Propriedades neuroprotetoras da 4-aminopiridina

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Michael Dietrich, PhD, Hans-Peter Hartung, MD, PhD, FRCP, e Philipp Albrecht, MD

Abstrato

Como antagonista dos canais de potássio dependentes de voltagem (Kv), a 4-aminopiridina (4-AP) é usada como terapia sintomática em vários distúrbios neurológicos. A melhora da função visual e das habilidades motoras e o alívio da fadiga em pacientes com EM foram atribuídos à 4-PA. Sua formulação de liberação prolongada (fampridina) foi aprovada para o tratamento sintomático da deficiência de locomoção na EM. Os efeitos benéficos foram explicados pelo bloqueio dos canais Kv axonais, aumentando assim a condução ao longo dos axônios desmielinizados. No entanto, um corpo crescente de evidências sugere que 4-AP pode ter propriedades adicionais além do modo de ação sintomático. Nesta revisão, resumimos dados pré-clínicos e clínicos sobre possíveis características neuroprotetoras de 4-AP.

4-Aminopiridina em doenças neurológicas

As aminopiridinas são um grupo de derivados monoamina e diamino da piridina, que inibem os canais de potássio (Kv) dependentes de voltagem. Especialmente, os 2 bloqueadores de canais de potássio de amplo espectro 4-aminopiridina (4-AP) e 3,4-aminopiridina (3,4- DAP) têm sido usados ​​como novas substâncias em investigação em várias doenças neurológicas. Embora 3,4-DAP seja um antagonista mais potente dos canais de potássio, 4-AP atravessa a barreira hematoencefálica mais facilmente1 e foi clinicamente superior em pacientes com EM, principalmente para melhorar a função visual,2 fadiga ,3 cognição,4 e velocidade de caminhada.1 Além disso, 4-AP foi relatado para facilitar a condução neural em outras doenças neurológicas além da EM.5,6

Efeitos da cistanche: Protege os neurônios

Em axônios saudáveis, os canais Kv1.1 e Kv1.2 estão agrupados próximos aos nodos de Ranvier.7 Esses canais ficam expostos após a desmielinização e migram através do segmento desmielinizado. Ao mesmo tempo, a expressão desses canais é aumentada várias vezes.8 Essa redistribuição mal direcionada dos canais Kv prejudica a transmissão dos potenciais de ação, levando à incapacidade permanente. 4-AP bloqueia esses canais de potássio expostos e, portanto, aumenta a transdução de sinal.9,10O canal Kv1.3 foi descoberto em células T humanas,11 foi altamente expresso em infiltrados inflamatórios no cérebro de EM,12 e é expressa em macrófagos, micróglia e células T de memória efetora.13 Bloqueadores de canais Kv1.3 seletivos e não seletivos podem, assim, fornecer propriedades imunomoduladoras ao inibir a proliferação celular e a secreção de citocinas pró-inflamatórias.14 Estudos anteriores a 2009 não conseguiram estabelecer 4-AP como um tratamento sintomático para EM porque os níveis sanguíneos de drogas em pacientes eram imprevisíveis, com doses excessivas sendo associadas ao risco de convulsões epilépticas e comprometimento da consciência.15–18 Portanto, fampridina, a formulação de liberação prolongada de 4-AP foi desenvolvida e foi posteriormente aprovado para o tratamento sintomático da deficiência de locomoção na EM.19–23 Curiosamente, mais recentemente, um crescente corpo de evidências sugere que, além desses apenas efeitos sintomáticos reconhecidos, 4-AP pode ter propriedades protetoras adicionais.

