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Oligomerização oxidativa de DBL Catechol, um potencial composto citotóxico para melanócitos, revela a ocorrência de novas adições iônicas do tipo Diels-Alder Parte 2

May 18, 2023

Havia também compostos formados a partir do dímero com a perda de dois prótons. Esses compostos eluíram em 17 min, 18 min, 20 min e 21 min com uma massa molecular de 353,1021, que está dentro de 1,5 ppm da massa teórica para C20H16O6 (353,1013 amu). O espectro CID desses compostos foi significativamente diferente, indicando que vários isômeros estão sendo formados na mistura de reação (Figuras 8–11).

De acordo com estudos relevantes, a cistanche é uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu principal componente é o cistanósido, que possui diversos efeitos como antioxidante, anti-inflamatório e promotor da função imunológica. O mecanismo entre cistanche e clareamento da pele reside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche. A melanina na pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada pela tirosinase, e a reação de oxidação requer a participação do oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, inibindo assim a produção de melanina.

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O pico eluindo em 20 min mostrou apenas uma perda de água como a maior produção (íon m/z 335 na Figura 10). O pico eluindo em 21 min apresentou o pico maior com a perda do grupo COCH2 (íons m/z 311). Este composto tem que ser a forma oxidada do dímero DBL quinona. Por outro lado, o pico de eluição em 18 min mostrou maiores íons de decomposição em 335 (perda de água), 311 (perda de COCH2) e um íon menor em m/z 293 (perda de água e COCH2). Observe que o último íon de decomposição não é possível para o dímero de quinona DBL e é possível apenas para a forma oxidada do dímero de benzodioxano. A partir desses resultados, inferiu-se que dois tipos diferentes de dímeros são formados na reação - um dímero de benzodioxano e um dímero de quinona DBL.

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Esses dímeros oxidados exibirão absorbância visível, assim como qualquer outra quinona não conjugada simples. Isso é consistente com a absorbância máxima de 420 nm, devido ao composto quinonoide se acumular na mistura de reação DBL catecol-tirosinase. O dímero de quinona DBL pode aromatizar e oxidar ainda mais para o meteto de quinona. Considerando que o dímero de benzodioxano sofrerá oxidação em quinona, que então se isomerizará em composto dessaturado de cadeia lateral. Assim, os dímeros iniciais com m/z 355 são convertidos na forma oxidada dos dímeros com m/z 353.

Além dos produtos diméricos, compostos triméricos também podem ser observados no espectro de massa da mistura de reação. Novamente, dois íons parentais em m/z 529,1486 estão presentes, um eluindo em 20 min e o outro em 22 min (Figura 5, painel C). Sua massa está dentro de 3 ppm da massa do composto trimérico protonado teórico (C30H26O9). Seus espectros CID são mostrados nas Figuras 12 e 13. O CID de um isômero deu um íon principal em 351, correspondendo à forma totalmente oxidada do dímero. O outro isómero deu uma quantidade consideravelmente menor desta produção. Não foi possível distinguir a estrutura dos trímeros com base no padrão de fragmentação. No entanto, ficou claro que diferentes produtos triméricos também são formados na mistura de reação. Assim, os resultados apresentados neste artigo confirmam que o catecol DBL é extremamente suscetível à polimerização oxidativa, conforme proposto em um trabalho anterior de um de nossos grupos [11].

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A formação de dímeros e trímeros pode ser explicada pelas reatividades dos produtos quinonoides formados na reação (Figura 14). A oxidação do catecol DBL produz sua quinona correspondente, que é altamente hidrofóbica e pode facilmente exibir uma reação de cicloadição com o catecol original. A adição iônica de Diels-Alder da quinona DBL ao catecol original produzirá dois tipos de adutos, conforme mostrado na Figura 14. A reação dos grupos carbonil quinonoides com a cadeia lateral dessaturada produzirá o dímero benzodioxano. Em contraste, a adição da cadeia lateral da dienona com a cadeia lateral dessaturada produz o aduto do tipo pirano simplesmente designado como DBL quinona dímero. Ambos os compostos podem sofrer oxidação fácil e posterior reação para formar compostos triméricos por reações semelhantes de Diels-Alder. Embora a ocorrência biológica da reação de Diels-Alder seja muito rara, foi relatado que ocorre em algumas circunstâncias [20-23]. Por exemplo, um de nossos grupos mostrou recentemente que a quinona do N-acetil dopa metil éster sofre rápida cicloadição, provavelmente via reação iônica de Diels-Alder, gerando um dímero de benzodioxano semelhante [20]. Os estudos atuais também apóiam a prevalência de tais adições iônicas de Diels-Alder na química quinonoide de catecols dessaturados de cadeia lateral. Essas reações de ciclização são todas não enzimáticas e, portanto, não serão estereosseletivas, levando à produção de múltiplos produtos isoméricos. A produção de tais produtos múltiplos durante a ciclização não enzimática de espécies quinonoides geradas enzimaticamente foi bem documentada neste laboratório para vários derivados de desidrodopa e desidrodopamina [16-20].

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A potente melanotoxicidade de RK e seu produto reduzido, rododendro, está agora bem estabelecida [1-8,24]. Embora algumas das reações, como a depleção de tióis e a adição de nucleófilos celulares, também sejam comuns a outras quinonas citotóxicas, a genotoxicidade única de RK e rododendros pode ser atribuída à sua capacidade de exibir múltiplas reações redox que produzem não apenas seus derivados quinonoides correspondentes mas também várias espécies quinonoides dessaturadas de cadeia lateral. Além disso, uma infinidade de compostos diméricos e triméricos são produzidos, todos com a capacidade de causar produção de espécies reativas de oxigênio, depleção de tióis celulares e reação com macromoléculas celulares, incluindo proteínas e DNA [11,24]. Os compostos que exibem tais reações redox múltiplas serão, portanto, mais tóxicos do que os compostos quinonoides simples. É bastante difícil identificar um ou qualquer outro produto de RK ou rododendro como agente causador da indução de leucoderma e outros efeitos mielotóxicos. Com esses resultados em mente, alertamos contra o uso desses compostos e outros catecóis relacionados que têm a capacidade de exibir múltiplas reações redox para o tratamento de quaisquer distúrbios relacionados à melanina.

