Estresse oxidativo, metabolismo energético disfuncional e neurotransmissores desestabilizadores alteraram o perfil metabólico cerebral em um modelo de rato simulado de saturação de heliox mergulhando para 4.0 MPa Ⅱ

Procedimento de extração de tecido

O procedimento de extração de metabólitos polares de amostras de tecido foi uma pequena modificação conforme relatado [18]. Amostras de tecido congeladas pré-pesadas foram descongeladas em gelo e, em seguida, submetidas a homogeneização mecânica em um sistema solvente de metanol-clorofórmio-água de grau HPLC gelado (400 μL, 400 μL e 285 μL, respectivamente, por 100 mg de tecido cerebral) usando um homogeneizador de tecido (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, França). Os homogenatos resultantes foram retidos no gelo por um período de 30 min e então centrifugados a 12,000 xg por um período de 10 min a 4˚C. O sobrenadante de cada amostra foi então removido e liofilizado para obter um pó contendo metabólitos polares em um liofilizador (FD-1A-80, BIOCOOL, China). Cada amostra de pó foi subsequentemente reconstituída com 550 μL de tampão PBS com 0,1 por cento de TSP, e todas as amostras foram completamente misturadas e centrifugadas a 12,000 xg por um período de 20 min a 4˚C. Uma alíquota de 500 μL de sobrenadante foi então transferida para um tubo de RMN de 5,0 mm de diâmetro (Norrel, Reino Unido). O princípio de extração de proteína na amostra de córtex foi descrito anteriormente sem modificações. A quantidade exata de amostras de córtex foi despejada em um tampão de homogeneização (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1 por cento Triton X-100, aprotinina, pepstatina A e leupeptina 10 ug/ml cada) e homogeneizados manualmente em banho de gelo. A mistura foi centrifugada a 1,000 xg por um período de 10 min a 4˚C, e o sobrenadante foi usado para as concentrações de proteínas quantificadas usando o teste de Bradford.

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Ensaio bioquímico

Um ensaio imunoenzimático competitivo (ELISA) sensível e competitivo foi aplicado com kits de ensaio para a quantificação das enzimas metabólicas Na-KATPase e AChE e dos neurotransmissores DA, E, NE, 5HT e GABA. O ELISA também determinou os níveis de SOD, MDA e GPx no tecido cortical com kits de ensaio de acordo com as instruções do fabricante.

medição NMR

A quantificação eficiente de metabólitos teciduais foi obtida usando uma plataforma analítica baseada em um espectrômetro de RMN Bruker Avance-III líquido de alta resolução equipado com uma sonda criogênica de alta sensibilidade operando a uma frequência de 600. 17 MHz para observação de 1 H a 298 K. Uma sequência de pulso unidimensional 1 H ZGPR (TOPSPIN versão 3.0, Bruker Biospin) com supressão de água (RD-90˚-ACQ) foi aplicada a adquirir dados de NMR para cada amostra. Quatro varreduras fictícias e 128 transientes foram registrados em um domínio de tempo de 32 K pontos de dados usando uma largura espectral de 20 ppm com um atraso de relaxamento de 10,0 s e um tempo de aquisição de 2,73 s. Uma função de ampliação de linha exponencial de 0,3 Hz e preenchimento de zero para pontos de dados de 64 K foram aplicados a todos os decaimentos de indução livre (FIDs) antes da transformação de Fourier. Técnicas de NMR bidimensionais adicionais com espectroscopia de correlação de gradiente de campo pulsado (gCOSY) e espectroscopia de correlação total homonuclear 2D (TOCSY) foram empregadas usando programas de pulso padrão em amostras selecionadas para confirmar as atribuições de deslocamento químico. Um trocador de amostras automatizado para entrega contínua de amostras foi usado em todas as aquisições de espectros.

Identificação e confirmação de metabólitos

Os sinais de NMR com base na localização de ressonâncias individuais nos espectros foram identificados no pacote de software Chenomx NMR Suite v. 8.4 (versão de avaliação). As confirmações de algumas atribuições de metabólitos foram realizadas considerando mudanças químicas, constantes de acoplamento e padrões de multiplicidade de metabólitos como informações sobre acoplamentos escalares extraídos de 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, bancos de dados públicos de NMR como COLMAR e Human Metabolome Banco de Dados (HMDB) e a literatura [18, 19].

