Parte 1: Efeito do Acteoside como um protetor celular para produzir um cão clonado

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Divisão de Ciência Animal e Laticínios, Faculdade de Agricultura e Ciências da Vida, Universidade Nacional de Chungnam, Daejeon, República da Coreia,

2 Departamento de Educação Biologia, Faculdade de Educação,Universidade Nacional de Chonnam, Gwangju, República da Coreia

Contato:joanna.jia@wecistanche.com

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Abstrato

A transferência nuclear de células somáticas (SCNT) é uma técnica de laboratório bem conhecida. O princípio do SCNT envolve a reprogramação de um núcleo somático através da injeção de uma célula somática em um oócito receptor cujo núcleo foi removido. Portanto, as células doadoras de núcleo são consideradas um fator crucial no TNCS. A sincronização do ciclo celular de células doadoras de núcleo no estágio G0/G1 pode ser induzida por inibição de contato ou inanição de soro. Neste estudo,acteósido, um composto glicosídeo fenilpropanóide, foi investigado para determinar se é aplicável para induzir a sincronização do ciclo celular, citoproteção e melhorar a eficiência do SCNT em fibroblastos fetais caninos. Fibroblastos fetais caninos primários foram tratados comacteósido(10, 30, 50 μM) por vários períodos de tempo (24, 48 e 72 horas). A sincronização do ciclo celular no estágio G0/G1 não diferiu significativamente com o método de indução:acteósidotratamento, inibição de contato ou privação de soro. No entanto, desses três tratamentos, a inanição do soro resultou em um nível significativamente aumentado de espécies reativas de oxigênio (ROS) (99,5 ± 0,3 por cento) e apoptose. Os resultados também revelaram queacteósidoprocessos reduzidos de ROS e apoptose, incluindo necrose em fibroblastos fetais caninos, e sobrevivência celular melhorada. Fibroblastos fetais caninos tratados comacteósidoforam presos com sucesso no estágio G0/G1. Além disso, os embriões reconstruídos usando células doadoras de núcleo tratadas com acteosídeo produziram um cão clonado saudável, mas não os embriões produzidos usando células doadoras de núcleo submetidas à inibição de contato. Para concluir,acteósidoA sincronização induzida do ciclo celular de células doadoras de núcleo seria um método alternativo para melhorar a eficiência do TNCS canino devido aos seus efeitos citoprotetores.

Cistanche acteosídeo pode aumentar a imunidade

Introdução

A técnica SCNT tem sido utilizada para produzir animais geneticamente superiores ou manipulados para fins agrícolas e como recursos biomédicos. Com a crescente necessidade de modelos animais de doenças, resgate de animais em perigo de extinção, células-tronco para medicina regenerativa, transplante de órgãos, etc. Embora a produção de animais clonados tenha sido bem sucedida, a eficiência do SCNT ainda é muito baixa [6]. As causas da baixa competência de desenvolvimento embrionário do SCNT incluem muitos fatores que estão relacionados à qualidade dos oócitos receptores, à qualidade das células doadoras de núcleo e à condição da mãe de aluguel [7-10].

Espécies reativas de oxigênio (ROS) e apoptose são conhecidas por estarem envolvidas nos processos reprodutivos femininos, incluindo o desenvolvimento de oócitos in vivo e in vitro [11-14]. As EROs interrompem o desenvolvimento embrionário induzindo condensação citoplasmática, dano ao DNA e apoptose em embriões. Estudos de apoio relataram que a redução de ROS melhora a competência de desenvolvimento embrionário do SCNT durante a cultura in vitro [15-17]. A apoptose é um processo fisiológico que ocorre espontaneamente durante o desenvolvimento normal do embrião pré-implantação para manter a homeostase celular removendo células danificadas/com mau funcionamento do DNA. ROS causa fragmentação do DNA e aumenta blastômeros apoptóticos que perturbam o desenvolvimento embrionário. O evento de ROS e apoptose é observado com mais frequência após SCNT do que após a fertilização in vitro [18, 19]. Muitos estudos relataram que a competência de desenvolvimento embrionário do SCNT é resgatada pela redução dos níveis de ROS e apoptose usando antioxidantes como selênio [20], insulina-transferrina-selênio [17, 21], melatonina [22] e glutationa [23].

