Parte 1:Acteosídeo neutraliza processos catabólicos induzidos por interleucina-1 -através da modulação de proteínas quinases ativadas por mitógenos e da via de sinalização celular NFκB

Acteoside neutraliza processos catabólicos induzidos por interleucinas por meio da modulação de proteínas quinases ativadas por mitógenos e da via de sinalização celular NFκB

HyangI Lim ,1 Do Kyung Kim ,1 Tae-Hyeon Kim ,1 Kyeong-Rok Kang ,1 Jeong-Yeon Seo ,1,2 Seung Sik Cho ,3 Younghee Yun ,4,5 Ye-yong Choi ,4,5 Jungtae Leem ,4,5 Hyoun-Woo Kim ,6 Geon-Ung Jo ,6

Chan-Jin Oh ,6 Deuk-Sil Oh ,6 Hong-Sung Chun ,2 e Jae-Sung Kim 1

Contato:joanna.jia@wecistanche.com

1Institute of Dental Science, Chosun University, Gwangju 61452, República da Coreia

2Departamentos de Ciências Biomédicas, Universidade Chosun, Gwangju 61452, República da Coreia

3Departamento de Biomedicina, Ciências da Convergência da Saúde e Vida, BK21 Four, Faculdade de Farmácia, Universidade Nacional de Mokpo,

Jeonnam 58554, República da Coreia

4Chung-Yeon Medical Institute, Gwangju 61949, República da Coreia

5Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, CY Pharma Co., Seul 06224, República da Coreia

6Jeollanamdo Forest Resources Institute, Naju, Jeollanamdo, 58213, República da Coreia

A correspondência deve ser endereçada a Jae-Sung Kim; js_kim@chosun.ac.kr

Recebido em 2 de julho de 2020; Revisado em 15 de fevereiro de 2021; Aceito em 6 de março de 2021; Publicado em 25 de março de 2021

Editor Acadêmico: Joël R. Drevet

Copyright © 2021 HyangI Lim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob CreativeCommonsAttributionLicense,

que permite uso irrestrito, distribuição,e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.

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A osteoartrite (OA) é a doença articular degenerativa mais comum com dor articular crônica causada pela degeneração progressiva da cartilagem articular nas articulações sinoviais.Acteosídeo, um glicosídeo cafeoilfeniletanoide, possui várias atividades biológicas, como efeito antimicrobiano, anti-inflamatório, anticancerígeno, antioxidante, citoprotetor e neuroprotetor. Além disso, a administração oral deacteósidoem alta dosagem não causa genotoxicidade. Portanto, o objetivo do presente estudo é verificar os efeitos anticatabólicos daacteósidocontra a osteoartrite e sua via de sinalização anticatabólica.Acteosídeonão diminuiu a viabilidade de células de fibroblastos L929 de camundongo usadas como células normais e condrócitos primários de ratos.Acteosídeoneutralizaram a perda de proteoglicanos induzida por IL-1 -nos condrócitos e cartilagem articular, suprimindo a expressão e ativação de enzimas de degradação de cartilagem, como matriz metaloproteinase- (MMP-) 13, MMP-1 e MMP{{ 6}}. Além disso,acteósidosuprimiu a expressão de mediadores inflamatórios como óxido nítrico sintase induzível, ciclooxigenase-2, óxido nítrico e prostaglandina E2 nos condrócitos primários de rato tratados com IL-1 . Subsequentemente, a expressão de citocinas pró-inflamatórias foi diminuída poracteósidonos condrócitos primários de rato tratados com IL-1 . Além disso, o acteosídeo suprimiu não apenas a fosforilação de proteínas quinases ativadas por mitógenos em condrócitos primários de ratos tratados com IL-1, mas também a translocação de NFκB do citosol para o núcleo através da supressão de sua fosforilação. A administração oral de 5 e 10mg/kg de acteosídeo atenuou a degeneração progressiva da cartilagem articular no modelo de camundongo osteoartrítico gerado pela desestabilização do menisco medial. Nossos achados indicam que o acteosídeo é um potencial agente ou suplemento anticatabólico promissor para atenuar ou prevenir a degeneração progressiva da cartilagem articular.

