Parte 1 Efeitos antidepressivos do extrato de Cistanche Tubulosa em ratos de estresse imprevisíveis crônicos através da restauração da microbiota intestinal homeostase

Yang Li1, Ying Peng1, Ping Ma1, Hanlin Yang1, Haiyan Xiong1, Mengyue Wang1, Chongsheng Peng1, Pengfei Tu2 e Xiaobo Li1*

1 Escola de Farmácia, Universidade de Xangai Jiao Tong, Xangai, China, 2 Laboratórios De Drogas Naturais e Biomiméticas, Escola de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Pequim, Pequim, China

Evidências crescentes mostram que distúrbios neuropsiquiátricos, como a depressão, estão ligados ao microbioma intestinal através do eixo intestino-cérebro.Cistanches Herbaé bem conhecida pelo tratamento da deficiência "rim-yang" na medicina tradicional chinesa (TCM) e tem sido usada para o tratamento de doenças neurodegenerativas nos últimos anos. Neste estudo, foi estabelecido o modelo de depressão crônica imprevisível (CUS) para explorar o impacto deCistanche tubulosaextrato (CTE) em testes comportamentais, neurotransmissores de monoamina e fatores neurotróficos na produção de hipocampo e cólon, composição de microbiota intestinal e ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). Além disso, utilizou-se a análise de correlação para avaliar a relação funcional entre microbiota intestinal alterada, neurotransmissores alterados e neurotrophins no hipocampo e cólon, e concentração perturbada de SCFAs. O CTE melhorou significativamente os comportamentos semelhantes à depressão em ratos sob CUS. Os níveis cerebrais de 5-hidroxitriptamina (5-HT) e a expressão fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em ratos cus foram restaurados por CTE. A abundância relativa de microbiota intestinal e as concentrações de acetato e ácido hexanoico também poderiam ser moduladas pelo tratamento de ECT. Mostramos ainda que a aplicação de CTE em ratos cus levou a uma forte correlação entre a composição de microbiota intestinal interrompida, os níveis de neurotransmissor hipocampo e a produção de SCFAs metabolite neuroativa. Ao todo, esses resultados identificam a ECT como um tratamento potencial para sintomas depressivos, restaurando a homeostase da microbiota intestinal para distúrbios do eixo microbiota-intestino-cérebro, abrindo novos caminhos no campo da neuropsicofarmacologia.

Keywords:Cistanche tubulosa, antidepressivo, estresse imprevisível crônico, microbiota intestinal, microbiota-intestino-cérebro eixo

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INTRODUÇÃO

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong em chinês) é oficialmente registrado como as hastes suculentas secas deCistanche deserticola(Y. C. Ma) eCistanche tubulosa(Schrenk) na Comissão Chinesa de Farmacocopoeia (2015). É uma conhecida medicina tradicional chinesa (TCM) para tratar deficiência renal, impotência, infertilidade feminina, leucorréia mórbida, metrorrhagia profusa,

e constipação senil (Comissão Chinesa de Farmacocopoeia, 2015). Estudos anteriores revelaram vários principais componentes químicos deCistanches Herba, incluindo feniltantanóides glicosides (PhGs), iridoides e glicosídeos iridoides, ligtanos, alditols, oligossacarídeos e polissacarídeos. A análise farmacológica mostrou que Cistanches Herba apresenta uma ampla gama de atividades neuroprotetoras, imunomodulatórias, anti-inflamatórias e hepatoprotetores (Jiang e Tu, 2009; Fu et al., 2017). Os PhGs têm sido considerados como os principais componentes ativos de Cistanches Herba possuindo várias atividades farmacológicas, tais como neuroprotetores, imunomodulatórios, anti-inflamatórios, hepatoprotetores, antioxidantes, etc. (Jiang e Tu, 2009; Fu et al., 2017).Cistanches Herbafoi originalmente gravado no Clássico da Medicina Herbal ("Shennong Bencao Jing" em chinês), um livro bem conhecido sobre plantas medicinais escrito entre cerca de 200 e 250 d.C., como uma "erva alta" que pode regular "cinco (vísceras) e sete (excesso de comer, raiva, umidade, frio, preocupação, vento e chuva, e medo) prejuízos" (Huang, 1982). Atualmente Cistanches Herba é amplamente aceito como um tônico de ervas para a debilidade geral (Fu et al., 2017).C. tubulosacápsulas gllicoside (Memoregain®) estão em uso para o tratamento da doença de Alzheimer (Guo et al., 2013). Um sistema dopaminérgico disfuncional é uma das principais patogêneses da hipótese de monoamina da depressão (Duman et al., 1997; Krishnan e Nestler, 2008). Echinacoside (um dos PhGs) e PhGs deSalsa cistancheforam encontrados para proteger neurônios dopaminérgicos contra a neurotoxicidade da dopamina (DA) induzida por 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) que pode aumentar os níveis de DA no estriado de camundongos C57 (Tian e Pu, 2005; Geng et al., 2007). Além disso, catalpol e geniposide são dois iridoides representativos em Cistanches Herba, e eles foram encontrados para amenizar o estresse imprevisível crônico (CUS)-induzido comportamento depressivo-semelhante através da restauração de disfunções do eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA) e catalpol pode aumentar a expressão fator neurotrópico derivado do cérebro (BDNF) expressão (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Além disso, a última publicação dá uma nova evidência de que cistanches Herba decoction reduziu significativamente o período de imobilidade no teste de suspensão da cauda do rato, o que sugere fortemente que Cistanches Herba possui potenciais qualidades semelhantes a antidepressivos (WangD. et al., 2017).