Análise estatística multivariada

O protocolo de pré-processamento usado para pré-processar cada espectro 1D 1 H NMR foi o mesmo descrito em nosso trabalho anterior [20]. Os espectros de 1 H NMR foram corrigidos em fase e linha de base usando MestReNova (Mestrelab Research, SL, Espanha), e a região espectral de cada metabólito foi integrada em um balde. As ressonâncias do sinal do solvente orgânico e a região do sinal H2O/HOD residual foram removidas em todos os espectros 1D 1 H NMR. Um procedimento de balde de 0.{{3{42}}}}03 Hz e normalização para a soma da intensidade espectral multiplicada por 10000 foram aplicados em todos os espectros. Apenas os maiores valores de balde em um pico foram selecionados para a próxima etapa de análise para evitar má interpretação dos metabólitos discriminantes devido a sinais sobrepostos. Posteriormente, baldes integrais de 47 metabólitos foram extraídos e submetidos à análise de dados univariada e multivariada. Análise de indiscriminação por análise de componentes principais (PCA) e análise de discriminação por análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e projeções ortogonais para análise discriminante de estruturas latentes (OPLS-DA) foi realizada usando o pacote de software SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics , Umeå, Suécia) escalado para dados de variância unitária. Os gráficos de pontuação PCA e PLS-DA foram ilustrados com o primeiro e o segundo componentes principais (t[1], t[2]), enquanto o gráfico de pontuação OPLS-DA usou t[1] e o componente ortogonal (para[1 ]). Os parâmetros Q2 (cum), R2Y(cum) e R2X (cum) foram calculados para testar a robustez dos modelos de discriminação contra overfitting [21]. Conforme descrito anteriormente, um valor de avaliação de qualidade de Q2 � 0,4 é considerado um modelo confiável. A estratégia de validação cruzada de sete vezes e o teste de permutação 200 vezes com o primeiro componente foram aplicados para proteger contra o superajuste do modelo e validar ainda mais a confiabilidade e confiabilidade dos modelos. Se a linha de regressão Q2 tivesse uma interceptação negativa e os valores de Q2 ajustados no ponto mais à esquerda fossem maiores do que todos os valores de Q2 dos pontos à direita no teste permutado, o modelo OPLS-DA estabelecido era robusto [22]. A estratégia padrão de validação cruzada 10-fold foi aplicada para proteger contra o overfitting do modelo. Em geral, uma estatística de avaliação de qualidade (Q2) 0,4 é considerada um modelo confiável, conforme descrito anteriormente. Os coeficientes de correlação (r) e os valores de VIP extraídos dos modelos OPLS-DA foram utilizados para identificar os metabólitos que contribuíram significativamente para a separação entre os dois grupos. Além disso, as mudanças de dobra de metabólitos entre os grupos foram calculadas usando uma função. IA/IB, onde IA e IB representam os valores médios da integral do metabólito nos grupos A e B, respectivamente. O mapa de calor e os gráficos de caixa foram plotados para facilitar a compreensão das variações de metabólitos entre os grupos.

Estatísticas univariadas de integrais de metabólitos

A média do intervalo de metabólitos em cada grupo é expressa como a média ± desvio padrão (DP). A análise univariada também foi realizada usando ANOVA (análise de variância). As diferenças estatisticamente significativas entre os grupos foram avaliadas por um teste t não pareado de duas caudas após a conversão de log no software GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Diferenças estatisticamente significativas foram definidas por valores de p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Análise de correlação metabólica estatística do sistema e análise de agrupamento hierárquico