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1. Introdução

A osteoartrite (OA) é a doença articular degenerativa mais comum com dor articular crônica causada pela degeneração progressiva da cartilagem articular nas articulações sinoviais [1].

Devido ao aumento da expectativa de vida, a prevalência de OA com perda de mobilidade e dor articular crônica causada pela degeneração progressiva da cartilagem articular nas articulações sinoviais é estimada em 18% e 9,6% em mulheres após a menopausa e em homens, respectivamente [2 ]. Embora a prevalência mundial da OA aumente anualmente, a etiologia fisiopatológica da OA ainda é desconhecida. Pode ser causada por fatores de risco muito complexos e multifatoriais, como envelhecimento, sexo, herança genética, lesão articular traumática e carga mecânica articular grave. Além disso, as relações neuropatológicas entre a degeneração progressiva da cartilagem articular e o desenvolvimento de dor articular crônica são desconhecidas [3]. Assim, o objetivo do manejo clínico de pacientes com OA é a manutenção da mobilidade corporal e da função articular mecânica por meio do alívio da dor articular crônica, usando abordagens farmacológicas e não farmacológicas e cirurgia de substituição articular. A demanda pelo desenvolvimento de intervenção ou suplementação efetiva, com segurança biológica de longo prazo, para prevenir ou atenuar a OA para manter a qualidade de vida por meio da manutenção da função mecânica articular na população idosa é crescente.

Conforme mostrado na Figura 1,acteósido(CAS No. 61276-17-3; C29H36O15) é um glicosídeo cafeoilfeniletanoide isolado de várias plantas herbáceas, como cloretos de Verbascum [4], Buddleja globosa [5] e Plantago australis [6]. Acteoide tem várias atividades biológicas como antimicrobiana [5], anti-inflamatória [7], anticancerígena [8], antioxidante [9], citoprotetora [9] e efeito neuroprotetor [10]. Além disso, a administração oral deacteósidoem alta dosagem não causa genotoxicidade[11].

Assim, levantamos a hipótese de que o acteosídeo com segurança biológica antiinflamatória tem efeitos anticatabólicos associados à proteção da cartilagem articular contra a degeneração progressiva da cartilagem articular através da supressão de fatores catabólicos, como as citocinas pró-inflamatórias, mediadores inflamatórios e enzimas de degradação da cartilagem nas articulações sinoviais. . Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar aacteoside-induziu efeitos anticatabólicos e sua via de sinalização celular tanto in vitro, utilizando condrócitos primários isolados da cartilagem articular da articulação do joelho de rato, quanto in vivo, utilizando um modelo animal de OA gerado pela desestabilização cirúrgica do menisco medial na articulação do joelho de camundongos.

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2. Métodos

2.1. Cultura de células.

Condrócitos primários de ratos foram isolados da cartilagem articular de articulações do joelho de ratos (5-dia de idade; Sprague–Dawley), de acordo com o protocolo (CIA- CUC2019-A0027) aprovado pelo Instituto Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Chosun, Gwangju, República da Coréia. Condrócitos primários isolados de rato foram mantidos em Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Life Technologies , Grand Island, NY, EUA), antibióticos (penicilina 50U/mL e estreptomicina 50ug/mL) e ácido ascórbico 50ug/mL. A linhagem celular de fibroblastos L-929 de camundongo normal foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC). De acordo com as instruções fornecidas pela ATCC, as células L{14}} foram cultivadas no meio mínimo essencial de Eagle, contendo 10 por cento de FBS, e foram cultivadas em uma incubadora umidificada a 37 graus com 5 por cento de CO2.