A medicina tradicional chinesa atrai a atenção crescente como tratamento da depressão devido aos seus efeitos colaterais relativamente moderados (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Vários tipos de TCMs, como compostos individuais da droga bruta (ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg3 e Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang G. L. et al., 2017), materiais medicinais chineses únicos (raiz de ginseng panax, rizoma Acorus tatarinowii e Morinda officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016), e decocções TCM (Kai-Xin-San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan e Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) têm sido profundamente estudados e mostrados para reverter ou mitigar sintomas semelhantes à depressão. Por exemplo, Kai-Xin-San foi encontrado para aliviar notavelmente os sintomas de ratos depressivos induzidos pelo CUS, aumentando a quantidade de neurotransmissores, fatores neutróficos e seus receptores correspondentes, e promovendo a expressão da densidade de espinha sinaptotípica e dendrítica (Yan et al., 2016).

No entanto, estudos anteriores do TCM dependem de resultados em testes comportamentais semelhantes a depressivos e focam no mecanismo farmacológico convencional de ação. A conexão entre a eficácia antidepressivo do TCM administrado oralmente e a microbiota intestinal não é bem compreendida. Evidências crescentes sustentam que a microbiota intestinal desempenha um papel crucial na regulação das funções cerebrais, particularmente a depressão e outros transtornos relacionados ao estresse (Foster e Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Por exemplo, o estresse crônico resulta na desregulação da estrutura microbiana intestinal de ratos, com diminuição na relação Firmicutes/Bacteroidetes, e, mais especificamente, diminuição da abundância relativa de Lactobacillus e aumento em Oscillibacter (Meng et al., 2017). Além disso, o transplante fecal de microbiota disregulada de pacientes deprimidos para camundongos livres de germes conferiu um fenótipo semelhante à depressão nesses animais, indicando que a microbiota intestinal disregulada causa sintomas comportamentais e fisiológicos de depressão e ansiedade (Kelly et al., 2016; Zheng et al., 2016). Em experimentos com animais, alguns moduladores de microbiota, como probióticos e prebióticos, foram encontrados para melhorar o comportamento semelhante à depressão em camundongos cronicamente estressados, amenizando a microbiota intestinal (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017).

Dada a associação entre microbiota intestinal e desenvolvimento de doenças, bem como a plasticidade da estrutura da microbiota intestinal, decidimos investigar os efeitos da microbiota intestinal para mediar a depressão que chamou nossa atenção e foi investigada (Chang et al., 2017; Xu et al., 2017). Para isso, foi realizada a análise combinada de meta stats (White et al., 2009) para análise da composição da microbiota intestinal. No presente estudo,C. tubulosafoi selecionado para avaliar seus efeitos antidepressivos, porque tem um nível mais alto de PhGs em comparação comC. deserticola. Um modelo de depressão induzido por CUS de rato foi estabelecido para explorar o impacto deC. tubulosaextrato (CTE, composto por 48,6% DeF, 6,9% glicosídeos iridoides e 20,0% de sacarídeos totais) em testes comportamentais, neurotransmissores de monoamina e fatores neurotróficos na produção de hipocampo e cólon, composição de microbiota intestinal e ácido graxo de cadeia curta (SCFA). Além disso, a relação funcional entre microbiota intestinal alterada mudou neurotransmissores e neurotrophins tanto no hipocampo quanto no cólon, e foi estudada concentração perturbada de SCFAs. A análise de correlação foi utilizada para comprovar evidências de que a ECT tem como alvo a microbiota intestinal para o tratamento da depressão, modulando o eixo microbiota-intestino-cérebro.

Cistanchepode aumentar a imunidade

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

Fluoxetine (FLX) foi comprada da Aladdin Industrial Inc. (Xangai, China). 5-hidroxitriptamina (5-HT), norepinefrita (NE) e kits BDNF ELISA foram comprados do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). O acetonitrilo de grau HPLC foi comprado da Merck (Darmstadt, Alemanha). A água desionizada foi preparada a partir de água destilada usando um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos). Todos os outros reagentes e produtos químicos utilizados eram de grau analítico.