Avaliação de 4-AP usando modelos in vitro

In vitro, os efeitos neuroprotetores de 4-AP foram observados em vários modelos. Quando neurônios motores (MNs) diferenciados de células-tronco pluripotentes induzidas de pacientes com esclerose lateral amiotrófica carregando mutações do gene FUS e SOD1 foram expostos a 4-AP, desequilíbrios de canais iônicos foram corrigidos, níveis de atividade neuronal aumentados, retículo endoplasmático o estresse diminuiu e a ativação das caspases foi atenuada. Os MNs mutantes apresentaram menores correntes de sódio e razões Na+/K+, o que pode, pelo menos em parte, ser a razão de sua hiperexcitabilidade. Isso foi revertido após 4-tratamento com AP, que levou à diminuição das correntes de potássio e restaurou os padrões de atividade espontânea e entrada sináptica nos MNs.24 4-O tratamento com AP reduziu a liberação de mediadores pró-inflamatórios da micróglia humana desafiada com amiloide- neurónios do hipocampo de ratos cultivados e beta e protegidos banhados em sobrenadantes de micróglia tratada com beta-amiloide.25 Um derivado de 4-AP supostamente reduziu o acúmulo de -sinucleína, oxidação, inflamação e ativação de Rho quinase em um modelo in vitro da doença de Parkinson.26 Outros estudos in vitro relataram que o 4-AP aumentou a fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta de cAMP protegida do estresse celular por glutamato, NMDA e ácido 3-nitropropiônico exercido em neurônios granulares cerebelares neonatais de ratos. O glutamato leva a uma menor viabilidade também em células pré-condicionadas com 4-AP, mas sem ativação significativa de caspase-3. Essas observações sugeriram que 4-AP é principalmente eficaz contra excitotoxicidade necrótica.27 Também foi demonstrado que protege culturas neuronais primárias da privação de oxigênio-glicose ou toxicidade de ouabaína/DL-três- -ácido benziloxiaspártico.28

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Estudos pré-clínicos in vivo em 4-AP

Vários estudos investigaram os efeitos protetores de 4-AP em vários modelos de doenças (tabela 1). Em modelos de esmagamento do nervo de dano do nervo periférico, o tratamento profilático e precoce 4-AP levou à recuperação da velocidade de condução nervosa, promoveu a remielinização e aumentou a área axonal. As últimas observações foram explicadas por efeitos semelhantes aos que aparecem após a estimulação elétrica, por exemplo, elevações nos níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro neuronal (BDNF).29 Em um modelo de doença de Alzheimer, a injeção de beta-amiloide no hipocampo de Sprague Dawley ratos induziram danos neuronais e ativação microglial aumentada. A administração diária de 1 mg/kg 4-AP suprimiu a ativação microglial e forneceu neuroproteção. Isso foi atribuído à 4-capacidade do AP de bloquear a corrente K mais retificadora externa não inativadora na micróglia ativada e reduzir a produção celular de citocinas pró-inflamatórias.25 Investigações usando um modelo in vivo de neurotoxicidade hipocampal induzida por cainato revelaram efeitos neuroprotetores robustos de { {11}}AP que poderia ser anulado pelo antagonista não competitivo do receptor NMDA MK-801 e pelo antagonista da adenosina A1 8-ciclopentil teofilina. Essas observações sugerem que os receptores NMDA são relevantes para a proteção mediada por 4-AP neste modelo.30 Em um modelo animal de neuropatia autoimune em ratos Lewis, 4-AP melhorou a gravidade clínica e os achados eletrofisiológicos patológicos. Os autores sugeriram que a proteção axonal foi fornecida bloqueando as correntes de entrada mediadas pelo sódio na fase inicial, porque os altos potenciais de membrana na fase aguda da inflamação podem ser neurotóxicos. Na fase crônica, a condução nervosa foi potencialmente melhorada pelo bloqueio da corrente de saída mediada pelo potássio.1

Na encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de inflamação imunomediada do SNC replicando características cardinais da EM, foi relatado que o bloqueio do canal Kv inibe a ativação das células T, potencialmente pelo bloqueio de canais da subfamília Kv1.3 e desmielinização axonal atenuada e degeneração atuando no canal K.3.1 na astroglia, potencialmente induzindo o sinal BDNF. ling. Na EAE induzida por proteína proteolipídica em camundongos SJL,4-o tratamento com AP melhorou significativamente os escores digitais que foram confirmados patologicamente. Observou-se que a expressão da proteína ácida fibrilar glial era regulada negativamente em camundongos tratados com 4-AP, e a ativação de células T e a polarização Th1/17 foram mitigadas. No entanto, no modelo crônico de EAE induzido por peptídeo de glicoproteína de mielina oligodendrócitos (MOG) em camundongos C57BL/6,4-AP não alterou o curso de EAE.5 Outro estudo também investigou os efeitos de {{19} }AP em um modelo MOG-EAE em camundongos C57BL/6 e relatou efeitos sintomáticos, mas sem efeitos modificadores da doença. Nem um tratamento profilático nem terapêutico 4-AP atenuou a gravidade do curso de EAE digital, enquanto os animais tratados com 4-AP mostraram mobilidade melhorada avaliada por análise de pegada e rotarod. Desmielinização da medula espinhal, dano neuronal e imagens de ressonância magnética das alterações do volume cerebral não foram alteradas. A proliferação, IL17 ou produção de IFN-y de células T CD4* também não foram afetadas.3

