Efeitos neuroprotetores e mecanismos de procianidinas in vitro e in vivo parte 1

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Abstrato:Este estudo avaliou aneuroprotetorefeitos e mecanismos das procianidinas (PCs). In vitro, células de feocromocitoma de rato (células PC12) foram expostas a PCs (1,2 ou 4 ug/mL) ou N-acetil-L-cisteína （NAC） （20 μM） por 24 h e depois incubadas com 200 μM de H, O, por 24 h. Comparado com H2O2 sozinho, os PCs aumentaram significativamente as atividades antioxidantes (por exemplo, glutationa peroxidase (GSH-Px), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), diminuição dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e malondialdeído (MDA) e aumento nuclear fator-eritróide 2-relacionado ao fator 2(Nrf2) acumulado e aumentou a expressão de quinona oxidorredutase 1(NQO1), heme oxigenase 1 (HO-1), subunidade modificadora de glutamato-cisteína ligase (GCLM) e subunidade catalítica da ligase de glutamato-cisteína (GCLC). presença de 300 μM de H, O, por 4 dias. Comparado com H, O, sozinho, PCs aprimoradosantioxidanteatividades (por exemplo, GSH-Px, CAT e SOD), níveis reduzidos de ROS e MDA e ativação aprimorada de Nrf2/elemento de resposta antioxidante (ARE) e níveis de expressão aumentados de NQO1, HO-1, GCLM e GCLC .Em conclusão, estes resultados indicaram que os PCs exerceram efeitos neuroprotetores através da ativação da via Nrf2/ARE e alívio do dano oxidativo.

Palavras-chave:procianidinas; neuroprotetor; peixe-zebra; células PC12; Caminho Nrf2/ARE

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1. Introdução

A doença neurodegenerativa refere-se à degeneração lenta e gradual doneurôniosno cérebro humano, o que leva a uma variedade de problemas motores e/ou cognitivos e, eventualmente, leva à morte neuronal[1]. Com o aumento do número de idosos, a taxa de incidência de doenças neurodegenerativas senis está aumentando rapidamente [2,3]. Embora os mecanismos subjacentes da neurodegeneração ainda não estejam claros, evidências consideráveis ​​mostram que o estresse oxidativo causado pela superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS) e/ou comprometimento do sistema de defesa antioxidante desempenha um papel fundamental nessas doenças [4-6]. No processo de neurodegeneração, há um desequilíbrio entre a produção de ROS intracelular e a capacidade do sistema de defesa antioxidante de eliminar ROS e/ou reparar danos mediados por ROS 7]I. A produção excessiva de ROS leva a danos macromoleculares. Portanto, o acúmulo de dano macromolecular celular leva à necrose [8,9. Consequentemente, a suplementação de antioxidantes para eliminar o excesso de ROS pode ajudar a prevenir doenças neurodegenerativas. Os compostos bioativos naturais são seguros com pouco ou nenhum efeito colateral. Portanto, atenção crescente tem sido dada à descoberta de compostos antioxidantes de recursos naturais.

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As procianidinas (PCs) são compostos fenólicos naturais de flavonóides e contêm oligômeros de monômeros catequina eepicatequina[10-12]. Os PCs são nutrientes e antioxidantes naturais, e seus efeitos antioxidantes são mais fortes do que os da vitamina C e da vitamina E [13]

No entanto, os efeitos neuroprotetores e o mecanismo de PCs em relação ao dano oxidativo in vivo e in vitro permanecem obscuros.

O peixe-zebra é um peixe ciprinídeo tropical de água doce confinado à Índia. Curiosamente, cerca de 87 por cento dos genes relacionados a doenças humanas estão ligados a genes homólogos no peixe-zebra [14]. Em relação aos modelos experimentais de camundongos, a utilização do peixe-zebra como sistema modelo está associada a períodos experimentais mais curtos, custos reduzidos e manipulações genéticas mais fáceis [15]. Em termos de modelos in vitro, ratosfeocromocitomacélulas (células PC12) são semelhantes aos neurônios em termos de morfologia, estrutura e função [16]. Suas características são altamente consistentes com as dos neurônios cultivados primários e têm vantagens experimentais em termos de serem mantidas de forma fácil e estável em cultura [17]. Além disso, as células PC12 têm sido amplamente utilizadas como modelos in vitro para estudar células nervosas [18-20]. O peróxido de hidrogênio (H, O2) é um tipo de ROS que pode permear as membranas celulares e iniciar o estresse oxidativo [21]. Numerosos relatos demonstraram que HO, pode ser usado para estabelecer modelos de estresse oxidativo [22-24]. Neste estudo, avaliamos os efeitos neuroprotetores e mecanismos de PCs em células PC12 e peixe-zebra.