Hastes secas deC. tubulosaforam coletados do Condado de Hetian (Xinjiang, China). As amostras do comprovante foram autenticadas pelo Prof. Xiaobo Li e depositadas no herbário da Escola de Farmácia da Universidade de Xangai Jiao Tong (Xangai, China). O em pó homogêneoC. tubulosaos caules foram suspensos em dez vezes de 70% de etanol, e o calor refluxo três vezes, cada um por 1h a 100°C. Os extratos foram filtrados por gaze, evaporados sob vácuo a 65°C e liofilizados. A amostra foi ressarbrada e depois separada pela resina macroporosa D101. Após a adsorção, a fração elucidada com água foi descartada. A ECT foi obtida após eluia com 40% de etanol, depois evaporada sob vácuo a 65°C e liofilizada.

Análise da Composição Química do CTE

O teor relativo de PhGs em CTE foi determinado pela espectrofotometria UV em 330 nm usando echinacoside como padrão. O teor relativo de iridoides e glicosídeos iridoides foi medido pela espectrofotometria UV com o método de comprimento de onda dupla para evitar a interferência espectral de PhGs (237 nm foi usado para quantificação espectroscópica, um ponto isobiástico 280 nm foi usado para comprimento de onda de referência), geniposide foi usado como padrão. O teor total de carboidratos de ECT foi determinado pelo método colorimétrico de ácido fenol-sulfúrico com glicose como padrão (Chow e Landhausser, 2004).

Os principais componentes químicos da CTE foram caracterizados pela UPLC-Q-TOF-MS. A análise UPLC-Q-TOF-MS foi realizada em um sistema UPLC de absolvição de águas (Waters Corp., Milford, MA, Estados Unidos) com uma coluna UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm i.d., 1,7 h, Waters Corp., Estados Unidos) por eluição gradiente usando acetonitrilo de ácido fórmico de 0,1% (A) e 0,1% ácido fórmico na água (B) a uma taxa de fluxo de 0,4 ml/min. O perfil de gradiente foi: 0-5 min (A: 5-20%), 5-7,5 min (A: 20-30%), 7,5-10 min (A: 30-70%), 10-11 min (A: 70-100%) e mantido por 1,5 min. O gradiente foi reciclado de volta para 5% em 0,5 min e mantido por 2,5 min para a próxima corrida. O volume de injeção foi de 3 [il. A temperatura do forno da coluna foi de 35°C.

A espectrometria de massa foi realizada usando um espectrômetro de massa Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, Estados Unidos). A ionização foi realizada no modo eletrospray negativo (ESI). Os parâmetros em MS foram os seguintes: tensão capilar, 2,0 kV; tensão do cone, 20 V; temperatura da origem, 120°C; temperatura de desolvação, 500°C; fluxos de gás de cone e desolação, 50 e 1.000 L/h, respectivamente. Para medição precisa da massa, a leucina-enkephalina foi usada como massa de bloqueio para gerar um íon [M-H]-ion (m/z 554.2615). Um experimento MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) em duas funções de varredura foi realizado da seguinte forma: função 1 (baixa energia): m/z 50-1.000, tempo de varredura de 0,25 s, atraso de 0,02 s inter-scan, 6 eV de energia de colisão; função 2 (alta energia): m/z 50-1.000, tempo de varredura de 0,25 s, atraso de 0,02 s inter-scan, rampa de energia de colisão de 20-45 eV. Os dados foram processados por meio do software UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, Estados Unidos).

Experimentos com animais

Os ratos machos Sprague-Dawley (200 20 g) foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pequim, China), e alojados no Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Xangai Jiao Tong (Xangai, China). Os animais foram alojados em grupos sob temperatura ambiente controlada (25 2°C, 55% de umidade relativa) com um ciclo claro-escuro de 12:12 h. Os ratos tiveram acesso gratuito a ratos de laboratório regulares e água por 1 semana. As instalações e protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Xangai Jiao Tong (Xangai, China).

Após 1 semana de aclimatação, 40 ratos ingênuos foram submetidos a um período de treinamento de sacarose de 72 h e testes de linha de base de sacarose. Os ratos foram divididos em cinco grupos (n = 8) com base em sua preferência de sacarose no teste de linha de base de sacarose (Figura Suplementar S1). O grupo controle e o grupo CUS receberam soro fisiológico (10 ml/kg). Para os outros três grupos, CTE em alta dose (CTEH) (400 mg/kg), baixa dose (CTEL) (200 mg/kg) e FLX (10 mg/kg) foram administrados intragastricamente 1h antes do procedimento cus (8:00 a.m. às 9:00 da manhã) ao longo de 4 semanas.

