Galactan protege as células de levedura da morte celular apoptótica.

Para verificar se galactana temantiapoptóticopropriedades,tratamos mutantes deficientes em genes anti-apoptóticos de levedura (fs1∆ e pep4∆) com galactana e os expusemos a um indutor de apoptose, H2O2. Enquanto a levedura Fis1 é uma proteína de fusão mitocondrial eprevine a apoptose, a levedura Pep4 é uma aspartil protease vacuolar eprotege as células da apoptose induzida pelo ácido acético80,81. As contagens de CFU mostraram um aumento de cerca de 25 a 30% na sobrevivência de células pep4∆ e fs1∆ quando tratadas com galactana em comparação com as células sob estresse apoptótico induzido por 1 mM H2O2 (Fig. 5A). Os resultados do ensaio spot também mostraram uma concordância com as contagens de CFU que mostraram melhor sobrevivência de mutantes anti-apoptóticos de levedura tratados com galactana sob estresse apoptótico (Fig. 5B). Nossos resultados mostram que a galactana protege as células de levedura da morte celular apoptótica induzida por H2O2.

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Galactan reduz a condensação da cromatina. Neste estudo, realizamos coloração AO/EB das células de levedura pré-tratadas com galactana. As células pep4∆ e fs1∆ com H2O2 sozinho apareceram principalmente em amarelo-laranja em comparação com WT, e uma redução notável no número de células de cor amarelo-laranja foi observada nas células pré-tratadas com galactana e, em seguida, expostas a H2O2. Isso mostra que o número de células apoptóticas reduziu significativamente na redução de pep4∆ e na condensação da cromatina. A coloração AO/EB é um método usado para detectar apoptose em células de leveduras e mamíferos. O laranja de acridina é um corante permeável às células que cora prontamente os ácidos nucleicos em células viáveis ​​e não viáveis, enquanto o brometo de etídio é um corante intercalante de DNA que entra apenas quando as células estão desintegradas, apoptóticas ou mortas. Esta seletividade da coloração AO/EB permite a detecção de células em três fases diferentes, ou seja, células viáveis ​​com coloração verde uniforme tanto no núcleo quanto no citoplasma, células apoptóticas precoces com núcleo verde brilhante devido à condensação da cromatina que se destaca no citoplasma e células tardias células apoptóticas que apresentam coloração amarelo a laranja/vermelho vivo devido à entrada de brometo de etídio nas células50,51.

Galactan reduz a fragmentação nuclear.

WT de levedura e mutantes deficientes em anti-apoptóticos (pep4∆ e fs1∆) pré-tratados com ou sem galactana foram expostos a H2O2 e submetidos à coloração DAPI. Células mutantes deficientes em antiapoptóticos de levedura pré-tratadas com galactana mostraram menor fragmentação nuclear e baixa intensidade de DAPI, enquanto aquelas sem pré-tratamento com galactana mostraram uma fluorescência significativamente maior e fragmentação nuclear aumentada (Fig. 5D)52. Isso indica que a galactana pode efetivamente aliviar a fragmentação nuclear induzida pelo estresse oxidativo, levando à desintegração celular. Anteriormente, foi demonstrado em camundongos transgênicos que o Bifidobacterium breve reduz as características apoptóticas, como o derramamento de células nas células epiteliais intestinais, que é mediado pelo EPS presente na superfície do termo Bifdobac. O relatório mostra uma redução significativa dependente da dose na descamação celular e nos níveis de expressão de marcadores apoptóticos. Bifidobacterium EPS protegeu as células da morte celular apoptótica modulando as vias de sinalização apoptótica intrínseca e extrínseca 82. Nossos resultados, de acordo com os resultados anteriores, indicam que o galactan EPS protege os mutantes deficientes em genes anti-apoptóticos de levedura pep4∆ e fs1∆ do estresse apoptótico induzido por H2O2.

Galactan estende CLS de S. cerevisiae.

Para avaliar a atividade antienvelhecimento da galactana, realizamos um ensaio CLS com WT e mutantes de levedura (sod2∆, tsa1∆ e ctt1∆) com tratamento com galactana. SOD2 é um SOD de manganês, localizado na matriz mitocondrial. A deleção de SOD2 torna as células altamente sensíveis ao estresse oxidativo e a uma alta taxa de mutação porque o mtDNA é mais acessível às ERO geradas na mitocôndria83 e é um dos genes associados ao tempo de vida cronológico da levedura. TSA1 é uma tiorredoxina peroxidase (antioxidante específico do tiol) que está associada ao citoplasma e ao ribossomo. O TSA1 está envolvido em conferir a resistência da célula contra o estresse oxidativo induzido pelo peróxido de hidrogênio e a falta de TSA1 é conhecida por afetar a vida útil das células de levedura. Outro mutante antioxidante ctt1∆ usado no experimento CLS carece de CTT1, a catalase citosólica envolvida na desintoxicação do peróxido de hidrogênio.