Mais recentemente, demonstramos que, além de seus efeitos sintomáticos no aumento da condução neural, 4-AP pode prevenir a neurodegeneração da retina durante a neurite óptica experimental induzida pelo peptídeo MOG (EAEON) em camundongos C5BL6.'Usando tomografia de coerência óptica in vivo( OCT), teste de função visual e avaliação histológica, observamos uma redução na extensão da degeneração das camadas internas da retina em modelos de EAEON, tanto para administração profilática quanto terapêutica 4-AP. Nesse modelo, o 4-AP potencializou os efeitos do tratamento imunomodulador com o modulador do receptor de esfingosina-1-fosfato fingolimode, sugerindo modos de ação independentes. É razoável supor que este efeito não se limita apenas ao fingolimode e é aplicável ao 4-AP combinado com outros medicamentos imunomoduladores da EM. Em nosso estudo, a histologia do nervo óptico revelou que, ao contrário do fingolimode,4-AP não teve influência significativa na ativação microglial e/ou infiltração de linfócitos ou macrófagos, sugerindo que os efeitos protetores não estavam relacionados a um modo anti-inflamatório de ação. De acordo com isso, o 4-tratamento com AP não interferiu na indução de EAE, validada por um ensaio de reestimulação de células T. Além disso, observamos proteção significativa da neurodegeneração da retina sob 4-tratamento com AP também no modelo não inflamatório de esmagamento do nervo óptico, enquanto, aqui, o fingolimode não teve efeito. Curiosamente, in vitro, o tratamento 4-AP falhou em proteger diretamente as células ganglionares da retina. Em vez disso, a histologia e os experimentos in vitro indicaram 4-estabilização mediada por AP de células precursoras de mielina e oligodendrócitos. Este efeito foi associado ao aumento do influxo de cálcio e translocação nuclear do fator nuclear de células T ativadas (NFAT). Foi demonstrado anteriormente que o 4-AP regula a homeostase do cálcio elevando os níveis de trifosfato de inositol e, assim, causando a liberação de cálcio dos estoques de cálcio intracelular. No entanto, estudos adicionais sobre 4-AP em modelos desmielinizantes, por exemplo, tratamento com cuprizona ou modelos de camundongos transgênicos com ablação de oligodendrócitos induzíveis podem ser úteis para confirmar essas condições. Os estudos existentes em modelos animais de desmielinização concentram-se principalmente na capacidade de 4-AP para restaurar o potencial de ação, mas carecem de investigações adicionais de células oligodendrogliais (figura).

É importante mencionar que as doses necessárias para obter esses efeitos in vitro são aproximadamente 100-1,000x maiores que a concentração alcançada nos pacientes. Portanto, mecanismos adicionais ou outros podem ser relevantes para as observações feitas in vivo e in vitro. Estes incluem, mas não estão limitados a, uma dissipação de energia diminuída de axônios desmielinizados devido ao bloqueio do vazamento de potássio e capacidades protetoras e reparadoras mais fortes no cérebro, indiretamente resultantes de maior mobilidade e maior exercício.