O estresse imprevisível crônico foi desenvolvido como descrito anteriormente (Willner, 1997; Xue et al., 2013), com exceção do grupo de controle não estressado, uma série de estressores foram aplicados aos ratos: iluminação estroboscópica de baixa intensidade durante a noite (120 flashes/min), ruído branco (100 dB) por 1h, privação de água por 24h, garrafas de água vazias por 1h (após privação de água), privação de alimentos por 24h, natação forçada (5min), contenção física (1-2 h), gaiola suja por 24 h (200 ml de água em cama de serragem de 100 g), pinça traseira (1 min), inclinação da gaiola de 45° por 24 h, choque por 30 min e iluminação durante a noite (12 h). Os estressores foram aplicados continuamente e aleatoriamente durante 4 semanas, dos quais os detalhes estão descritos na Tabela Suplementar S1. Alimentos e água estavam livremente disponíveis para o controle de ratos não estressados, que permaneceram imperturbáveis em outra sala, exceto pelo período de privação de 14 horas antes de cada teste de sacarose. Um rato morreu durante o procedimento da CUS. O teste de natação forçada (FST) foi realizado após

Foram realizados 4 dias de administração aguda e após 28 dias de estresse, teste de preferência de sacarose (TSP) (dia 29), teste de campo aberto (OFT) (dia 31) e teste de alimentação suprimido por novidades (NSFT) (dia 33). O esboço de um desenho para CUS e testes comportamentais é mostrado na Figura Suplementar S2.

Um teste de natação forçada foi realizado como descrito anteriormente (Porsolt et al., 1978). O procedimento consistiu em sessões de pré-teste e teste, utilizando o mesmo aparelho e condições (diâmetro de 20 cm, altura de 45 cm, contendo 25 cm de água mantida a 26°C). Durante a sessão pré-teste, os ratos foram forçados a nadar por 15 minutos; 24 h depois, os ratos foram colocados no mesmo aparelho para 5 min de sessão de teste de natação. O comportamento da natação dentro

Foram observados 5 min com uma câmera de vídeo, e a duração da imobilidade foi medida e analisada.

Para o SPT, os ratos foram primeiro treinados para consumir 1% (v/v) solução de sacarose por 72 h antes do SPT. O teste de linha de base de sacarose antes do procedimento cus e o SPT no final da CUS foram realizados como descrito anteriormente (Xue et al., 2013).

O teste de campo aberto foi realizado no final do procedimento cus, o aparelho e o método foram os mesmos detalhados anteriormente (Xue et al., 2013). Um sistema de rastreamento de vídeo (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) foi usado para registrar a distância total percorrida.

O teste de alimentação suprimido por novidades foi avaliado como descrito anteriormente (Xue et al., 2013) e a latência para começar a comer dentro de 5 min foi registrada e analisada.

Medição de Neurotransmissores e Fatores Neurotróficos

Após testes comportamentais, pelo menos quatro pelotas fecais foram obtidas de cada rato, colocadas em tubos cônicos estéreis, e imediatamente congeladas a —80OC para a análise da comunidade microbiana e scfas. Depois disso, os ratos foram sacrificados; o hipocampo e cólon foram isolados e pesado imediatamente. As amostras de tecido foram lavadas com soro fisiológico, congeladas em nitrogênio líquido e mantidas em — 80OC para armazenamento. Após o descongelamento sequencial em —20OC e 4OC, as amostras de tecido foram homogeneizadas em soro fisiológico e centrífugas por 25 min a 2.500 rpm/4OC. O supernante resultante foi coletado e armazenado em 4OC até o uso. Os níveis de 5-HT no hipocampo e cólon, NE no hipocampo e BDNF no hipocampo foram determinados por kits comerciais elisa de acordo com os protocolos do fabricante (Hou et al., 2017).

