Efeitos neuroprotetores do extrato de folha de Glochidion Zeylanicum contra a toxicidade induzida por H2O2/glutamato em células neuronais cultivadas e toxicidade induzida por A em Caenorhabditis Elegans 2

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3.3. Efeitos Neuroprotetores do Extrato de GZM contra Estresse Oxidativo Induzido por Glutamato em Células Neuronais Cultivadas (HT22 e Neuro-2a)

Para investigar se o GZM atua contra o dano oxidativo, o nível de ROS intracelular foi examinado. Evidência de toxicidade induzida por glutamato em células HT22 e Neuro-2a foi mostrada pelo aumento da produção de ROS intracelular (1.7-1.9-vez) (Figura 4a,b). A produção de ROS intracelular induzida por glutamato foi claramente reduzida pelo co-tratamento com extrato de GZM (Figura 4a,b). Investigamos ainda as enzimas antioxidantes endógenas para apoiar os efeitos protetores do extrato de GZM sobre a exposição ao glutamato. A expressão de enzimas antioxidantes, incluindo glutationa-S-transferase (GST), glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) foi medida. Em nosso estudo anterior, a maior concentração de extrato de GZM (10 ug/mL) foi relatada para exibir uma poderosa atividade antioxidante in vitro e in vivo [11]. De acordo com o relatório, a maior concentração de extrato de GZM (10 ug/mL) exibiu potente neuroproteção nas células HT22 e Neuro{16}}a (Figuras 2-4). Além disso, o extrato de GZM (10 ug/mL) aumentou a expressão gênica de enzimas antioxidantes, incluindo SOD1, SOD2, GPx, GST e GSTa2, em células HT22 e Neuro-2a, exceto para CAT (Figura 4c,d ). Os resultados indicam que o extrato de GZM protege contra a citotoxicidade induzida por glutamato/H2O2-pela supressão da produção intracelular de EROs e indução da expressão de enzimas antioxidantes.

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3.4. Efeitos do extrato de GZM na expressão das vias SIRT1/Nrf2

Para determinar o mecanismo subjacente dos efeitos neuroprotetores do extrato de GZM, investigamos os níveis de expressão de SIRTl e Nrf2. Descobrimos que os neurônios tratados com GZM aumentaram significativamente os níveis de proteína SIRTl e Nrf2 (Figura 5a,b). Além disso, o tratamento com GZM modula potencialmente os genes antioxidantes regulados da via de sinalização SIRT1/Nrf2 NQO1, GCLM, EAAT3 e SIRT1 (Figura 5c,d). Os resultados indicaram que o extrato de GZM aumenta a via de sinalização SIRT1/Nrf2 para promover defesas celulares contra insultos tóxicos.

3.5. Efeitos do Extrato de GZM na Atividade de Crescimento de Neurita em Células Neuro-2a

Para estudar a diferenciação neuronal, as células Neuro-2a foram usadas como representantes[18]. De acordo com estudos anteriores, a privação de soro (DMEM suplementado com 1% de FBS) induziu o crescimento de neurites em Neuro{3}}a [18]. Células neuro-2a tratadas com extrato de GZM resultaram no aumento da neuritogênese. Células Neuro-2a tratadas com extrato de GZM aumentaram os comprimentos de neurita (30,92 um) e o número de células portadoras de neurita (52,35 por cento) quando comparadas com o controle (1 por cento FBS) (comprimento de neurita, 16,30 um; portador de neurita células, 22,26 por cento) (Figura 6a,bg).

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Para garantir ainda mais a ocorrência de atividades de crescimento de neuritos, a expressão dos marcadores de crescimento de neuritos, proteína 43 associada ao crescimento (GAP-43) [19] e Teneurina-4 (Dez-4) [20] foram determinados. O extrato de GZM aumentou significativamente a expressão de GAP-43 e Ten-4 nos níveis de mRNA e proteína em células Neuro-2a quando comparado com o controle de DMSO (1 por cento de FBS ) (Figura 6c-f) sugerindo o efeito de neuritogênese do extrato de GZM.

3.6. Efeitos neuroprotetores do extrato de GZM contra paralisia induzida por A em C.elegans

A fim de examinar melhor os efeitos neuroprotetores do extrato de GZM in vivo, foram utilizadas cepas transgênicas de C. elegans expressando A. Nós primeiro investigamos os efeitos do extrato de GZM contra a paralisia induzida por A em vermes transgênicos CL4176 e CL2006. Em nosso estudo anterior, o extrato de GZM mostrou resistência ao estresse oxidativo e propriedades de extensão da vida útil em C. elegans na concentração não tóxica （1-5 ug/mL）【11】. A cepa de controle CL802 (não expressando A) não apresentou paralisia, apesar do tratamento (dados não mostrados) na concentração testada (1-5 ug/mL).cistache wirkungDescobrimos que os vermes CL4176 tratados com extrato de GZM mostraram marcadamente um atraso no PT50 (tempo necessário para 50% dos nematóides ficarem paralisados) quando comparados ao controle de DMSO (Figura 7a) (Tabela S1, Materiais Suplementares). Da mesma forma, o extrato de GZM também exibiu um atraso na paralisia induzida por A de vermes transgênicos CL2006 durante a idade adulta (Figura 7b). Os resultados sugerem que o extrato de GZM protege C.elegans de danos induzidos por A.