2.2. Ensaio de Viabilidade Celular.

O ensaio de sal dimetil tiazolil difenil tetrazólio (MTT) foi realizado para avaliar a viabilidade de células da linhagem celular de fibroblastos L929 de camundongo usadas como uma célula normal e condrócitos primários de rato tratados com acteosídeo. Resumidamente, células L929 e condrócitos primários de rato foram cultivados a uma densidade celular de 8×105 células/mL em placas de cultura por 24h e depois tratados com 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100μMacteósidopor 24h. Após o tratamento com solução de MTT, tanto as células L929 quanto os condrócitos foram cultivados por 4h. Após a incubação, os cristais de MTT formados foram suspensos completamente em dimetilsulfóxido e medidos quanto à absorbância em 570 nm usando um espectrômetro (espectrofotômetro de microplacas Epoch, BioTek®, Winooski, VT, EUA) para avaliar a viabilidade celular.

2.3. Ensaio de células vivas/mortas.

A sobrevivência celular foi realizada usando o kit de ensaio Cell Live/Dead (Molecular Probes, Carlsbad, CA, EUA), que é composto de calceína-AM verde para marcação de células vivas (com fluorescência verde) e homodímero de etídio-1 para marcação de células mortas células (com fluorescência vermelha). Resumidamente, tanto as células L929 quanto os condrócitos primários de rato foram cultivados a uma densidade celular de 8×105 células/mL em lâminas de câmara (sistema Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) por 24h e depois tratados com 50 e 100μM de acteosídeo por 24h. Após o cultivo, foi realizado um ensaio de sobrevivência celular de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, as células coradas foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Ensaio de azul de dimetilmetileno (DMMB).

O ensaio de DMMB foi realizado para avaliar a alteração do conteúdo de proteoglicanos em condrócitos primários de ratos tratados com acteosídeo por 21 dias na presença ou ausência de IL-1 . Para manter as características dos condrócitos primários de rato por 21 dias, os condrócitos primários de rato (2 × 106 células) foram suspensos em 1 mL de alginato a 1,2 por cento e então encapsulados por gotejamento da suspensão de células/alginato em uma solução de 105mM CaCl2. Os condrócitos primários de rato encapsulados em alginato foram cultivados por 24h em DMEM/F12 (contendo 10 por cento de FBS, 50U/mL de penicilina, 50ug/mL de estreptomicina e 50ug/mL de ácido ascórbico) e depois adaptados por 24h em DMEM/F12 contendo 1 por cento mini-insulina-transferrina-selênio (mini-ITS) e ácido ascórbico 50ug/mL. Posteriormente, os condrócitos foram tratados com 50 ou 100μMacteósidona presença ou ausência de 1ng/mL de IL-1 por 21 dias. No dia 21, os condrócitos primários de rato foram coletados para avaliação do teor de proteoglicano usando o ensaio DMMB, conforme descrito anteriormente [12]. Além disso, para quantificar o conteúdo de proteoglicanos por célula e avaliar a proliferação de condrócitos primários de rato, o número de células foi medido por ensaio de DNA usando PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante. presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 7 dias. Ao final do período de cultivo, as amostras foram coletadas e fixadas em paraformaldeído a 4% por 72h para análise histológica.

2.6. Análise Histológica.

A análise histológica usando safranina-O e coloração fast green foi realizada para verificar a perda de proteoglicanos na cartilagem articular tratada com 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL IL-1 por 7 dias. Resumidamente, amostras fixas de cartilagem articular foram descalcificadas em ácido etilenodiaminotetracético e então incluídas em parafina. Em seguida, os blocos de parafina preparados contendo cartilagem articular foram fatiados em série com 5μm de espessura e colocados em lâminas. Safranina-O e coloração verde rápido foram subsequentemente realizadas para avaliar a perda de proteoglicanos na substância fundamental da cartilagem articular. Além disso, coloração de hematoxilina e eosina foi realizada para observar a morfologia geral da cartilagem articular.