Cistanchepode aliviarrimdoença

Análise do Perfil Composicional da Microbiota Intestinal

O DNA total da microbiota intestinal a partir de amostras fecais foi extraído como descrito anteriormente (Wei et al., 2004). Cada amostra fecal (0,2 g) foi misturada em 1 ml PBS, e totalmente homogeneizada duas vezes, depois centrifugação a 200 g por 6 min. O supernante foi adicionado com 20 以 PVP de 20% e centrifusado a 300 g por 6 min. O supernante resultante foi então centrifutado a 12.000 g por 6 min e pelotas de células foram colhidas. As pelotas celulares foram lavadas pela PBS e depois resuspengidas em 300 lysates I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2。 , pH 8,0). A suspensão foi misturada com 100 以 solução de lisozímo (100 mg/ml) e 20 以 RNase de 1%, 37OC de banho quente por 30 min, depois adicionou 300 libras de lisato II (100 mM NaCl, 500 mM Base Tris, pH 8.0). A suspensão celular foi suavemente misturada com 50 以 20% SDS, banhada por gelo por 5 min. DNA foi então purificado por extração sequencial com 1% PVP, Álcool fenomil e cloroforme-isoamílico (vol/vol/vol/vol, 3.125:25:24:1), e álcool cloroforme-isoamílico (vol/vol, 24:1) seguido de precipitação a -20OC por 2h com dois volumes de etanol e 50 il [3 M NaAc. O DNA foi coletado por centrifugação, seco ao ar, e dissolvido em 100 il água deionizada estéril. A pureza do ácido nucleico foi testada usando um Espectótmetro NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos). O DNA genômico total foi então submetido à amplificação do PCR usando primers específicos para as regiões V3-V4 do gene 16S rRNA: primer forward 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') e o primer reverso 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). Os amplicons pcr foram purificados com contas Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Indianápolis, IN, Estados Unidos) e quantificados usando o PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Após a etapa de quantificação individual, os amplicons foram agrupados em quantidades iguais, e o sequenciamento de 2 x 300 bps foi realizado usando a plataforma Illumina MiSeq com o MiSeq Reagent Kit v3 na Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Xangai, China). As leituras emparelhadas foram montadas usando o software FLASH (versão 1.2.7), as leituras de sequência bruta foram aparadas com a qualidade do software QIIME (versão 1.8.0) para remover códigos de barras e sequências incompatíveis abaixo dos limites de comprimento. Posteriormente, as sequências filtradas foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com um limiar de 97% de similaridade sequencial usando QIIME com UCLUST. A diversidade beta foi realizada no QIIME para análise de coordenadas principais da UniFrac ponderada (PCoA). Finalmente, o software Meta stats foi utilizado para comparar as diferenças na composição taxonômica microbiana intestinal entre diferentes grupos.

Análise de Concentração de SCFAs

A concentração de SCFAs (incluindo acetato, propionato, butirato, isobutirato, ácido valerico, ácido isovalerico e ácido hexanoico) em amostras fecais de rato foram determinados por cromatógrafo a gás GC-2010 (Shimadzu, Japão), equipado com uma coluna DB-FFAP (30 m x 0,25 mm x 0,25 cm, Agilent, Estados Unidos). Soluções padrão de acetato, propionato, butirato, isobutirato, ácido valerico, ácido isovalerico e ácido hexanoico foram preparados em 1, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,01 e 0,005 mg/ml com éter (incluindo 2-ácido metil valéririco 0,1 mg/ml como padrão interno), respectivamente. Cada amostra fecal (0,2 g) foi misturada em 0,8 ml de água deionizada por vórtice e centrifugação a 5.000 rpm por 20 min a 4OC, 450 il de supernante foi adicionado por 50 il 50% H2SO4 e 500 il solução padrão interna, vórtice por 1 min e centrifugado a 12.000 rpm por 10 minutos, em seguida, a mistura foi colocada em 4OC por 30 min. O supernatante foi levado para análise gc. A análise dos SCFAs foi realizada como descrito anteriormente (Wang et al., 2016).

Análise estatística

Todos os dados foram apresentados como meios de análise estatística utilizando-se o software SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Estados Unidos) com uma ANOVA unidirecional seguida pelo teste de Dunnett ou teste t-test do Student. Os dados foram excluídos das análises se maiores que dois desvios-padrão da média. Valores de p< 0.05="" were="" considered="" statistically="" significant.="" pearson's="" correlation="" analysis="" was="" employed="" to="" evaluate="" the="" association="" between="" the="" relative="" abundance="" of="" gut="" microbiota,="" scfas,="" hippocampus="" 5-ht,="" ne,="" and="" bdnf="" levels,="" and="" colon="">

Cistanchepode aumentar a imunidade e diminuir a pressão arterial

RESULTADOS

Análise da Composição Química do CTE

A composição química do CTE foi analisada de forma abrangente. Como mostrado na Tabela 1, os Ect foram o principal componente do CTE, com teor relativo de 48,6%, os iridoides e os glícos iridoides foram de 6,9%, e o total de sacarídeos foi de 20,0%. Estes

os componentes do CTE foram então caracterizados por meio de UPLC-Q-TOF-MS. Um total de 27 constituintes foram detectados e identificados, incluindo 20 constituintes de PhGs, cinco iridoides e gllicosides iridoides, e dois oligossacarídeos. Informações detalhadas, incluindo tempo de retenção, íons de fragmentos de MS/MS precisos estão listadas em Informações de Suporte (Tabela Suplementar S2). O cromatografia total de íons UPLC-Q-TOF-MS (TIC) de CTE é mostrado na Figura Suplementar S3.

CTE melhorou os comportamentos depressivos em ratos cus

Nos ratos cus, o tempo total de imobilidade no FST e latência para comer em NSFT foram significativamente diminuídos pelo tratamento de CTE, e a preferência de sacarose no SPT e a distância total coberta em OFT foram aumentadas.