3.7. Efeitos neuroprotetores do extrato de GZM contra defeitos induzidos por A no comportamento de quimiotaxia em C.elegans

Para apoiar os efeitos neuroprotetores do extrato de GZM em C.elegans, foi realizado um ensaio de quimiotaxia com vermes transgênicos CL2122 e CL2355. Vermes transgênicos CL235 foram encontrados para expressar A 1-42 nas células neuronais, o que resultou em defeitos na sensibilidade à quimiotaxia 【21】. Uma vez que o extrato GZM na concentração 1-5 ug/mL retardou a paralisia em vermes transgênicos CL4176, o extrato GZM 5 ug/mL foi escolhido para todos os experimentos subsequentes. Para determinar o efeito potencial do extrato de GZM no comportamento da quimiotaxia, usamos diacetil como atrativo. Os resultados são expressos como o índice de quimiotaxia comparado com o do controle não tratado. Primeiro, descobrimos que o tratamento com extrato de GZM não afetou o comportamento de quimiotaxia do mutante CL2122 (cepa de controle transgênica) (Figura 7d). Vermes CL2355 tratados com extrato de GZM mostraram uma resposta quimiossensorial significativamente melhorada ao atrativo (diacetil) em comparação com o controle não tratado (Figura 7c), indicando que o extrato de GZM tem o potencial de melhorar o comportamento de quimiotaxia em C.elegans contra A.bioflavonóides cítricosTomados em conjunto, o efeito do extrato de GZM no comportamento dependente de A de C. elegans pode fornecer a oportunidade de decifrar a neuroproteção mediada pelo extrato de GZM contra a DA.

4. Discussão

A doença de Alzheimer (DA) é uma condição neurodegenerativa predominantemente encontrada em populações idosas em todo o mundo [1]. Atualmente, não há tratamento satisfatório para a ampla gama de condições patológicas associadas à DA. O estresse oxidativo está intensamente correlacionado com doenças neurodegenerativas, particularmente a DA [3].benefícios do cinomoriumProdutos naturais contendo potentes antioxidantes podem ser utilizados como tratamentos alternativos ou para a prevenção de doenças neurodegenerativas. No estudo atual, exploramos os efeitos do extrato de GZM na neurodegeneração. Este é o primeiro relato a descrever os efeitos neuroprotetores do extrato de folha de GZ in vitro (células neuronais cultivadas HT22 e Neuro-2a) e in vivo (C.elegans).

A toxicidade neuronal induzida pelo estresse oxidativo é considerada um dos principais fatores aliados ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, incluindo a DA [3]. Altos níveis de glutamato ativam a produção de EROs, levando à neurotoxicidade, dano celular neuronal e, eventualmente, morte celular neuronal [4,6]. Além disso, o peróxido de hidrogênio (H2O2) é um mediador essencial comum do estresse oxidativo em células neuronais [22]. Portanto, glutamato e H2O2 foram usados ​​como agentes neurotóxicos para induzir a morte celular neuronal neste estudo. Para estudar o efeito neuroprotetor contra a toxicidade do glutamato, células HT22 neuronais hipocampais de camundongos sem os receptores ionotrópicos de glutamato foram empregadas [6]. Além disso, as células Neuro{11}}a do neuroblastoma de camundongo são amplamente utilizadas como representantes no estudo do crescimento de neuritos e diferenciação neuronal [23]. Primeiro, os efeitos neuroprotetores do extrato de GZM contra a toxicidade induzida por H-Oz/glutamato foram determinados usando células HT22 e Neuro{16}}a. Descobrimos que o extrato de GZM exerceu um potente efeito neuroprotetor contra a citotoxicidade induzida por glutamato/H2O2-em células HT22 e Neuro{20}}a.