2. Resultados

2.1. Efeitos de PCs em H2O2-Dano Tratado de Células PC12

As células PC12 foram expostas a 200μM H, O, por 24 h, e a viabilidade celular diminuiu para 56,5 por cento (Figura la). O pré-tratamento de células com PCs sozinho a 1,2 ou 4 ug/mL não teve efeito na viabilidade celular, enquanto o tratamento com 1,2 e 4 ug/mL de PCs protegeu significativamente as células PC12 da citotoxicidade tratada com H2O{13}}por melhorar viabilidade celular (Figura 1b,c,p<0.05 versus="" h,="" o2-treated="" group).="" however,="" pcs="" treatment="" alone="" at8ug/ml="" decreased="" cell="" viability="" (figure="" 1b).="" n-acetyl-l-cysteine="" (nac),="" whichis="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="">

2.2. Efeitos de PCs no Estresse Oxidativo de Células PC12 Tratadas com H2O2

Os níveis de ROS e malondialdeído (MDA) indicam a gravidade do dano oxidativo. Células PC12 expostas a 200 μM de H2O2 por 24 h aumentaram os níveis de ROS e MDA, e o pré-tratamento de 2 e 4 ug/mL de PCs inibiu os níveis de ROS e MDA（Figura 2a-c, p<0.05 versus="" h,="" o2-induced="" group).="" to="" further="" evaluate="" the="" antioxidant="" effects="" of="" pcs="" in="" h,o,-induced="" pc12="" cells,="" we="" measured="">glutationaperoxidase (GSH-Px), catalase (CAT) e atividades de superóxido dismutase (SOD), e observaram que o tratamento com H, O suprimiu as atividades de GSH-Px, CAT e SOD. No entanto, os efeitos induzidos por H2O2-foram resgatados pelo pré-tratamento com PCs a 2 e 4 ug/mL （Figura 2d-f,p<0.05 versus="" h2o2-treated="">

2.3. Efeitos de PCs no Fator Nuclear-Eritróide 2-Fator 2(Nrf2)/via ARE relacionado em H2O2-Células PC12 tratadas

Descobrimos que o nível de Nrf2 foi regulado positivamente e a expressão de Keapl foi regulada negativamente após o pré-tratamento com PCs (2 e 4 ug/mL) antes do tratamento com HO, em comparação com esses níveis no grupo induzido por HO (Figura 3a-c ,p<0.05 versus="" h,o,-induced="" group）.="" furthermore,="" pcs="" （4="" μg/ml）="" facilitated="" nuclear="" localization="" of="" nrf2="" under="" h,o,-lesioning="" conditions="" (figure=""><0.05 versus="" h2o2-induced="" group).addition-ally,="" western="" blotting="" showed="" that="" heme="" oxygenase="" 1="" (ho-1),="" quinone="" oxidoreductase="" 1(nqo1),="" glutamate-cysteine="" ligase="" catalytic="" subunit(gclc),="" and="" glutamate-cysteine="" ligase="" modifier="" subunit="" (gclm)="" levels="" were="" upregulated="" following="" pcs(2="" and="" 4="" ug/ml)treatment="" compared="" with="" h2o2="" alone="" (figure="" 3g-k,=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Figura 3. Efeitos de PCs na via Nrf2/ARE em células PC12 tratadas com H, O2-. (a) Níveis de proteína de Nrf2 e Keap1, conforme determinado por Western blotting; (b) expressão relativa da proteína Nrf2/GAPDH (razão para controle); (c) expressão relativa da proteína Keap1/GAPDH (relação para controle); (d) níveis de expressão da proteína Nrf2 nuclear e Nrf2 citoplasmático, conforme determinado por Western blotting; (e) expressão relativa da proteína Nrf2/LaminB nuclear (razão para controle); (f) expressão relativa da proteína Nrf2/GAPDH citoplasmática (proporção para controle); (g) níveis de proteína de HO-1, NOO1, subunidade catalítica de glutamato-cisteína ligase (GCLC) e GCLM, conforme determinado por Western blotting; (h) expressão relativa da proteína HO-1/GAPDH (proporção para controle); (i) expressão relativa da proteína NQO1/GAPDH (proporção para controle); (j) expressão relativa da proteína GCLC/GAPDH (proporção para controle); (k) Expressão relativa da proteína GCLM/GAPDH (razão para controle). Os dados são expressos como a média ± SD. Todos os experimentos foram realizados três vezes. Valores com letras diferentes acima são significativamente diferentes (p<0.05, one-way="">

2.4. A sinalização Nrf2/ARE é responsável pelos efeitos antioxidantes mediados por PCs

Como mostrado na Figura 4a,b, Nrf2 siRNA inibiu a expressão de Nrf2. Enquanto isso, o tratamento com Nrf2 siRNA eliminou os efeitos protetores de PCs contra danos oxidativos tratados com H2O2-, conforme evidenciado pela viabilidade celular reduzida no grupo transfectado com Nrf2-siRNA (Figura 4c). Simultaneamente, as ações dos PCs no conteúdo de MDA e na atividade de SOD foram revertidas pelo knockdown de Nrf2 sob condições de lesão de H2O{12}}(Figura 4d,e).