A Figura 6 mostra o efeito da galactana no CLS das cepas mutantes de levedura sem genes antioxidantes. Enquanto as células WT tratadas com galactana EPS mostraram ~ 10 por cento de aumento na viabilidade, sod2∆, tsa1∆ e ctt1∆ mostraram aumento de 15 a 20 por cento na viabilidade (Fig. 6). As ROS mitocondriais levam à senescência e danos ao DNA nuclear, e a SOD2 está envolvida na eliminação do acúmulo de ROS nas mitocôndrias. TSA1 e CTT1 estão envolvidos na desintoxicação do peróxido acumulado no citoplasma, que é significativamente maior em células envelhecidas. Nossos resultados do ensaio CLS indicam que o EPS elimina o acúmulo de ROS mitocondrial e citoplasmático, evita a senescência ou características semelhantes à morte celular e estende o CLS nas células de levedura sem SOD2, TSA1 e CTT154.

O estresse oxidativo celular está intimamente associado ao processo de envelhecimento e influencia muito o aparecimento de várias doenças humanas associadas à idade, comodiabetes, doença cardiovasculars,distúrbios neurodegenerativose cânceres. O estresse oxidativo e a inflamação são dois eventos interligados que desempenham um papel importante na patologia de muitas doenças crônicas. Relatórios recentes sugerem uma estreita ligação entre o efeito da microbiota intestinal nesses distúrbios relacionados à idade. O microbioma intestinal protege o revestimento epitelial intestinal dos danos celulares induzidos pelas vias inflamatórias induzidas pelo estresse oxidativo. A microbiota intestinal complexa interage com as ROS e o sistema de defesa antioxidante, ajudando na eliminação dos radicais livres e na prevenção da inflamação. e também pode regular o estado oxidativo do sistema nervoso central através da produção de neurotransmissores como GABA, dopamina e serotonina. O microbioma também possui atividade imunomoduladora, evita a colonização extensa de micróbios patogênicos e fornece imunidade contra muitas infecções microbianas83. Muitos polissacarídeos microbianos foram testados em diferentes modelos e relataram ter alto potencial antioxidante, atividade anti-inflamatória e funções protetoras celulares evidenciadas pela modulação dos respectivos níveis de biomarcadores mediados por esses exopolissacarídeos82,84. Verificou-se que essas moléculas têm efeito neuroprotetor ao prevenir placas amilóides e morte neuronal em modelos experimentais da doença de Alzheimer. Além disso, alguns deles demonstraram aumentar a atividade de SOD, reduzir os níveis de marcadores neurotóxicos e inibir a morte de neurônios dopaminérgicos em modelos experimentais da doença de Parkinson.

Oprocesso de envelhecimentoé marcada por elevada oxidação celular levando a um aumento do acúmulo de danos no DNA, taxa elevada de mutação e diminuição da viabilidade celular. Foi demonstrado anteriormente que as ROS induzem a morte celular apoptótica em células de levedura que envelhecem cronologicamente e a suplementação de células com os compostos naturais pode aumentar a longevidade das células envelhecidas47,85. Nossos resultados sobre o efeito antienvelhecimento exercido pela galactana EPS de W. confusa, nas leveduras sod2∆, tsa1∆ e ctt1∆ mostram que a galactana EPS protege as células de levedura das ROS e apoptose induzidas pelo envelhecimento e aumenta sua viabilidade. Os homólogos humanos desses genes estão envolvidos no fornecimento de proteção contra distúrbios neurodegenerativos e cânceres relacionados à idade. Nossos resultados sugerem que a suplementação de galactana EPS pode resgatar as células que não possuem esses genes de defesa antioxidante da morte celular relacionada à idade e reduzir o risco de desenvolver doenças relacionadas à idade.

Conclusão

Estresse oxidativoé uma causa de muitos processos desfavoráveis ​​dentro das células que levam a várias doenças e distúrbios. Galactan de W. confusa KR780676 Weissella confusa KR780676 exibiu pronunciadopropriedades antioxidantesem estudos in vitro e in vivo. Este estudo mostrou claramente que a galactana protegeu os mutantes antioxidantes de levedura contra o estresse oxidativo extracelular. Galactan também protegeu as células mutantes deficientes anti-apoptóticas do estresse apoptótico mediado por oxidação, conforme evidenciado pela diminuição da fragmentação nuclear. Galactan diminuiu os níveis de ROS, estendendo sua expectativa de vida e protegendo as células do estresse oxidativo. No geral, os resultados provam que a galactana tem a capacidade de aliviar o estresse oxidativo no meio, eliminando os radicais livres. Seria interessante testar o potencial antioxidante e antienvelhecimento da galactana em modelos de células eucarióticas superiores, como linhagens de células de mamíferos, bem como modelos animais. Galactan é creditado com forte atividade prebiótica e a atividade antioxidante pode desempenhar um papel significativo na redução do estresse oxidativo no intestino, além de manter a homeostase intestinal. Com várias propriedades tecnológicas creditadas ao galactano, como fortes propriedades emulsificantes, encontraria imensa aplicação na indústria alimentícia e farmacêutica como um ingrediente funcional natural.

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