Estudos anteriores relataram que o uso de células doadoras presas no estágio G{0}}/G1 melhorou a eficiência do SCNT [7, 9, 24–28]. A cromatina nas células doadoras no estágio G0/G1 tem sido considerada a mais eficaz para a competência de desenvolvimento embrionário do SCNT. Para sincronizar o ciclo celular do doador, a inibição de contato, a privação de soro e os tratamentos químicos têm sido usados ​​com frequência [7, 25, 29, 30]. No entanto, a falta de soro reduziu a sobrevivência das células e aumenta a fragmentação do DNA, o que leva à apoptose [31]. A inibição química é outra estratégia para interromper o ciclo celular no estágio G0/G1 usando inibidores como roscovitina [29, 32], dimetilsulfóxido (DMSO) [33] e cicloheximida (CHX) [34]. A eficiência do método usado para sincronização é afetada pelos tipos e espécies das células doadoras. Para sincronização ideal de células doadoras, vários aspectos dos métodos usados ​​precisam ser cuidadosamente avaliados.

Acteosídeo(também conhecido como verbascoside) [{{0}}(3, 4-dihidroxi fenil etil)-1-OaL-ramnopiranosil-(1 / 3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopiranosídeo] é isolado das flores violetas de Syringa vulgaris. Sabe-se que as plantas que contêm acteosídeos têm atividades antimicrobianas e antifúngicas [35-37] e previnem a inflamação. De fato, o acteosídeo exibe várias atividades biológicas in vitro e in vivo, como atividade antioxidante, atividade antiapoptótica, citotoxicidade contra várias células tumorais e sincronização do ciclo celular no estágio G0/G1 como um dependente de ciclina inibidor de quinase (CDK) [38]. Por exemplo, Lee et al.[38] relataram que o tratamento com acteosídeos pode inibir a proliferação de células de leucemia promielocítica humana HL-60 ao induzir a parada do ciclo celular no estágio G0/G1. No entanto, o efeito das células doadoras tratadas com acteoside sobre a eficiência do SCNT canino ainda não foi estudado.

Neste estudo, os efeitos daacteósidona sincronização do ciclo celular, ROS eapoptoseem fibroblastos fetais caninos foram investigados. A análise da sincronização do ciclo celular, ROS e apoptose foi realizada usando classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Para demonstrar a eficiência das células doadoras tratadas com o acteosídeo, os embriões SCNT foram cultivados e transferidos para um cão receptor e produziram com sucesso um cão clonado saudável.

cistachepode tratarrimdoença melhorarrenalfunção

Materiais e métodos

Declaração de ética

Neste estudo, 44 ​​cadelas mestiças (com idades entre 1 e 6 anos) foram usadas como doadoras de oócitos e substitutas de transferência de embriões, e uma fêmea beagle (com 2 anos de idade) foi usada para o estabelecimento de linhagens celulares de fibroblastos fetais. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Chungnam National University (Approval Number: CNU-00487) e realizados de acordo com "The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" publicado pelo IACUC da Universidade Nacional de Chungnam. Os cães foram criados em gaiolas separadas com sistema de controle de temperatura e ventilação. Os cães foram alimentados com ração comercial uma vez ao dia e água ad libitum. Em todos os experimentos com animais, os cães foram inicialmente anestesiados com 6 mg/kg de cetamina e xilazina e mantidos em condição anestesiada com 2% de isoflurano. Ao final da cirurgia, antibióticos (Penicilina G Procaína, Penicilina G Benzatina e Sulfato de Diidroestreptomicina) foram administrados para prevenir qualquer infecção. Após a cirurgia, os cães foram transferidos para gaiolas individuais com água doce, monitorados e com cuidados especiais do veterinário responsável, para que os tratamentos necessários pudessem ser administrados caso os animais necessitassem.