Além disso, os mecanismos imunomoduladores de 4-AP não podem ser descartados, especialmente porque a ativação reduzida de células T e a polarização Th1/17 foram demonstradas em EAE induzida por PLP em camundongos SJL.3 Além disso, estudos pré-clínicos de outros modelos de doença encontraram uma ativação atenuada e liberação reduzida de mediadores pró-inflamatórios pela microglia. Esses resultados controversos destacam os diversos mecanismos patológicos dos diferentes modelos animais, onde as células imunes são mais ou menos suscetíveis às estratégias de tratamento. As discrepâncias entre nossos resultados e relatórios anteriores de apenas efeitos sintomáticos no EAE induzido pelo peptídeo MOG em camundongos C57BL6" podem, pelo menos em parte, ser explicadas por (1) diferenças na dosagem porque outros usaram doses de 100 ug e 600 ug/camundongo/dia, enquanto administramos 250ug/camundongo/d;(2)duração do tratamento(40,60 e 90 dias por Göbel et al,* Moriguchi et al,3 e Dietrich et al, "respectivamente); e (3) quantidade de MOG usada para imunização porque usamos 200 ug de MOG por camundongo, enquanto outros usaram apenas 100 ug de MOG por camundongo. Pesquisas recentes se concentram no papel da microbiota intestinal em influenciar a indução e a gravidade da EAE, alterando o equilíbrio das células T e B efetoras e reguladoras. O microbioma dos roedores pode diferir entre as instalações de animais, resultando em diferenças na gravidade da EAE, curso e possivelmente até na resposta à terapêutica. Tomados em conjunto, esses fatores podem explicar a heterogeneidade nos resultados do estudo.

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Abordagem clínica em 4-PA em pacientes com EM

Vários ensaios clínicos desde a década de 1980 já sugeriam os efeitos benéficos do 4-AP em pessoas com EM. Entre outros, eles identificaram melhora nas funções motoras40-2 e visuais-44 e fadiga.5-7 No entanto, limitações do estudo, ausência de um desenho de estudo homogêneo e pequeno número de pacientes proibiram a aprovação de {{ 5}}AP pelas autoridades regulares e levaram ao uso off-label por mais de 3 décadas.4 Por outro lado, alguns desses estudos facilitaram o desenvolvimento da formulação de liberação sustentada (SR-4-AP ou fampridina) porque eles descobriram que os níveis plasmáticos do composto original de liberação imediata eram inconsistentes e imprevisíveis. O primeiro estudo clínico com SR-4-AP foi realizado em 1997 por Schwid et al.,49 demonstrando uma melhora significativa da velocidade de caminhada e uma tendência à melhora da força muscular.

O sistema de tecnologia de liberação estendida foi desenvolvido pela Elan Pharmaceuticals. Ele usou o chamado sistema de absorção de drogas de matriz, consistindo em uma matriz de polímero proprietária que controla a liberação por difusão e erosão por enzimas gastrointestinais. Isso resultou em níveis plasmáticos de droga de pico mais baixos e uma duração de ação mais longa.1 Inicialmente, o SR-4-AP foi testado em 4 ensaios. Em 2007, Goodman et al.1 realizaram incrementos de dose variando de 5 mg de 10 a 40 mg duas vezes ao dia com 36 pacientes com EM. No Timed 25 Foot Walk Test (T25FW), nenhuma mudança significativa foi observada, enquanto uma análise post hoc convertendo os dados em velocidade de caminhada (ft/s) atingiu significância. Além disso, observou-se uma melhora na fadiga autorreferida. Em um estudo de comparação de dose em 2008 (randomizado, duplo-cego, controlado por placebo), Goodman et al.2 recrutaram 206 pacientes, recebendo placebo ou doses de 10,15 ou 20 mg duas vezes ao dia. Novamente, a análise post hoc comparando a melhora na velocidade de caminhada encontrou resultados significativamente melhores para todos os grupos de tratamento individualmente e para todos os pacientes tratados com SR-4-AP agrupados em comparação com placebo. A força do muse foi melhorada para os grupos tratados com 10-mg e 15-mg, mas não para os grupos tratados com 20 mg em comparação com os indivíduos placebo. Nos 2 ensaios clínicos de fase Ⅲ subsequentes (21-ensaio randomizado duplo-cego controlado por placebo, 301 pacientes e 14-ensaio duplo-cego controlado por placebo, 239 pacientes) com 10 mg duas vezes ao dia, os pacientes foram divididos em um grupo respondedor e um grupo não respondedor, definido pela melhora consistente em T25FW. Em ambos os estudos, o aumento na velocidade de caminhada foi significativo em comparação com o grupo não respondedor ou placebo. Além disso, houve uma melhora na pontuação do 12-Item MS Walking Scale(MSWS-12) para os respondentes.2122