A Figura 1A ilustra os efeitos agudos do CTE sobre o tempo de imobilidade em FST em ratos cus. Em comparação com o grupo modelo CUS, a administração oral aguda de 3 dias de CTE reduziu significativamente o tempo total de imobilidade em FST [ANOVA unidirecional, F(3,26) = 4,983, p = 0,007]. Outra análise pós-dia revelou que a administração

TABELA 1 | composição química do extrato de C. tubulosa.de CTE com grupo de alta dose (teste de Dunnett, p< 0.05)="" and="" low="" dose="" group="" (dunnett's="" test,p="">< 0.05)="" showed="" a="" marked="" reduction="" in="" the="" total="" immobility="" time="" in="" the="">

Os efeitos do CTE na preferência de sacarose em SPT em ratos CUS são mostrados na Figura 1B. O procedimento de estresse de 28 dias causou uma diminuição significativa da preferência de sacarose no grupo modelo CUS em comparação com o controle de ratos não estressados [ANOVA unidirecional, F(4,34) = 3,993, p = 0,009; Teste de Dunnett, p< 0.05],="" indicating="" that="" the="" cus="" model="" was="" successfully="" developed.="" as="" the="" positive="" control,="" flx="" group="" significantly="" increased="" the="" sucrose="" preference="" in="" cus="" rats="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.05],="" demonstrating="" the="" predictive="" validity="" of="" cus="" model.="" chronic="" oral="" administration="" of="" cte="" in="" high="" dose="" group="" showed="" key="" effects="" on="" sucrose="" preference="" [one-="" way="" anova,="" f(4,34)="3.993,p" =="" 0.009;="" dunnett's="" test,p="">< 0.01],="" which="" restored="" it="" to="" normal="" levels="" in="" cus="" rats.="" cte="" with="" the="" low="" dose="" group="" showed="" an="" increasing="" trend="" but="" the="" effect="" was="" not="" statistically="" significant="" (dunnett's="" test,="" p="">

Como mostrado na Figura 1C, a distância total percoberta em OFT também foi utilizada para avaliar os efeitos da CTE em ratos cus. Em comparação com ratos sem estresse, o grupo modelo CUS manifestou uma distância total muito menor [ANOVA unidirecional, F(4,34) = 7,845, p = 0,0001; Teste de Dunnett, p< 0.001]="" after="" a="" 4-week="" exposure="" to="" cus,="" and="" the="" positive="" control="" flx="" treatment="" increased="" the="" total="" distance="" in="" cus="" rats="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.05].="" daily="" oral="" administration="" of="" cte="" with="" high="" dose="" and="" low="" dose="" showed="" an="" evident="" effect="" on="" the="" total="" distance="" in="" cus="" rats="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.01="" for="" high="" dose="" group,="" p="">< 0.001="" for="" low="" dose="" group,="" respectively].="" supplementary="" figure="" s4="" shows="" the="" activity="" track="" map="" in="">

A Figura 1D mostra os efeitos do CTE na latência para comer no NSFT em ratos CUS. O procedimento de estresse de 28 dias causou um aumento significativo da latência para começar a comer no grupo modelo CUS em comparação com o controle de ratos não estressados [ANOVA unidirecional, F(4,33) = 3,434, p = 0,019; Teste de Dunnett, p< 0.05],="" indicating="" that="" the="" cus="" model="" was="" successfully="" developed.="" longterm="" oral="" administration="" of="" cte="" with="" a="" high="" dose="" showed="" evident="" effects="" on="" latency="" to="" begin="" eating="" compared="" with="" the="" cus="" group="" (student's="" t-test,="" t="2.759," p="">< 0.05),="" while="" a="" low="" dose="" of="" cte="" showed="" no="">

CTE restaurou o nível de neurotransmissores e fatores neurotróficos em ratos cus

Os efeitos da CTE nos níveis 5-HT e NE no hipocampo de ratos CUS são mostrados nas Figuras 2A,B. O procedimento de estresse de quatro semanas causou uma redução significativa de 5-HT [ANOVA unidirecional, F(4,34) = 17,13, p = 0,0001; Teste de Dunnett, p< 0.001]="" and="" ne="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="6.376,p" =="" 0.0006;="" dunnett's="" test,="" p="">< 0.001]="" concentration="" in="" the="" hippocampus="" of="" cus="" rats="" compared="" with="" that="" in="" control="" group,="" and="" the="" antidepressant="" flx="" significantly="" restored="" 5-ht="" levels="" in="" the="" hippocampus="" [one-way="" anova,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.001].="" after="" oral="" administration="" of="" cte="" in="" high="" dose="" group,="" significant="" increase="" in="" 5-ht="" level="" was="" observed="">

ANOVA, F(4,34) = 17,13, p = 0,0001; Teste de Dunnett, p< 0.001]="" while="" the="" ne="" concentrations="" were="" not="" changed.="" similarly,="" bdnf="" expression="" was="" significantly="" reduced="" in="" the="" cus="" model="" group="" compared="" with="" the="" non-stressed="" rats="" (student's="" t-test,="" t="4.171," p="">< 0.01)="" (figure="" 2c).="" both="" long-term="" oral="" administration="" of="" cte="" with="" high="" dose="" (student's="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" and="" flx="" (student's="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0.05)="" increased="" bdnf="" expression="" compared="" with="" cus="" model="" group.="" cte="" with="" low="" dose="" showed="" no="" significant="" effect="" on="" bdnf="">