O cálculo do coeficiente de correlação de Pearson e a análise de agrupamento hierárquico foram realizados com base nas integrais relativas de metabólitos no R Studio (versão 1.4.1717) com pequenos scripts. Para cada par de grupos, a matriz de correlação foi ilustrada em um mapa de pixels conforme descrito na literatura [21]. Resumidamente, para cada variável em um grupo, correlações com valores de p menores que 0.05 foram consideradas correlações estatísticas significativas e foram mantidas para construir a rede de correlação final para ilustrar as relações latentes de metabólitos dentro do grupo e as relações metabólicas perturbadas entre os grupos. Os quadrados mais vermelhos indicam uma correlação positiva mais significativa. Os quadrados mais azuis indicam uma correlação positiva mais significativa. Os quadrados brancos indicam a correlação sem significância. A análise das vias e redes metabólicas cerebrais mais relevantes invocadas como respondentes ao HSD foi realizada usando a ferramenta MetaboAnalyst 3.0. Para a análise da topologia da via realizada, foi selecionada a biblioteca de vias de mamíferos Rattus norvegicus (rato). Essa abordagem também foi utilizada para fornecer estimativas do impacto da via, taxa de descoberta falsa (FDR) e valores de p.

Resultados Índices bioquímicos corticais dos grupos HSD e CON

Para validar os efeitos de alteração metabólica do HSD nos tecidos cerebrais, parâmetros bioquímicos, incluindo as atividades enzimáticas metabólicas relacionadas ao metabolismo energético de Na-KATP, AChE e LDH, os neurotransmissores de DA, E, NE, 5HT e GABA, e oproteínas relacionadas ao estresse oxidativodeSOD, MDA, e Gpx nos tecidos do córtex ipsilateral de ratos HSD e CON também foram determinados (Tabela 1). Em comparação com o grupo controle, os níveis de DA, E, NE e MDA aumentaram significativamente, enquanto os conteúdos de Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD e Gpx diminuíram no modelo HSD. O limite de detecção dos kits de ensaio utilizados no presente trabalho foi listado na Tabela S3 no arquivo de materiais suplementares.

Tabela 1. A quantificação dos parâmetros bioquímicos foi medida em tecido de córtex de animais CON e HSD por ELISA com os kits de ensaio. (média ± DP). indica significância estatística.

Metabólitos identificados em espectros de 1 H NMR de amostras de tecido cerebral

A Fig. 3 exibe três espectros de 1 H NMR representativos do córtex (Fig 3A), hipocampo (Fig 3B) e corpo estriado (Fig 3C) de um rato HSD. Uma ampla gama de metabólitos proeminentes foi identificada de acordo com os dados de 1 H NMR de amostras de tecido cerebral, e são ânions de ácidos orgânicos (lactato (Lac), malonato (Maln), succinato (Suc), malato (Mal), fumarato (FMA ), 2-hidroxibutirato (2-HB), acetato (Ace), formato (For), taurina (Tau), ascorbato(Asc), 2-hidroxibutirato (2HIB)), aminoácidos (leucina (Leu), isoleucina (Ile), valina (Val), alanina (Ala), glicina (Gly), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe), aspartato (Asp), glutamina (Gln), glutamato (Glu) , treonina (Thr), serina (Ser), lisina (Lys), asparagina (Asn)), neurotransmissores (-aminobutirato (GABA)), metabólitos relacionados à energia (creatina (Cre), trifosfato de adenosina (ATP), monofosfato de adenosina ( AMP)), metabólitos relacionados a fosfolipídios (Ofosfoetanolamina (PEA), O-fosfocolina (Pcho), sn-glicero-3-fosfocolina (GPC)) e outros (mio-inositol (MI), nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD mais ), ácido nicotínico (Nic), N-acetilaspartato (NAA), fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADP plus), UDP-N-galactose (UDPGa), uridina (Uri), uracilo (Ura), cistidina (Cyt) , uridina 5'-monofosfato (UMP), inosina 5'-monofosfato (IMP), inosina (Ino), colina (Cho), carnitina (Car), glutationa (GSH). A Tabela S1 mostra informações detalhadas sobre as atribuições do metabólito.