Em um ensaio de extensão aberto desses estudos, foi demonstrado que a melhora clínica foi perdida após a retirada do medicamento, mas retornou 2 semanas após o reinício da terapia de SR-4-AP.Ampyra/Fampyra, a formulação em comprimido de SR{ {3}}AP recebeu aprovação total da Food and Drug Administration em janeiro de 2010 para melhorar a caminhada em pacientes com EM, mas apenas uma autorização de comercialização condicional em 2011 da Agência Europeia de Medicamentos (EMA). Com base nos ensaios mencionados, a aprovação foi condicionada à disposição de fornecer mais dados de eficácia e segurança a longo prazo. Assim, foi iniciado um estudo exploratório de fase II (MOBILE) e um estudo confirmatório de fase I (ENHANCE).

No estudo exploratório MOBLE com 132 participantes, foi encontrada uma melhoria da velocidade de impressão global do paciente de mudança (PGIC), MSWS-12 e Timed Up and Go (TUG)23 Para avaliar a eficácia e segurança a longo prazo de SR-4-AP, o estudo confirmatório ENHANCE (10mg duas vezes ao dia em 646 pacientes com EM) foi realizado. Além das melhorias relatadas no estudo MOBILE, os autores encontraram uma melhora significativa de pacientes tratados com SR-4-AP na 29-Item MS Impact Scale.5 A EMA posteriormente concedeu aprovação incondicional de SR{ {11}}AP para o tratamento de pacientes com EM com dificuldades de locomoção. O estudo observacional da fase ENABLE com 901 pacientes demonstrou que o tratamento com SR{13}}AP é benéfico para pacientes com EM por meio da autopercepção do funcionamento físico e da saúde psicológica em um cenário do mundo real2(tabela 2).

Com base nos dados pré-clínicos promissores sobre proteção contra neurodegeneração da retina descritos acima, nosso grupo realizou um estudo retrospectivo e multicêntrico de OCT para comparar longitudinalmente a neurodegeneração da retina entre 52 pacientes em terapia contínua com 4-AP e 51 controles que foram pareados para todas as covariáveis ​​relevantes usando um algoritmo de correspondência predefinido. De acordo com os dados experimentais, durante a terapia 4-AP concomitante, a degeneração da camada de fibras nervosas da retina macular foi reduzida em 2 anos. No entanto, esses achados precisam ser corroborados em estudos de coorte independentes e idealmente prospectivos, especialmente porque o tamanho do efeito foi baixo e as taxas de afinamento da camada de fibras nervosas da retina peripapilar e células ganglionares maculares/camada plexiforme interna não diferiram significativamente entre os grupos . Essas discrepâncias de um efeito protetor do 4AP apenas no RNFL, mas nem no pRNFL nem no McGill, não são facilmente explicadas. É importante mencionar que, como o 4AP é licenciado apenas para melhorar a incapacidade de locomoção em pacientes com EDSS 3.5-5, as taxas de alteração analisadas foram investigadas em estágios mais avançados da doença e sem neurite óptica aguda. Nesse cenário, ocorrem apenas alterações retinianas muito sutis, e grandes coortes seriam necessárias para detectar os efeitos do tratamento. Portanto, o estudo retrospectivo em pacientes certamente não teve poder suficiente para detectar com segurança os efeitos protetores do tratamento, e não é surpresa que apenas um dos resultados tenha sido positivo. Possivelmente, o mRNFL foi a camada mais sensível para a detecção dos efeitos do tratamento.5"

Em resumo, um crescente corpo de evidências in vivo sugere que 4-AP, além de seus efeitos sintomáticos bem conhecidos, ao prevenir a neurodegeneração pode modificar o curso da doença de EAEON e possivelmente até mesmo pacientes com EM. Evidências preliminares in vitro implicam o envolvimento dos níveis de cálcio celular e da via NFAT, mas investigações adicionais são necessárias para elucidar os mecanismos moleculares exatos subjacentes ao efeito neuroprotetor do 4-AP na desmielinização inflamatória imunomediada. Esses achados podem ter um impacto marcante nas estratégias de tratamento da EM se confirmados em um ensaio clínico prospectivo randomizado controlado.

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