O nível de 5-HT no cólon dos ratos cus era diferente do do hipocampo, e o procedimento de estresse de 4 semanas não teve impacto no cólon 5-HT (Figura 2D). Por outro lado, a administração oral de CTE com alta dose estimulou níveis de 5-HT no cólon quando comparada com o grupo modelo CUS (Teste T do Aluno, t = 2.173, p< 0.05).="" cte="" with="" a="" low="" dose="" showed="" no="" effect="" on="" colon="" 5-ht="">

CTE Regulada a Composição Microbiana intestinal de ratos cus

O efeito do CTE na composição microbiana intestinal dos ratos CUS foi avaliado pelo método baseado em sequenciamento genético 16S rRNA. Verificou-se que 28 dias de administração oral de CTE alteraram a composição microbiana intestinal de ratos cus e impactaram vários

Níveis taxonômicos microbianos entre grupos de ratos (nível 1 de classe, nível de ordem 1, nível 1 familiar, gênero nível 8 e nível de espécie 2). Isso sugere que a comunidade microbiana intestinal poderia desempenhar um papel nos efeitos antidepressivos do CTE. Informações detalhadas da taxa microbiana intestinal significativamente alterada em diferentes níveis taxonômicos são mostradas na Tabela 2.

O sequenciamento MiSeq rendeu um total de 2.132.980 leituras brutas, seguindo o controle de qualidade, denoizando e processo de remoção da quimera. Em seguida, as leituras foram agrupadas em OTUs, que foram atribuídas à taxa de filo ao nível de espécie. O estudo da análise da diversidade beta foi realizado para explorar a similaridade dos padrões da comunidade bacteriana entre os cinco grupos de ratos. PCoA baseado em distâncias ponderadas unifrac de microbiota intestinal dos cinco grupos de ratos de estudo é mostrado na Figura 3A. A análise da diversidade beta pela PCoA mostrou uma clara separação da comunidade microbiana do grupo controle e do grupo modelo CUS, enquanto o CTE com grupo de alta dose tende a estar mais próximo do grupo controle em comparação com o grupo CUS.

A análise metastática foi utilizada para investigar as diferenças na composição taxonômica microbiana intestinal entre diferentes grupos. No nível de fiúrio, a taxa microbiana mais dominante nos cinco grupos de ratos foram Firmicutes e Bacteroidetes (Figura 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides e Prevotella foram os mais abundantes taxas microbianas no nível do gênero (Figura 3C). Os dois filos dominantes, Firmicutes e Bacteroidetes, foram responsáveis por uma abundância relativa combinada de >90%. Como mostrado nas Figuras Suplementares S5A, B, o procedimento de estresse de 4 semanas causou uma tendência não significativa para um aumento do nível de Firmicutes e uma diminuição não significativa de Bacteroidetes no grupo modelo cus em comparação com o grupo controle. Após a administração diária de CTE com alta dose e baixa dose, a abundância relativa de Firmicutes e Bacteroidetes retornou a níveis semelhantes do grupo controle, embora sem significância estatística. E embora tenham sido observadas alterações semelhantes na razão Firmicutes/Bacteroidetes entre os grupos de ratos, não foram apresentadas diferenças estatísticas (Figura Suplementar S5C). Uma tendência não significativa para um nível reduzido de filia cianobactéria foi encontrada no grupo modelo CUS em comparação com os ratos não estressados de controle; enquanto a administração de CTE com alta dose resultou em um aumento significativo na abundância relativa de cianobactérias em comparação com o grupo CUS (Figura Suplementar S5D).

No nível do gênero, Bacteroides e Ruminococcus foram dois dos mais abundantes taxas microbianas que representaram aproximadamente 30% de abundância relativa em todos os cinco grupos de ratos. O procedimento de estresse de quatro semanas causou uma redução significativa na abundância relativa de Bacteroides e um aumento significativo de Ruminococcus no grupo modelo CUS em comparação com o controle de ratos não estressados (Figuras 4A, B). A administração de longo prazo da CTE resultou em um aumento significativo na abundância de Bacteroides, bem como uma diminuição significativa do Ruminococcus em comparação com os ratos cus. Além disso, seis gêneros de Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus e Brachybacterium apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre o grupo modelo CUS e o grupo controle (Figuras 4C-H). Após 28 dias de tratamento de ECT, a abundância relativa dos seis gêneros acima mencionados foi respectivamente alterada para níveis semelhantes ao grupo controle.

A baixa abundância de Deinococcus em diferentes níveis taxonômicos, incluindo nível de classe (Deinococci), nível de ordem (Deinococcales), nível familiar (Deinococcaceae) e nível de gênero (Deinococcus) foi detectada no grupo de ratos cus, enquanto não foi detectado no grupo de controle e nos grupos administrativos (Figuras 5A-D).