Alterações do perfil metabólico reveladas pela análise metabolômica

O PCA, uma abordagem de análise exploratória e imparcial dos espectros de 1 H NMR de todos os extratos cerebrais em diferentes regiões do cérebro, foi feito pela primeira vez para revelar as principais tendências metabólicas impulsionadas pela exposição hiperbárica a 400 msw ambiente de saturação heliox. Um gráfico de dispersão PC1 vs. PC2 obtido de PCA (S1A–S1C Fig) de dados de baldes integrais revelou uma certa discriminação com alguma sobreposição entre as duas classificações. As investigações supervisionadas dos modelos PLS-DA (S1A'–S1C' Fig) e OPLS-DA (Fig 4A–4C) exibiram claras discriminações de classe dos perfis metabólicos entre os grupos. A Fig. 4 mostra os gráficos de pontuação do modelo OPLS-DA para a região do córtex (A), a região do hipocampo (B) e a região do corpo estriado (C), mostrando clara discriminação entre os grupos HSD e os controles. A alta variação explicada e a qualidade da previsão refletida pelos valores de R2X e Q2 (S1A'–S1C' Fig, Fig 4A–4C) e gráficos de teste de permutação (Fig 4'-4C'A) indicaram a robustez dos modelos supervisionados gerados. O coeficiente de correlação (r) extraído dos gráficos da linha S, importância variável na projeção (VIP) e o valor p dos testes univariados não paramétricos foram coletados para avaliar os metabólitos significativos responsáveis ​​pelos padrões de discriminação de classe. Portanto, atendendo a qualquer um dos três critérios (o valor absoluto de r maior que 0,50, o valor de VIP maior que 1,0, junto com valor de p menor que 0,05), selecionamos um painel de metabólitos estatisticamente significativos (Tabela 1) responsável pela separação entre os grupos CON e HSD. Na Tabela 1, valores de mudança de dobra maiores que 1 indicam um nível aumentado no grupo HSD, enquanto valores de mudança de dobra menores que 1 indicam um nível diminuído no grupo HSD. Os valores médios de SD dos metabólitos discriminativos estão listados na Tabela S2. Usando a análise de agrupamento hierárquico de metabólitos e o método de ligação média, o mapa de calor gerado (Fig 5A-5C) com dendrogramas permite uma melhor visualização de três alterações metabólicas da região do cérebro causadas pela exposição hiperbárica em um ambiente saturado de oxigênio de hélio.

Distúrbios metabólicos observados em diferentes regiões cerebrais de ratos HSD

A análise multivariada acima mencionada e a análise univariada usando a altura do balde de metabólitos nos diferentes grupos forneceram um ótimo tubo de trabalho para identificar metabólitos discriminativos revelando as possíveis alterações metabólicas neurológicas associadas a eventos de HSD. Elevação de AMP, FMA, Nic e Phe e diminuição de Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura e Uri foram encontrados no tecido do córtex do HSD grupo comparado com o grupo CON (Fig. 5A, Tabela 1). Enquanto isso, no hipocampo, Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr e Ura também diminuíram e o AMP aumentou no grupo HSD, assim como no córtex. Além disso, Thr regulado positivamente e Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc e DMA regulados negativamente foram expressos em extratos de hipocampo do grupo HSD em relação aos controles (Fig. 5B, 5D, Tabela 1). Em comparação com o grupo CONS, os conteúdos de Cyt, GABA, Ura, Cho e Thr também diminuíram, assim como no córtex e no hipocampo. Além disso, níveis aumentados de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAAs, incluindo Leu, Ile, Val) e Lys e níveis reduzidos de Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, uma série de metabólitos de ATP, Tau, IMP, e Suc, que também diminuiu no hipocampo, e outros dois metabólitos, Ino e Pcho, que também diminuíram no córtex, foram observados nos tecidos estriados de ratos do grupo HSD (Fig. 5C, 5D, Tabela 1). Tantos metabólitos sempre indicam vias moleculares implicadas com complexidade e diversidade. Os valores integrais dos metabólitos discriminantes foram quantificados e as alterações estatisticamente significativas de suas concentrações entre os grupos expostos a heliox-saturação-hiperbárica e de controle estão resumidas na Tabela S2 e na Tabela 2 para as três regiões do cérebro.

Fig. 4. Análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA) pontuações e gráficos de teste de permutação que discriminam o efeito de 400 msw exposição de saturação heliox em espectros de 1H NMR de grupos de controle no córtex (CONC, n=8, HSDC, n=8, A e A') (R2X=0.38; Q2=0.46), hipocampo (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B e B') (R2X=0.37; Q2=0.43) e estriado (CONS, n=8, HSDS, n=8, C e C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Os valores do parâmetro Q2 nos gráficos de pontuação OPLS-DA, que eram iguais ou maiores que 0,40, juntamente com os valores Q2 do ponto mais à esquerda nos modelos permutados, eram maiores do que todos os valores Q2 ajustados dos pontos direitos (permutação teste 80 vezes), indicando que os modelos OPLS-DA estabelecidos eram válidos.