O estresse oxidativo após a exposição ao glutamato pode ser uma causa de degradação estrutural, danos ao DNA e disfunção mitocondrial, que desempenham papéis importantes na morte celular neuronal [6]. Em nosso estudo, a viabilidade das células tratadas apenas com glutamato foi notavelmente baixa (aproximadamente 50 por cento menor) em oposição à das células de controle não tratadas. Além disso, uma elevação notável no nível de ROS intracelular foi detectada em células HT22 (1.7-vez) e Neuro-2a (1,9 vezes) após tratamento com glutamato quando comparado ao controle não tratado. Consequentemente, verificou-se que a citotoxicidade induzida por glutamato em células neuronais (HT22 e Neuro{10}}a) estava de fato aliada a um aumento de ROS intracelular corroborando com os relatórios anteriores[24]. As enzimas antioxidantes endógenas, CAT, SOD, GST e GPx desempenham papéis essenciais na neuroproteção, prevenindo danos celulares mediados por ROS [25-27]Descobrimos que o extrato de GZM pode neutralizar a citotoxicidade induzida por H-Oz/glutamato, suprimindo Produção de ROS e aumento da expressão de genes antioxidantes correspondentes ao relatório anterior, no qual extratos de GZ estimularam a expressão de Sod-3 e Gst-4 em C.elegans [11].

O fator de transcrição NRF2 (fator nuclear erythroid 2-related factor 2) é o principal mecanismo celular de resposta ao estresse oxidativo e dano celular [28-31]. A via de sinalização SIRT1/Nrf2 é uma importante via de sinalização para equilibrar o estresse oxidativo, que está ativamente envolvido em várias doenças neurodegenerativas [25,26]. A SIRT1 gerencia os fatores de transcrição, inclusive o Nrf2, que atua como regulador mestre do sistema de defesa antioxidante. O Nrf2 se liga ao elemento de resposta antioxidante (ARE), levando a uma expressão aprimorada de enzimas desintoxicantes (fase II) (GPx, GSTol e GSTa2) e genes antioxidantes (SOD, CAT, NQO1, GCLM e EAAT3)[25,26] .De acordo com relatórios, a expressão de proteínas SIRT1 e Nrf2, bem como genes antioxidantes, incluindo NQO1, GCLM, EAAT3 e SIRT1, foram regulados positivamente após o tratamento com GZM. Além disso, pela expressão de enzimas antioxidantes endógenas, SOD, GPx, GSTol e GSTa2 também foram significativamente aumentados, o que pode ser devido à ativação de Nrf2/ARE. Os resultados estão de acordo com nosso estudo anterior, no qual os extratos de GZleaf demonstraram fornecer propriedades de resistência ao estresse oxidativo em C. elegans através de mecanismos dependentes de SKN-1/Nrf-2 [11]. Coletivamente, nossos achados sugerem que as propriedades de defesa antioxidante do extrato de GZM em células neuronais cultivadas (HT22 e Neuro-2a) envolvem a via de sinalização SIRT1/Nrf2. O NRF2 demonstrou influenciar a direção do metabolismo do glutamato derivado da glutamina, incluindo a geração do antioxidante glutationa (GSH) para manter a homeostase redox [13]. Neste estudo, primeiro focamos nas propriedades antioxidantes do extrato de GZM através da via de sinalização SIRT1/Nrf2, que é uma defesa antioxidante bem conhecida. Descobrimos que o extrato de GZM aumenta a via de sinalização SIRT1/Nrf2 para promover a defesa celular contra insultos tóxicos. No entanto, a investigação dos efeitos do extrato de GZM na via de sinalização SIRT1/Nrf2 sob condições de toxicidade induzida por glutamato é um tópico interessante para confirmar as propriedades antioxidantes do extrato de GZM através da via de sinalização SIRT1/Nrf2.

Os desequilíbrios entre radicais livres e antioxidantes (estresse oxidativo) têm sido implicados na progressão de doenças neurodegenerativas [1,3]. Durante a última década, compostos polifenólicos foram explorados extensivamente em efeitos neuroprotetores devido às suas propriedades antioxidantes[13,32-35].método de extração de flavonóides pdfAlém disso, compostos antioxidantes indiretos [36] (sistemas antioxidantes moderados e vias relacionadas, mas não interações diretas com espécies reativas), como ácido docosahexaenóico (DHA) [37], vitamina K [38] e ácido sinápico [39] surgiram em o tratamento alternativo de doenças neurodegenerativas. Diante do exposto, nossos achados são apoiados no sentido de que os efeitos benéficos do GZM sobre os efeitos neuroprotetores são possivelmente dependentes de sua atividade antioxidante.

A neuritogênese ou crescimento de neuritos desempenha um papel essencial no desenvolvimento neuronal [32].jacinto do desertoAs propriedades de crescimento de neurite do extrato de GZM foram determinadas usando células Neuro-2a. O extrato de GZM demonstrou exercer atividades de crescimento de neuritos, pois elevou o comprimento de neuritos e o número de células portadoras de neuritos. Além disso, esses fenômenos foram confirmados pelo aumento da expressão dos marcadores de crescimento de neuritos GAP-43 e Ten-4. Vários estudos relataram que polifenóis, incluindo ácido gálico [32,34], cate-chin [ 13,40,41] e quercetina [33,42,43], promovem a atividade de crescimento de neuritos. A presença de compostos fenólicos, bem como ácido gálico, catequina e quercetina no extrato de GZM pode ser responsável pelo comportamento observado (Figura complementar S1)[1,12].