No nível das espécies, Weissella beninensis foi muito menor no grupo CUS do que no grupo controle, e um aumento significativo na abundância relativa foi observado após a administração de CTE com uma dose elevada (Figura 5E). Por outro lado, a administração da CTE reverteu o aumento significativo da abundância relativa do conglomerado Brachybacterium observado nos ratos cus (Figura 5F).

CTE Modulado SCFAs em Ratos CUS

As concentrações de SCFAs (incluindo acetato, propionato, butirato, isobutirato, ácido valerico, ácido isovalerico e ácido hexanoico) em amostras fecais de ratos foram analisadas por GC e são mostradas na Figura 6. Os níveis de acetato [ANOVA unidirecional, F(4,32) = 2,721, p = 0,0467; Teste de Dunnett, p< 0.05]="" and="" hexanoic="" acid="" [one-way="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="0.0328;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.05]="" were="" significantly="" increased="" in="" the="" cus="" model="" group="" rats="" compared="" to="" the="" control="" group.="" after="" longterm="" administration="" of="" cte="" with="" high="" dose,="" acetate="" (student's="" t-test,="" t="2.182," p="">< 0.05)="" and="" hexanoic="" acid="" [one-way="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="0.0328;" dunnett's="" test,="" p="">< 0.05]="" concentrations="" were="" predominantly="" decreased="" when="" compared="" with="" cus="" group,="" indicating="" cte="" might="" exert="" its="" anti-depressant="" activity="" via="" modulating="" the="" disordered="" neuroactive="" metabolite="" scfas.="" administration="" of="" cte="" with="" low="" dose="" group="" showed="" a="" decreasing="" trend="" but="" no="" remarkable="" effect="" on="" acetate="" and="" hexanoic="" acid="">

Análise de Correlação da Microbiota Intestinal, Neurotransmissores e Neurotrophins no Hipocampo, 5-HT em Cólon e SCFAs

Para explorar a relação funcional da microbiota intestinal alterada no nível do gênero, foram desenvolvidos neurotransmissores e neurotrophins alterados no hipocampo e cólon, e a concentração perturbadora de SCFAs, foram desenvolvidos coeficientes de correlação de Pearson (Meng et al., 2017). Correlações entre eles (r > 0,4 ou r< -0.4,="" p="">< 0.05)="" are="" shown="" in="" figure="" 7.="" the="" coefficients="" indicated="" strong="" correlations="" between="" altered="" gut="" microbiota="" composition="" in="" genus="" level,="" the="" concentration="" of="" seven="" types="" of="" scfas,="" and="" depression-related="" monoamine="" neurotransmitters="" (5-ht="" and="" ne).="" the="" abundance="" of="" ruminococcus="" showed="" a="" significant="" negative="" correlation="" with="" a="" 5-ht="" concentration="" in="" the="" hippocampus,="" which="" means="" that="" the="" cus="" procedure="" leads="" to="" an="" increment="" in="" the="" relative="" abundance="" of="" ruminococcus="" and="" a="" decrement="" in="" 5-ht="" concentrations.="" after="" treatment="" with="" cte,="" the="" relative="" abundance="" of="" ruminococcus="" was="" reduced="" to="" the="" level="" of="" the="" control="" group,="" and="" the="" 5-ht="" levels="" were="" found="" to="" have="" improved.="" further,="" the="" relative="" abundance="" of="" bacteroides="" was="" positively="" correlated="" with="" a="" 5-ht="" level="" in="" the="" hippocampus,="" and="" negatively="" associated="" with="" the="" concentration="" of="" butyrate,="" isobutyrate,="" valeric="" acid,="" isovaleric="" acid,="" and="" hexanoic="" acid;="" the="" abundance="" of="" parabacteroides="" displayed="" a="" significant="" positive="" correlation="" with="" a="" 5-ht="" level="" in="" the="" hippocampus="" and="" propionate="" concentration,="" while="" it="" showed="" a="" negative="" correlation="" with="" isobutyrate="" and="" isovaleric="" acid="" concentrations;="" a="" significantly="" positive="" association="" between="" the="" relative="" abundance="" of="" butyricimonas="" and="" ne="" level="" in="" the="" hippocampus="" was="" also="" observed,="" and="" the="" relative="" abundance="" of="" deinococcus="" was="" positively="" correlated="" with="" acetate="" concentration.="" this="" demonstrated="" that="" cte="" might="" exert="" its="" anti-depressant="" activity="" by="" changing="" the="" composition="" of="" the="" gut="" microbiota,="" disturbing="" hippocampus="" neurotransmitter="" levels,="" and="" restoring="" neuroactive="" metabolites="" scfas.="" detailed="" data="" of="" correlation="" analysis="" is="" shown="" in="" supplementary="" table="">