A Pcho, que também diminuiu no córtex, foi observada nos tecidos estriados dos ratos do grupo HSD (Fig 5C, 5D, Tabela 1). Tantos metabólitos sempre indicam vias moleculares implicadas com complexidade e diversidade. Os valores integrais dos metabólitos discriminantes foram quantificados e as alterações estatisticamente significativas de suas concentrações entre os grupos expostos a heliox-saturação-hiperbárica e de controle estão resumidas na Tabela S2 e na Tabela 2 para as três regiões do cérebro.

Fig 5. Mapa de calor e gráficos de correlação estatística derivados dos valores de balde dos metabólitos discriminatórios do córtex (A, A', amostras de HSDC estão no painel superior e CONC estão no painel inferior), hipocampo (B, B', HSDH grupo encontra-se no painel superior e CONH encontra-se no painel inferior) e tecidos estriados (C, C', amostras HSDS situam-se no painel superior e CONS situa-se no painel inferior) de ratos HSD e CON. Os metabólitos no mapa de calor são organizados por agrupamento hierárquico com base na semelhança geral nos padrões de nível. Diagrama de Venn (D) ilustrando a sobreposição de metabólitos entre as comparações HSDC-CONC, HSDH-CONH e HSDS-CONS.

Análise de correlação de metabólitos

A relação entre ou entre os metabólitos era tão complexa na Fig. 5A'-5C'. Para os metabólitos de energia, as correlações positivas para Lac vs Ala em HSDC, AMP vs IMP em HSDH, ATP vs Pcho em HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA em HSDS, e as correlações negativas para Lac vs Thr e GSH vs Suc em HSDH, Suc vs Val em HSDS estavam presentes nos gráficos de correlação de metabólitos. Para os neurotransmissores, as correlações positivas para GABA vs Car em HSDC, GABA vs Cho em CONH e GABA vs Suc/Ino/Gln em HSDS estavam presentes nos gráficos de correlação de metabólitos. As correlações negativas para GABA vs FMA no CONC e GABA vs NAA/Ura/NADP plus no CONS estavam presentes nos gráficos de correlação de metabólitos. Para os metabolitos relacionados comestresse oxidativo, ocorrelações positivaspara GSH vs Asn no HSDC e o CONC, Tau vs Lac no HSDH, Tau vs Suc/Ala no CONH, as correlações negativas para GSH vs Suc no HSDH, Tau vs Thr no HSDH estavam presentes na correlação de metabólitos parcelas.

Análise da via metabólica

A análise quantitativa da via consistindo na análise do enriquecimento da via e no impacto da via da topologia da via revelou modulações induzidas por HSD altamente estatisticamente significativas para uma série de vias metabólicas. As pontuações do impacto do caminho, juntamente com a taxa de descoberta falsa (FDR) e os valores p, são descritos na Figura 6. Os caminhos foram considerados significativamente enriquecidos se os valores p fossem menores que 0.05; os metabólitos perfilados (hits) em relação aos metabólitos totais da via (match status) foram superiores a 1; e as pontuações de impacto (indicando o impacto de metabólitos significativamente afetados na via com base na medida de topologia de rede de centralidade de intermediação relativa) foram superiores a 0. As vias no córtex (Fig 6A) com o maior valor de impacto metabólico foramfenilalanina, tirosina, ebiossíntese de triptofano>metabolismo da fenilalanina> metabolismo da pirimidina > metabolismo da alanina, aspartato e glutamato. As vias no hipocampo (Fig. 6B) com maior impacto metabólico foram biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano > metabolismo de glutationa > metabolismo de glicina, serina e treonina > metabolismo de purina > metabolismo de pirimidina > metabolismo de alanina, aspartato e glutamato > metabolismo de butanoato . As vias no corpo estriado (Fig. 6C) com maior impacto metabólico foram metabolismo de alanina, aspartato e glutamato > metabolismo de nicotinato e nicotinamida > metabolismo de purina.

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