2.7. Blotting Ocidental.

Western blotting foi realizado para investigar a expressão de fatores catabólicos, incluindo MMP-13, MMP-1, MMP-3, sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) e ciclooxigenase-2 (COX -2) e a alteração de moléculas de sinalização celular, como proteínas quinases ativadas por mitógenos e fator nuclear-kappa B (NFκB). Resumidamente, condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 ou 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Em seguida, os condrócitos primários de rato foram colhidos por centrifugação e lisados ​​usando tampão de lise (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Além disso, para verificar a translocação nuclear de NFκB, condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 ou 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Em seguida, as frações citosólica e nuclear foram extraídas com os reagentes de extração nuclear e citoplasmática NE-PER™ (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de proteína total extraída de condrócitos primários de rato foi determinada usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Além disso, o meio condicionado foi coletado para detectar os níveis de enzimas de degradação da cartilagem secretadas pelos condrócitos. Quantidades iguais de proteína e meio condicionado foram submetidas a eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e depois transferidas para membranas de nitrocelulose. Posteriormente, Western blotting foi realizado usando anticorpos primários direcionados contra MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, fosfo-ERK1/2, total -ERK1/2, fosfo-p38, total-p38, fosfo-JNK, total JNK, fosfo-NFκB, total NFκB, -actina e lâmina B. As bandas imunorreativas foram visualizadas usando um sistema de quimioluminescência aprimorado (Thermo Scientific, Rockford , IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, fotografado por um dispositivo Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Jerusalém, Israel).

2.8. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) e PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR).

Os condrócitos primários de rato foram tratados com 50 ou 100μMacteósidona presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Em seguida, o RNA total foi isolado dos condrócitos primários de rato usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração total de RNA foi medida usando um NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). Para sintetizar o cDNA, 1ug ​​de RNA foi transcrito reverso usando um sistema de transcrição reversa-PCR ThermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A qPCR do cDNA foi realizada usando 2× TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seul, República da Coréia) e primers específicos em um dispositivo TaKaRa PCR Thermal Cycler (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japão). Em seguida, os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose para determinar os níveis de expressão dos genes alvo. A gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada como controle endógeno. Além disso, para qRT-PCR, o cDNA foi amplificado usando um sistema Eco™ Real-Time PCR (illumine Inc., San Diego, CA, EUA). -Actina foi usada como controle endógeno. As sequências dos primers usados ​​na qPCR e qRT-PCR estão resumidas nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.

2.9. Gelatina Zimografia.

A zimografia de gelatina foi realizada para avaliar a ativação de MMPs em condrócitos primários de ratos. Resumidamente, os condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 ou 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Em seguida, um volume igual de meio condicionado foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida a 10 por cento copolimerizado com gelatina de pele de suíno a 0,2 por cento (1 mg/mL). Após a eletroforese, o gel foi incubado em tampão de renaturação de zimograma (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl e 0,05 por cento Brij-35) a 37 graus por 72h. Após a renaturação das MMPs, o gel foi corado com 0,1 por cento de Coomassie Brilliant Blue R250. As bandas gelatinolíticas foram reveladas como bandas claras em um fundo uniformemente corado em azul claro e então fotografadas usando uma câmera digital.

2.10. Medição de Óxido Nítrico (NO).

Condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 ou 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Depois disso, 50μL do meio condicionado foi reagido com 50μL cada de sulfanilamida e dicloridrato de N-1-naftil etilenodiamina. A absorbância foi então medida no comprimento de onda de 540 nm usando um espectrofotômetro (Epoch Spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, EUA).

2.11. Ensaio de Prostaglandina E2 (PGE2).

Os condrócitos primários de rato foram tratados com 50 ou 100μMacteósidona presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Posteriormente, a concentração de PGE2 foi medida usando um kit de ensaio de parâmetro de PGE2 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

2.12. Matriz de citocinas.

Condrócitos primários de rato foram tratados com 50μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Em seguida, as proteínas totais foram extraídas e quantificadas conforme descrito anteriormente [13]. Em seguida, foi realizado um array de citocinas para investigar a alteração na produção de citocinas, de acordo com as instruções do fabricante (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, EUA).