3. Materiais e Métodos

Materiais: O catecol DBL foi adquirido da Fujifilm-Wako Pure Chemicals (Osaka, Japão). A tirosinase de cogumelo (actividade específica 5771 unidades/mg de proteína) foi adquirida à Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Metanol grau HPLC e formato de amônio (99 por cento) foram obtidos de Acros, Morris Plains NJ. Síntese Milli Q A10 O sistema de purificação de água adquirido de Millipore, Milford, MA foi usado para preparar água grau HPLC. Solventes de fase móvel (ácido fórmico, acetonitrila) para espectrometria de massa foram adquiridos da Fisher Chemical (Fair Lawn, NJ, EUA) e eram Optima LC/MS Grade. Todos os outros produtos químicos eram de grau analítico e adquiridos da Fisher e/ou VWR.

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Ensaios enzimáticos: Uma mistura de reação (1 mL) contendo DBL catecol (geralmente 0,2 mM), cerca de 5–10 µg de tirosinase de cogumelo em tampão fosfato de sódio 50 mM em pH especificado foi incubada à temperatura ambiente e o espectro as alterações associadas à oxidação foram acompanhadas usando um espectrofotômetro de arranjo de diodos. Algumas reações foram conduzidas em condições ácidas. A oxidação química do catecol DBL com periodato de sódio foi realizada em uma proporção de mol para mol em valores de pH especificados. As condições exatas são dadas na legenda de cada figura.
Preparação de amostra para estudos de espectro de massa: Uma mistura de reação contendo 100 nmol de DBL catecol e 5 µg de tirosinase foi incubada em 1 mL de água à temperatura ambiente por dois minutos e uma alíquota da reação (100 mL) foi extinto com (900 mL) 1 por cento de ácido trifluoroacético. Esta mistura diluída foi submetida a análise espectrométrica de massa. A reação diluída foi injetada diretamente no espectrômetro de massa. Condições RP-nLC/ESI-MS: Um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Fisher, San Jose, CA, EUA) acoplado online a um EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher, San Jose, CA, EUA) foi usado para detectar e caracterizar os produtos. O sistema nLC foi operado a uma taxa de 300 nL/min usando um gradiente linear de 0-70 por cento B em 15 min. A fase móvel A foi de 96,1:3.9 00,1 por cento de ácido fórmico em água/0,1 por cento de ácido fórmico em acetonitrila. A fase móvel B foi de 80,0:20.0 00,1 por cento de ácido fórmico em água/0,1 por cento de ácido fórmico em acetonitrila. A amostra foi primeiro dessalinizada em uma coluna HPLC Thermo Fisher Scientific Acclaim PepMap 100 C18 (tamanho de partícula de 3 µm, 75 µm × 2 cm, 100 Å) antes da separação em uma coluna Thermo Fisher Scientific PepMap RSLC C18 EASY-Spray (tamanho de partícula de 3 µm , 75 µm × 15 cm, 100 Å).
O espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos foi operado no modo de moléculas pequenas. As configurações globais foram as seguintes: tipo de fonte de íons NSI, uma tensão positiva de 1900 V e uma temperatura do tubo de transferência de íons de 275 ◦C. Os íons para as varreduras de MS foram detectados no Orbitrap com uma resolução de 30,000. O intervalo de massa era normal e o intervalo de varredura foi definido como 100–1000 m/z. A lente RF foi ajustada para 30% e o alvo AGC e o tempo máximo de injeção foram 4,0 × 105 e 50 ms, respectivamente. As varreduras MS2 CID dependentes de dados foram executadas em conjunto com um filtro de massa direcionado no qual as massas direcionadas correspondiam às seguintes espécies protonadas: DBL (179,0708 m/z), DBL-quinona (177,0551 m/z), DBL-quinona dímero (355,1182 m/z), trímero DBL-quinona (529,1499 m/z), aduto DBL-água (197,0813 m/z) e dímero DBL com perda de 2H (353,1026 m/z). Um limite de intensidade de 2,0 × 103 foi definido em cada massa com uma tolerância de massa de ± 10 ppm. Os íons para o ddMS2 CID foram isolados na armadilha de íons com uma taxa de varredura rápida e com uma janela de isolamento de 2 m/z. Os íons foram fragmentados via CID com uma energia de colisão fixa de 40%. O parâmetro Q para a ativação do CID foi definido em 0,25. O alvo AGC e o tempo máximo de injeção foram definidos para 1,0 × 104 e 500 ms. O tempo de ciclo para a aquisição dependente de dados foi ajustado para 3 s.
Contribuições do autor:Conceituação, MS, SI e KW; metodologia, MS, JE, RM e KU; análise formal, MS e JE; investigação, MS, JE, RM e KU; recursos, MS, SI e KW; curadoria de dados, MS, JE, RM e KU; redação—preparação do rascunho original, MS; redação — revisão e edição, MS, SI, KW e JE; visualização, EM; supervisão, MS e JE; administração do projeto, MS Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento: Esta pesquisa não recebeu financiamento externo.
Conflitos de interesse:Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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Abreviaturas

CID Decomposição induzida por colisão
DBL 3,4-dihidroxibenzalacetona
LC/MS Cromatografia líquida de alta pressão/espectrometria de massa
RK Framboesa cetona

Referências

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