As placas A e as proteínas tau são marcas bem conhecidas da DA [4,45]. A produção e a deposição anormais de A desempenham papéis importantes na patogênese da DA [44].C.el egans é um organismo modelo útil para entender a neurodegeneração associada à idade [47]Este verme tem um sistema nervoso básico que contém apenas 302 neurônios que mapeiam de forma abrangente a conectividade neuronal [47]. Além disso, o verme transgênico apresenta acúmulo de proteínas carbonilas e ROS, semelhante à patologia da DA [48]. Assim, alavancamos a correlação estabelecida entre a expressão de A e sintomas aparentes, incluindo paralisia e comportamento de quimiotaxia, no modelo transgênico de C.elegans. O fenótipo de paralisia em A expressando (nos músculos) cepas CL4176 e CL2006 foi investigado pela primeira vez. O extrato de GZM retardou o início induzido por A e a paralisia envelhecida em vermes transgênicos CL4176 e CL2006, respectivamente. Para conectar a toxicidade A com funções neurológicas, o comportamento de quimiotaxia da cepa expressando A (em neurônios) CL2355 foi explorado. O extrato de GZM mostrou melhorias nos defeitos comportamentais de quimiotaxia em vermes transgênicos CL2355 contra A. Coletivamente, esses resultados indicam que o extrato de GZM protege as funções musculares e neurológicas em C elegans da toxicidade induzida por A. Diversos estudos relataram que os fatores de transcrição DAF-16 e SKN-1 desempenham papéis cruciais na deposição de A nos nematóides[47,48]. Em nossos estudos anteriores, provamos que o extrato de folha GZM pode estimular a resistência ao estresse oxidativo através das vias de sinalização DAF-16/FoxO e SKN-1/Nrf-2, levando a melhorias na o tempo de vida e saúde de C. elegans [11]. Especulamos que DAF-16/FoxO e SKN-1/Nrf-2 podem desempenhar papéis na proteção mediada por extrato de GZM contra a toxicidade A.

Vários estudos relataram que os antioxidantes fenólicos podem proteger contra a neurotoxicidade induzida por glutamato, peptídeos A e estresse oxidativo, que depende principalmente das vias de sinalização Nrf2/ARE [13,17,49-52]. O extrato de GZM contém compostos fenólicos, incluindo ácido gálico, catequina e quercetina (Figura complementar S1)[1,12]. Assim, efeitos neuroprotetores mediados pela via de sinalização SIRT1/Nrf2 podem resultar da presença de compostos bioativos no extrato de GZM. Mais estudos são necessários para confirmar o envolvimento dos efeitos neuroprotetores e explorar mais possíveis alvos do extrato de GZM.

5. Conclusões

Em conclusão, os efeitos neuroprotetores do extrato de GZM contra a toxicidade induzida por H202/glutamato/A e propriedades de crescimento de neuritos foram demonstrados neste estudo. O extrato de GZM protege contra a toxicidade oxidativa induzida por H4O2/glutamato, inibindo o acúmulo de ROS intracelular e aumentando as enzimas antioxidantes endógenas através da via de sinalização SIRT1/Nrf2. Além disso, o extrato de GZM protege contra a toxicidade induzida por A em C. elegans. Além de seus efeitos neuroprotetores, o extrato de GZM exibiu efeitos benéficos na promoção da atividade de crescimento de neuritos. Antioxidantes que estão inter-relacionados no processo de superação da toxicidade induzida pelo estresse oxidativo e atividade indutora de crescimento de neuritos tornaram-se os principais alvos da terapia neuroprotetora. O extrato de GZM exibe propriedades neuroprotetoras que não são apenas protetoras contra a toxicidade induzida por H202/glutamato/A, mas também promovem a atividade de crescimento de neuritos. Os efeitos neuroprotetores do extrato de GZM foram confirmados com sucesso em células neuronais cultivadas (HT22 e Neuro-2a) e modelos de C. elegans. O presente estudo confirma, pela primeira vez, os efeitos neuroprotetores benéficos do extrato de GZM, sugerindo que G.zeylanicum pode ser um candidato neuroprotetor para a prevenção e tratamento da DA e outros distúrbios neurodegenerativos relacionados ao estresse oxidativo. No entanto, mais estudos são necessários em organismos modelo mais complexos para iluminar os componentes ativos do extrato de GZM e as vias mecanicistas envolvidas na neuroproteção, a fim de apoiar o potencial terapêutico dos extratos vegetais para tratamento alternativo ou adjuvante de doenças neurodegenerativas.

Este artigo foi extraído de Biology 2021, 10, 800. https://doi.org/10.3390/biology10080800 https://www.mdpi.com/journal/biology