasmáticas log2 de ANG-2 (= − 0,09; IC 95 por cento {{9} } 0,15, − 0,04; P=0 0,002). Indivíduos homozigotos para o alelo C apresentaram as maiores concentrações de ANG plasmática-2 (40.683 pg/ml; intervalo interquartil (IQR) 19,{19}},205), enquanto indivíduos homozigotos para o alelo T apresentaram o menor concentrações plasmáticas de ANG-2 (28.308 pg/ml (IQR 14,{25}}, 944). Além disso, dos 100 SNPs testados perto da região do gene ANGP T2, rs29206565 foi o mais fortemente associado à ANG plasmática -2 concentrações (Fig. 2).

A análise de mediação sugere que ANG-2 é causal no desenvolvimento de AKI-SP2

Testamos evidências de que a associação entre rs2920656 e risco de AKI-SP2 é mediada por concentrações plasmáticas de ANG-2 (Fig. 3). O efeito total de rs2920656 em AKI-SP2 foi total=− 0,16 por alelo (IC de 95% -0,24, − 0 .10, p=1.0 × 10− 4 ), o que sugere que para cada alelo menor (alelo T) da variante genética o risco de desenvolver AKI-SP2 diminui em 16 por cento . A análise de mediação causal detectou um efeito indireto significativo para rs2920656 em AKI-SP2 que foi mediado através de concentrações plasmáticas de ANG-2 (indireta, − 0,07 por alelo; 95 por cento CI -0.11, − 0,03; p { {34}}.001), o que significa que a proporção de efeito entre rs2920656 e AKI-SP2 que é mediada por concentrações de ANG-2 é de 41,5 por cento .

O alelo T de rs2920656 está associado à diminuição da gravidade da LRA em 7 dias

Em seguida, testamos a associação de rs2920656 com critérios tradicionais de gravidade de LRA, como creatinina sérica máxima e aumento da creatinina sérica em 7 dias após a inscrição no estudo. Em um modelo genético dominante, o alelo T de rs2920656 foi associado a uma diminuição na creatinina sérica de − 0,44 mg/dL (IC de 95%, − 0,77 , − 0.10), p=0.01) após ajuste para idade, sexo, índice de massa corporal e estado de sepse. O alelo menor de rs2920656 também foi associado a uma diminuição no aumento da creatinina sérica entre a linha de base e o dia 7 (= - 0,25, 95 por cento CI, - 0,46, - 0,03; p=0,03)

O alelo T de rs2920656 está associado a ANG mais baixo-2 em cultura de células

Conduzimos experimentos in vitro e análises in silico para determinar o significado funcional de rs2920656. De 8 fetos humanos diferentesrimtecidoamostras, 2 eram CC, 5 eram CT e 1 era TT para rs2920656. Em um modelo genético dominante, as concentrações de ANG-2 foram numericamente maiores em células endoteliais de doadores homozigotos para o alelo C e menores em portadores do alelo T, p=0.07 (Fig. 4). No banco de dados do projeto GTEx, rs2920656 não foi associado à expressão do gene ANGPT2. No entanto, dois outros SNPs (rs41311412 e rs2515591) que estão em LD moderado (r2=0.23 e D'=0.86) com rs2920656 foram associados à redução da expressão do gene ANGPT2 (p=4.1 × 10− 5 ) na artéria tibial, um tecido altamente enriquecido por células endoteliais (Tabela S7).

A ANG plasmática-2 é minimamente eliminada pelos rins Para determinar se as diferenças narimfunçãopoderia influenciar as concentrações plasmáticas de ANG{{0}}, medimos a depuração renal de ANG-2 em indivíduos criticamente doentes com e sem LRA. Em 20 diferentes coletas de amostras de urina cronometradas com amostras de plasma marcadas, a mediana da creatinina sérica foi de 0,86 mg/dL com um intervalo interquartil (IQR) de 0,69 a 1,45 mg/dL. A concentração plasmática mediana de ANG-2 foi de 10.261 pg/mL (IQR 6210–19.115 pg/mL). Em contraste, as concentrações urinárias de ANG-2 foram 50-vezes mais baixas com uma mediana de 206 pg/mL (IQR 11–839 pg/mL). A depuração renal calculada de ANG-2 foi < 1="" ml/min="" para="" todas="" as="" coletas="" de="" urina="" cronometradas,="" sugerindo="" que="" as="" concentrações="" plasmáticas="" de="" ang-2="" não="" aumentam="" simplesmente="" em="" função="" do="" agravamento="" da="" lra="" (tabela="">