2.13. Ensaio de Translocação Nuclear.

Condrócitos primários de rato foram tratados com 50 e 100ug/mLacteósidona presença de 10ng/mL IL-1 . Após 30 minutos, os condrócitos primários de ratos foram fixados com paraformaldeído a 1 por cento, permeabilizados em Triton X a 0,2 por cento-100 e lavados extensivamente com solução salina tamponada com fosfato. Sinais não específicos foram bloqueados usando soro de cabra normal. Após várias lavagens, os condrócitos foram incubados com anticorpos anti-NFκB de coelho seguidos de incubação com IgG de cabra anti-coelho conjugado com FITC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) durante a noite a 4 graus. Em seguida, as células coradas foram fotografadas usando um sistema de microscópio de varredura confocal a laser (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) na filial de Gwangju do Korea Basic Science Institute (Gwangju, República da Coréia).

2.14. Geração de Animais Osteoartríticos.

Para gerar animais osteoartríticos, o menisco medial (DMM) foi desestabilizado cirurgicamente nas articulações do joelho de camundongos BALB/c (peso corporal médio 19:3±0:5g) de acordo com as diretrizes do IACUC (CIACUC{{4} }A0029). Os animais induzidos por OA foram tratados oralmente com 5 e 10mg/kg de acteosídeo resolvidos em 5 por cento de etanol (grupo experimental; n =5) ou veículo (5 por cento de etanol) (grupo DMM; n =5) a cada outro dia por 8 semanas. Ao final do período de cultura, as articulações do joelho foram dissecadas e fixadas com paraformaldeído 5 por cento por 7 dias para avaliação histológica. Após safranina-O e coloração verde rápida, os tecidos da cartilagem articular foram examinados de acordo com o grau de Mankin [14, 15].

2.15. Análise Estatística.

Os dados experimentais são apresentados como média ± desvio padrão e foram comparados usando análise de variância, seguido de comparações múltiplas post hoc (teste de Tukey) usando o software SPSS versão 25 (IBM Corp.) Todos os dados, exceto o estudo animal, foram obtidos de três experimentos independentes.

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3. Resultados

3.1. Acteoside não afeta a viabilidade da célula L929 e dos condrócitos primários do rato.

A linha celular de fibroblastos de camundongo L929 usada como células normais foi tratada com 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100μM de acteosídeo por 24h. Em seguida, o ensaio MTT foi realizado para avaliar a citotoxicidade do acteosídeo em células L929. Conforme mostrado na Figura 2(a), as viabilidades relativas das células L929 foram determinadas como 94:8±8 por cento, 93:6±7 por cento, 100 ± 5 por cento, 103:9± 5 por cento, 126:1±8 por cento e 122:7±4 por cento a 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100μM de acteosídeo, respectivamente, em comparação com o controle (100:02 ± 3 por cento). Além disso, para verificar a citotoxicidade do acteosídeo em condrócitos primários de rato, o ensaio de MTT foi realizado conforme mostrado na Figura 2(b). As viabilidades de condrócitos primários de rato tratados com 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100μM de acteosídeo foram determinadas como 114 ± 4 por cento, 117:8±6 por cento, 123:9±5 por cento, 132:6±4 por cento, 153:1±7 por cento e 142:1±6 por cento, respectivamente, em comparação com o controle (100:4±5 por cento). Além disso, para confirmar o efeito do acteosídeo na viabilidade de ambas as células L929 e condrócitos primários de rato, um ensaio Cell Live/Dead foi realizado como mostrado na Figura 2(c). O número de células mortas coradas como fluorescência vermelha não aumentou para células L929 e condrócitos primários de rato tratados com 50 e 100μM de acteosídeo por 24h. Esses dados demonstraram consistentemente que a dosagem definida deacteósidonão afetou a viabilidade de células L929 e condrócitos primários de rato. Assim, actosídeos 50μM e actosídeos 100μM, que são doses não tóxicas tanto em células L929 quanto em condrócitos primários de ratos, foram usados ​​para verificar seus efeitos anticatabólicos em estudos in vitro usando condrócitos primários de ratos.

3.2. Acteoside neutraliza IL-1 -perda de proteoglicano induzida em condrócitos primários de rato.

Condrócitos primários de rato incorporados em grânulos de alginato foram tratados com 50 e 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 1ng/mL de IL- 1 por 21 dias. Em seguida, foi realizado um ensaio de DMMB para avaliar a alteração no teor de proteoglicanos, conforme mostrado na Figura 3(a). Os teores relativos de proteoglicanos foram determinados como 88:3±18:1 por cento e 86:8±16:3 por cento nos condrócitos primários de rato tratados com 50 e 100μM de acteosídeo, respectivamente, em comparação com o controle (103:8± 32:3 por cento). Embora os conteúdos relativos de proteoglicanos tenham diminuído pelo acteosídeo, esses resultados não foram significativos. No entanto, o conteúdo relativo de proteoglicano diminuiu significativamente em 37:1 ± 14:7 por cento nos condrócitos primários de rato tratados com 1ng/mL de IL-1 , mas 50 e 100μM de acteosídeo reduziram significativamente o conteúdo de proteoglicano em 57 ± 12:4 por cento e 64 ± 14:5 por cento, respectivamente, na presença de 1ng/mL de IL-1. Posteriormente, para verificar se o acteosídeo suprime a perda de proteoglicanos induzida por IL-1 -, a cartilagem articular dissecada das articulações do joelho de ratos foi tratada com 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 7 dias. Posteriormente, as avaliações histológicas usando coloração H&E e safranina-O e coloração verde rápido foram realizadas conforme mostrado na Figura 3(b). A alteração morfológica não foi observada pela coloração H&E; no entanto, safranina-O e coloração verde rápido revelaram que o proteoglicano corado como a cor vermelha não se alterou nas cartilagens articulares tratadas com 100μM de acteosídeo em comparação com o controle. No entanto, a perda severa de proteoglicanos foi induzida por 10ng/mLIL-1 na cartilagem articular, e 100μM de acteosídeo suprimiu significativamente a perda de proteoglicanos na cartilagem articular tratada com 10ng/mL IL- 1. Coletivamente, esses dados mostram consistentemente que o acteosídeo tem um efeito anticatabólico que retarda a degeneração da cartilagem articular ao neutralizar a perda de proteoglicanos induzida por IL{50}}.

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3.3. Acteoside tem um efeito anticatabólico que suprime a expressão e ativação de MMP em condrócitos primários de ratos tratados com IL-1 .

Para investigar se o efeito anticatabólico induzido por acteosídeos está associado à supressão da expressão e ativação de MMP, condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 e 100μM de acteosídeos na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. A partir daí, as alterações nas MMPs foram investigadas. Conforme mostrado na Figura 4(a), embora a expressão de enzimas de degradação de cartilagem como MMP-13, MMP-1 e MMP-3 tenha sido significativamente aumentada no meio condicionado de rato primário condrócitos tratados com 10ng/mL de IL-1 , foi diminuído poracteósidode forma dose-dependente. Além disso, os resultados de qPCR (Figura 4(b)) e qRT-PCR (Figura 4(c)) revelaram que IL-1 aumentou significativamente os níveis de mRNA de MMPs como MMP-13, MMP{ {6}} e MMP-3 nos condrócitos primários de rato. No entanto, eles diminuíram de forma dependente da dose nos condrócitos primários de ratos tratados com 50 e 100μM de acteosídeo. Além disso, 50 e 100μM de acteosídeos suprimiram efetivamente a ativação de MMPs nos condrócitos primários de ratos tratados com 10ng/mL de IL-1 (Figura 4(d)). Tomados em conjunto, esses dados indicam consistentemente que o acteosídeo tem um efeito anticatabólico que suprime a expressão e a ativação de enzimas que degradam a cartilagem.