Produtos químicos

Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA), salvo indicação em contrário. Acteoside foi obtido de Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. na China.

Isolamento de fibroblastos fetais caninos

Fibroblastos fetais caninos foram obtidos de {{0}}fetos de um dia. Resumidamente, uma beagle fêmea foi inseminada artificialmente com o esperma de um beagle macho. Após 28 dias, foi confirmada a gravidez na fêmea beagle e 5 fetos foram obtidos por celiohisterectomia. Os fetos foram lavados três vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, EUA). A cabeça, órgãos internos e membros dos fetos foram removidos com uma lâmina cirúrgica e as partes restantes do corpo foram picadas em PBS. Pedaços de fetos foram lavados duas vezes por centrifugação a 400 × por 5 min e cultivados em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco) suplementado com 1 por cento de penicilina-estreptomicina (produto nº P4458) e 20 por cento de soro fetal bovino (FBS; Gibco) a 39 graus em uma atmosfera umidificada de 5 por cento de CO2 e 95 por cento de ar. Quando as células atingiram a confluência após 5 a 7 dias, elas foram tratadas com 0,25% de tripsina-EDTA (Gibco) por 2 min e colhidas. Duas linhas celulares de fibroblastos fetais caninos foram estabelecidas a partir de dois fetos individuais. As células foram congeladas em 10 por cento de DMSO em FBS e armazenadas em nitrogênio líquido a -196 grau até serem usadas.

Tratamento celular

Os fibroblastos caninos congelados foram descongelados e cultivados até 8{10}} por cento de confluência. As células foram colhidas e passadas 4 a 7 vezes para experiências subsequentes. As células foram semeadas a uma concentração de 106/mL em placas de cultura de 60 mm. As células foram cultivadas em (1) DMEM suplementado com 10 por cento de FBS e 1 por cento de penicilina-estreptomicina por cinco dias (inibição de contato), (2) DMEM suplementado com 0,5 por cento de FBS e 1 por cento de penicilina-estreptomicina por cinco dias (inanição de soro) , ou (3) DMEM suplementado com 10 por cento de FBS e 1 por cento de penicilina-estreptomicina contendo acteoside a 10 μM, 30 μM ou 50 μM por 24 h, 48 h e 72 h (tratamento com acteoside).

Análise do ciclo celular por citometria de fluxo

Para análise dos estágios do ciclo celular, as células foram colhidas usando {{0}},25 por cento de tripsina-EDTA e lavadas 3 vezes com PBS por centrifugação. Após a última lavagem, os sobrenadantes foram descartados e as células ressuspensas em 0,3 mL PBS. Para fixação, {{10}},7 mL de etanol absoluto frio foi adicionado gota a gota à suspensão de células, misturado por vortex suave e armazenado durante a noite a 4 graus. As células fixadas foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS frio. As células foram ressuspensas em 0,25 mL de PBS suplementado com 5 μL de 10 mg/mL de RNase e incubadas por 1 h a 37 graus. Em seguida, 10 μL de 1 mg/mL de iodeto de propídio (PI) foi adicionado. O ciclo celular foi analisado pela quantificação do conteúdo de DNA em populações de células nas fases G0/G1 (2n), S (entre 2n e 4n) e G2/M (4n) usando um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA , EUA).

Detecção de ROS por citometria de fluxo

A ROS em células vivas foi avaliada usando um Kit de Detecção de Espécies de Oxigênio Reativo Image-iT™ Live Green (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). Resumidamente, as células foram lavadas em PBS após a remoção do meio de cultura e foram adicionados 2 mL da solução de trabalho de 100 μM de hidroperóxido de terc-butila (TBHP). Após incubação a 37 graus durante 1 h, a solução de trabalho de TBHP foi removida e as células foram lavadas suavemente 3 vezes em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco quente (DPBS; Gibco). As células foram então incubadas em solução de trabalho de 25 μM 5-(e-6)-carboxi-2,7-diclorodihidrofluoresceína (carboxi-H2DCFDA) a 37 graus por 30 min no escuro . Quando oxidado, o carboxi-H2DCFDA emite fluorescência verde, facilitando a avaliação de ROS por citometria de fluxo. O TBHP, que é um indutor da produção de ROS, foi usado como controle positivo. Os núcleos das células foram corados com Hoechst 33342. Após lavagem 3 vezes com PBS, as células foram colhidas por tripsinização, suspensas em PBS e usadas para detectar ROS usando um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA ). A taxa de formação de ROS foi calculada dividindo o número de células positivas para ROS pelo número total de células e convertendo os valores em porcentagens.

Análise de apoptose por citometria de fluxo

A análise de apoptose foi realizada usando um Kit de Ensaio de Apoptose Vybran1 #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). Resumidamente, as células foram colhidas por tripsinização e lavadas 2 vezes com PBS frio. Depois disso, 100 μL de 1x tampão de ligação à anexina, 5 μL de Alexa Fluor 488 anexina V e 1 μL de PI foram adicionados às células. Após a incubação por 15 min à temperatura ambiente, 400 μL de 1x tampão de ligação à anexina foram adicionados e a suspensão de células foi suavemente misturada. A anexina V, que é uma proteína de ligação a fosfolipídios dependente de Ca2+, tem alta afinidade pela fosfatidilserina (PS). Em células vivas, PS está localizado na membrana citoplasmática interna e translocado para a membrana citoplasmática externa em células apoptóticas. As células apoptóticas são distinguidas pela Anexina V marcada com Alexa Fluor 488 ligando-se a PS na membrana externa. Além disso, o PI, que é um corante de ligação ao ácido nucleico, cora as células necróticas com fluorescência vermelha. Portanto, células apoptóticas com fluorescência verde, células necróticas com fluorescência vermelha e células vivas com pouca ou nenhuma fluorescência nas células foram analisadas usando um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). As taxas foram calculadas dividindo o número de células de células vivas, necróticas ou apoptóticas com o número total de células e convertendo os valores calculados em porcentagens.

Coleta de oócitos maturados in vivo

Para detectar a ovulação em cada cão, a concentração sérica de progesterona (P4) foi medida usando um kit de radioimunoensaio de tubo revestido de progesterona DSL-3900ACTIVE (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, EUA). Conforme descrito anteriormente [39, 40], o dia em que a concentração de P4 excedeu 4 ng/mL foi considerado o dia da ovulação. Às 72 h após a ovulação, os oócitos foram recuperados por laparotomia usando procedimentos cirúrgicos assépticos. A fímbria do oviduto foi abordada através da fenda bursal e canulada com agulha de aço de bulbo flangeado invertido (calibre 18, 7,5 cm). Um cateter intravenoso (IV) de calibre 24 (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seul, Coréia) foi inserido no istmo do oviduto próximo à junção uterotubária, e meio 199 (Gibco) suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina e 5 por cento de FBS foi introduzido no oviduto através do cateter IV. Os oócitos foram imediatamente transportados para o laboratório. Um total de 316 oócitos foram coletados de 31 cães.

A transferência nuclear de células somáticas e a transferência de embriões SCNT foram realizadas como descrito anteriormente [39]. Resumidamente, para remover células de cumulus de oócitos maturados in vivo, complexos de cumulus-oócitos (COC) foram pipetados repetidamente em 0,1 por cento de hialuronidase. O primeiro corpo polar e os cromossomos da metáfase II foram removidos por aspiração. A enucleação foi confirmada por coloração com Hoechst 33342 (bisbenzimida). Fibroblastos fetais caninos foram tratados com 30 μM de acteosídeo por 48 h e, em seguida, colhidos com 0,25 por cento de tripsina-EDTA. Uma única célula, que possui uma membrana celular lisa, foi transferida para o espaço perivitelino de cada oócito enucleado. Os dísticos eram meio de infusão equilibrado, que é 0,26 M de manitol contendo 0,1 mM HEPES, 0,5 mM MgSO4 e 0,05 por cento de BSA, e fundidos por dois pulsos de corrente contínua (69-75 V por 15 μs) de um aparelho Electro-Cell Fusion (NEPA gene Co., Chiba, Japão). Esses dísticos foram incubados em meio 199 suplementado com 10 por cento de FBS por 1 h 30 min. Os embriões SCNT fundidos foram verificados e a ativação química foi induzida por incubação em ionóforo de cálcio 10 μM (produto nº C7522, Sigma) por 4 min. Os embriões SCNT foram lavados e então colocados em um meio fluido oviductal sintético modificado (mSOF) [41] contendo 1,9 mM de 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) por 3 h 30 min. Os embriões engenheirados foram transferidos cirurgicamente para os ovidutos de substitutos sincronizados com o estro dentro de 4 h após o SCNT. A gravidez foi confirmada por ultrassonografia aos 26 dias (no mínimo) após a transferência de embriões.

ingrediente ativoacteósidodentrocistache

Cultura in vitro de embriões clonados

Após o SCNT, os embriões clonados foram cultivados em microgotas de 40 μL de um meio fluido ovidutal sintético modificado (mSOF) (10 embriões clonados por microgota) coberto com óleo mineral a 38,5 graus em 5 por cento de CO2 e 95 por cento de ar. O desenvolvimento embrionário SCNT foi observado do dia 2 ao dia 8.

Análise de microssatélites e DNA mitocondrial de um cão clonado

O DNA total foi extraído das células doadoras nucleares e da pele dos cães doadores de oócitos, cães substitutos e do cão clonado pelo G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) de acordo com as diretrizes do fabricante, e, em seguida, foi eluído em 100 μL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). A quantidade de DNA foi medida pelo Espectrofotômetro BioSpec-nano (Shimadzu Corp., Japão).

Para a genotipagem de microssatélites, os 7 genes específicos a seguir foram selecionados: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 e FH2079. A PCR foi realizada com desnaturação inicial por 10 minutos a 95 graus, 20 ciclos compostos por desnaturação por 30 segundos a 95 graus, 30 segundos de anelamento a 58 graus (-0,1 grau/ciclo), 1 minuto de extensão a 72 graus e mais 15 ciclos compostos de desnaturação por 30 segundos a 95 graus, 30 segundos de recozimento a 56 graus, 1 minuto de extensão a 72 graus e extensão final a 72 graus por 10 minutos.

Para o sequenciamento do DNA mitocondrial, utilizando as sequências nucleotídicas completas do mtDNA canino (nº de acesso GenBank: U96639), foram sintetizados os seguintes primers oligonucleotídicos: Região do citocromo b (L14.252 – L14.631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG, R: AGTTCCGATATAAGGGATGGCAGAG; Subunidade II da citocromo c oxidase (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2.033 –L2.472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Região D-loop (L15.622 – L16.030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Os ciclos de PCR para esta análise incluíram: desnaturações iniciais de 95 graus por 5 minutos, 5 ciclos de desnaturação por 30 segundos a 95 graus, 40 segundos de anelamento a 60 graus (-1 graus/ciclo), 1 minuto de extensão a 72 graus e os próximos 30 ciclos de desnaturação por 30 segundos a 95 graus, 40 segundos de recozimento a 55 graus, 1 minuto de extensão a 72 graus e extensão final a 72 graus por 10 minutos. Os fragmentos de PCR dos vários experimentos foram analisados ​​usando um ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., EUA). Montagem de sequência, alinhamentos múltiplos e corte de alinhamento para regiões de controle foram realizados com o software BioEdit (v.7.0.5.3).

acteósidodentrocistachepode aumentar o sistema imunológico