Figura 4. A sinalização Nrf2/ARE é responsável por ações antioxidantes mediadas por PCs em células PC12 tratadas com H2O2-. (a) A eficiência de knock-out foi detectada pela determinação da expressão da proteína Nrf2 usando Western blotting; Expressão relativa da proteína GAPDH (relação para controle); (c) viabilidade celular; (d) níveis de MDA; (e) atividade de SOD. Os dados estão expressos em média± DP. Todos os experimentos foram realizados três vezes. Valores com letras diferentes acima são significativamente diferentes, (p.<0.05, **p="" <="" 0.01="" relative="" to="" control="" group,="" one-way="">

2.5. Efeitos de PCs na motilidade de larvas de peixe-zebra após tratamento com H2O2

O dano oxidativo induzido por H2O2- diminuiu a distância total de natação das larvas de peixe-zebra. O tratamento com PCs (4, 8 e 16 ug/mL) resgatou déficits locomotores induzidos por H2O2-, como evidenciado por uma distância de movimento aumentada em relação à do grupo H2O2 (Figura 5a,b,p<0.05 versus="" h2o2-treated="" group).="" nac,="" which="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="" control.="" moreover,="" pcs(16ug/ml)or="" nac（30="" μm）="" alone="" did="" not="" affect="" the="" locomotor="" behavior="" of="" normal="" zebrafish="">

Figura 5. Efeitos de PCs na motilidade de larvas de peixe-zebra tratadas com H2O2-. (a) Padrões típicos de traços de natação de larvas de peixe-zebra em cada grupo; (b) distância total média de larvas de peixe-zebra em cada grupo. Os dados são apresentados como a média ± SD. Todas as experiências foram repetidas três vezes. Valores com letras diferentes acima são significativamente diferentes (p<0.05, one-way="">

2.6. Efeitos dos PCs no Estresse Oxidativo de Larvas Zebrajish Tratadas com H2O2

O tratamento de PCs (4,8 e 16 ug/mL) para larvas de peixe-zebra reduziu os aumentos induzidos por H2O2-na formação de ROS intracelular (Figura 6a,b, p<0.05 versus="" h,="" o,-treated="" group).="" lipid="" peroxidation="" assays="" also="" indicated="" that="" pcs(4,8,="" and="" 16="" ug/ml)="" dose-dependently="" blocked="" h2o2-induced="" increases="" in="" mda="" levels="" in="" zebrafish="" larvae="" (figure="" 6c,=""><0.05 versus="" ho2-induced="" group).="" furthermore,="" gsh-px="" activity="" was="" reversed="" by="" pc's="" (4,8,="" and="" 16="" μg/ml）="" treatment="" （figure=""><0.05 versus="" h2o2-treated="" group）.="" additionally,="" pcs（8="" and="" 16="" μg/ml）increased="" h2o2-induced="" reductions="" in="" cat="" and="" sod="" activities（figure="" 6e,f,p=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Figura 6. Efeitos de PCs no estresse oxidativo em larvas de peixe-zebra tratadas com H2O2-. (a) Fotomicrografias de fluorescência representativas de larvas de peixe-zebra; (b) Os níveis de ROS foram medidos por meio de software de imagem; (c) níveis de MDA; (d) atividade de GSH-Px; (e) atividade de CAT; (f) atividade de SOD. Os dados são expressos como a média ± SD. Todos os experimentos foram realizados três vezes. Os valores com letras diferentes acima são significativamente diferentes (p < 0,05,="" anova="">

2.7.Efeitos de PCs em Caminhos Nrf2/ARE em H2O2-Laroae Zebrafish Tratados

Os efeitos protetores do tratamento com PCs em larvas de peixe-zebra tratadas com H2O2- sugeriram que as vias Nrf2/ARE podem estar envolvidas. Os níveis de expressão de Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC e GCLM (Figura 7a-e,p<0.05 versus="" h,="" o,-induced="" group)were="" up-regulated="" following="" pcs(16="" ug/ml)="" treatment="" compared="" to="" levels="" after="" h2o,="" treatment="">

Figure 7. Effects of PCs on the Nrf2/ARE pathway in H>Larvas de peixe-zebra tratadas com O. (a) níveis de Nrf2; (b) níveis de GCLC; (c) níveis de GCLM; (d) HO-1 níveis; (e) níveis de NQO1. Os dados são expressos como média±DP. Valores com letras diferentes acima são significativamente diferentes (p<0.05, one-way="" anova="">

Este artigo foi extraído de Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules