Natalenamidas A–C, tripeptídeos cíclicos do Actinomadura Sp. associado a térmitas. RB99

Abstrato:

Nos últimos anos, as investigações sobre a bioquímica de bactérias associadas a insetos aumentaram. Quando combinados com processos de desreplicação analítica, esses estudos fornecem uma estratégia poderosa para identificar compostos estruturalmente e/ou biologicamente novos. Peptídeos cíclicos não sintetizados ribossomalmente possuem amplo espectro de bioatividade com alto potencial medicinal.

Aqui, relatamos a descoberta de três novos tripeptídeos cíclicos: natalenamidas A–C (compostos 1–3). Esses compostos foram identificados a partir do caldo de cultura do fungo Actinomadura sp. RB99 usando um método de desreplicação baseado em cromatografia líquida (LC)/ultravioleta (UV)/espectrometria de massa (MS). As estruturas químicas dos novos compostos (1–3) foram estabelecidas pela análise de métodos espectroscópicos abrangentes, incluindo magnético nuclear unidimensional (1H e 13C) e bidimensional (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC). espectroscopia de ressonância (NMR), juntamente com dados de espectrometria de massa de ionização por eletrospray de alta resolução (HR-ESIMS). As configurações absolutas dos novos compostos foram elucidadas usando a análise de Marfey. Por meio de vários testes de bioatividade para os tripeptídeos, descobrimos que o composto 3 exibiu efeitos inibitórios significativos na produção de melanina induzida por 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). O efeito do composto 3 foi semelhante ao do ácido kójico, um composto amplamente utilizado como material cosmético com efeito de clareamento da pele.

A pele clara, lisa e delicada sempre foi o objetivo perseguido pelas mulheres orientais. A pesquisa e o desenvolvimento de agentes clareadores para produtos de cuidados com a pele baseiam-se principalmente na inibição da atividade da tirosinase.

Compostos contendo anéis de benzeno ou estruturas hidroxila fenólicas têm potenciais efeitos de branqueamento, como o agente de branqueamento comumente usado arbutina, que pode exercer efeitos de branqueamento inibindo a atividade da tirosinase.

E descobrimos que a Cistanche deserticola tem um efeito clareador. O principal ingrediente ativo da Cistanche deserticola, glicosídeos feniletanóides, é um tipo de composto glicosídico natural. Estudos descobriram que os glicosídeos feniletanóides podem inibir a atividade da tirosinase e a produção de melanina nos melanócitos epidérmicos humanos e têm um efeito clareador. eficácia do agente.

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Palavras-chave:

cupim cultivador de fungos; Actinomadura sp.; tripeptídeos; natalenamidas A–C; efeitos de clareamento da pele.

1. Introdução

A análise química de simbiontes bacterianos protetores de insetos agrícolas tem atraído muita atenção entre os químicos de produtos naturais nos últimos anos [1-5]. Usando processos de desreplicação baseados em ressonância magnética nuclear (NMR)/espectrometria de massa (MS) de última geração e bioensaios ecologicamente relevantes, uma quantidade impressionante de produtos naturais estruturalmente intrigantes, incluindo vários peptídeos cíclicos sintetizados não ribossomalmente, foram descobertos de simbiontes microbianos [6]. Os exemplos mais proeminentes incluem o antifúngico dentigerumicina, um depsipeptídeo cíclico isolado de Pseudonocardia sp associado a formigas produtoras de fungos. [7], e as germinicinas A–C, depsipeptídeos cíclicos contendo ácido piperázico identificados em Pseudonocardia sp. [8].

Os peptídeos cíclicos demonstraram exibir uma ampla gama de atividades biológicas, promovendo várias abordagens sintéticas para essas estruturas farmacologicamente promissoras [9-12]. Mais de 40 medicamentos de peptídeos cíclicos são atualmente comercializados e amplamente utilizados em ambientes clínicos, e aproximadamente um novo medicamento de peptídeos cíclicos entra no mercado a cada ano, em média [13].

Como parte de nosso esforço contínuo para identificar metabólitos secundários estruturalmente novos e/ou bioativos de micróbios associados a cupins [14-17], nos concentramos no Actinomadura sp. RB99, isolado do cupim cultivador de fungos, Macrotermes natalensis. Nossa estratégia de desreplicação baseada em cromatografia líquida (LC)/ultravioleta (UV)/espectrometria de massa (MS) produziu produtos naturais bioativos potencialmente novos. Neste estudo, relatamos o isolamento e a identificação química de três novos tripeptídeos cíclicos, natalenamida A–C (compostos 1–3, Figura 1), usando um método de desreplicação baseado em LC/UV/MS, bem como suas avaliações biológicas para citotoxicidade , atividades anti-inflamatórias e de clareamento da pele.

2. Resultados e Discussão

2.1. Isolamento baseado em cromatografia líquida (LC)/ultravioleta (UV)/espectrometria de massa (MS) dos compostos 1–3

Actinomadura sp. O RB99 foi isolado da superfície de um cupim operário (M. natalensis). A análise filogenética de uma sequência quase completa de ácido ribonucléico ribossômico 16S (rRNA) sugere que a cepa RB99 pertence ao gênero Actinomadura, com o vizinho mais próximo Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. A análise subseqüente baseada em LC/UV/MS de extratos de cultura enriquecida revelou um conjunto de características de absorção de UV com picos de íons moleculares únicos contendo átomos de nitrogênio.

Para identificar os respectivos metabólitos e investigar sua atividade, fermentação em larga escala usando condições de crescimento otimizadas (100 placas de ágar de 2 L de ágar ISP2, pH 6, 10 dias a 30 ◦C) e um procedimento estabelecido de processamento e pré-purificação foram aplicado [17]. O fracionamento subsequente guiado por LC-UV/MS e a cromatografia líquida semipreparativa de alta eficiência (HPLC) repetitiva resultaram no isolamento de três metabólitos com um padrão único de NMR/MS. Realizamos estudos de crescimento e mídia usando sal diferente (NaCl, KBr 1–3 por cento) e composições de mídia (ISP1-6 mídia) para imitar o ambiente natural e estimular a produção de metabólitos, o que também levou à presença dos três novos metabólitos (ver Figura Complementar S19).

2.2. Elucidação Estrutural dos Compostos

A Natalenamida A (1) foi adquirida como um pó amorfo. A fórmula molecular de 1 foi determinada como sendo C19H25N3O5 a partir do íon molecular aduzido por sódio a m/z 398,1691 [M mais Na] mais (calculado para C19H25N3O5Na, 398,1692) usando espectrometria de massa de ionização por eletropulverização de alta resolução no modo de íons positivos (HR- ESIMS) dados. O espectro infravermelho (IR) mostrou uma forte banda de absorção em 1670 cm−1, sugerindo a presença de grupos amida na molécula. A análise detalhada dos dados de 1H NMR de 1 (Tabela 1) indicou os sinais típicos de um esqueleto de peptídeo, exibindo dois sinais de metil (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29 }} Hz, H-3) e 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), três sinais de metileno (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) e 3,20 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), quatro sinais de metino (δH 2,02 (1H , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6) e 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)) e cinco prótons aromáticos sobrepostos (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H-14/18) e 7,24 (2H, m, H-15/17)).

O espectro 13C NMR (Tabela 1), com a ajuda dos espectros HSQC e HMBC, mostrou um total de 19 ressonâncias de carbono responsáveis ​​por dois sinais de metil (δC 18,9 e 19,9), três sinais de metileno (δC 27.0, 30.6 e 38,8), nove sinais de metino (δC 32,1, 55,6, 58,0, 60,4, 127,8, 129,5 (×2) e 130,6 (×2)), incluindo cinco carbonos aromáticos, um carbono olefínico sinal (δC 138,8) e quatro sinais de carbono carbonílico (δC 173,2, 173,3, 174,8 e 181,3). Combinado com os dados espectroscópicos acima, a inspeção detalhada de NMR bidimensional (2D) (experimentos 1H-1H COSY, HSQC e HMBC) revelou a presença de três aminoácidos em 1: glutamato (Glu), fenilalanina ( Phe) e valina (Val) (Figura 2). A conectividade desses aminoácidos foi determinada pelas correlações HMBC de H-1/C-5 e C-19, H-11/C-10 e C{ {50}} e H-6/C-5 e C-10 (Figura 2).

Para identificar a configuração absoluta de 1, o método de Marfey foi aplicado para determinar a estereoquímica dos múltiplos -H (C-1, C-6 e C-11). Os hidrolisados ​​ácidos de 1 e aminoácidos padrão (L/D-Glu, Phe e Val) foram derivados com 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (L-FDAA). Sucessivamente, a mistura derivada de 1 e os aminoácidos padrão foram analisados ​​por LC/MS para examinar seu tempo de retenção. As configurações absolutas das frações Glu, Phe e Val foram todas determinadas como formas L, com base nos tempos de retenção dos derivados L-FDAA de 1 em comparação com os dos aminoácidos padrão. Assim, a estrutura de 1 foi elucidada como o tripeptídeo cíclico mostrado na Figura 1.

A Natalenamida B (2) foi isolada como um pó amorfo. Sua fórmula molecular (C20H27N3O5) foi deduzida a partir de picos de íons moleculares aduzidos de hidrogênio e sódio em 390,2032 [M mais H] mais (calculado para C20H28N3O5, 390,2029) e 412,1849 [M mais Na] mais (calculado para C20H27N3O5Na, 412,1848), respectivamente. Comparado com a fórmula molecular e os dados espectrais de NMR de 1, o composto 2 parecia ter um grupo CH2 adicional no esqueleto peptídico. O escrutínio abrangente dos espectros unidimensionais (1D) (1H e 13C NMR) e 2D NMR (1H– 1H COSY, TOCSY, HSQC e HMBBC) de 2 revelou a existência de três resíduos de aminoácidos: Glu, Phe e Leu (leucina). A sequência desses aminoácidos foi construída com base nas correlações HMBC de H-1/C-6 e C-20, H-12/C-11 e C -20 e H-7/C-6 e C-11 (Figura 2). Para determinar a configuração absoluta de 2, a derivatização dos resíduos Glu, Phe e Leu com L-FDAA foi realizada e depois analisada por LC/MS. Nos dados de LC/MS, L-Glu, L-Phe e L-Leu foram detectados comparando os tempos de retenção para os derivados L-FDAA de 2 com os dos aminoácidos padrão. Assim, a estrutura química de 2 foi estabelecida como o tripeptídeo cíclico mostrado na Figura 1.

Os dados HR-ESIMS de modo positivo da natalenamida C (3) exibiram íons moleculares aduzidos de hidrogênio e sódio em 424,1870 [M mais H] mais (calculado para C23H26N3O5, 424,1872) e 446,1694 [M mais Na] mais (calculado para C23H25N3O5Na, 424.1692). Isso sugeriu que sua fórmula molecular era C23H25N3O5. Uma análise detalhada dos espectros de RMN 1D e 2D de 3 indicou que sua estrutura química era semelhante à de 2, exceto que Leu foi substituído por Phe em 3. A conectividade dos três aminoácidos identificados em 3 foi verificada usando as correlações HMBC de H-1/C-9 e C-23, H-15/C-14 e C-23, e H-10/ C-9 e C-14 (Figura 2). Aplicando o método de Marfey ao composto 3, as configurações absolutas dos múltiplos -H (C-1, C-10 e C-15) foram elucidadas como sendo um L-Glu e dois L -Phe metades. Consequentemente, a estrutura completa de 3 foi determinada conforme mostrado na Figura 1.

As natalenamidas A–C são peptídeos tricíclicos, presumivelmente de origem não ribossômica. Atualmente, vários tripeptídeos cíclicos bioativos têm sido caracterizados como produtos naturais: trippeptídeos cíclicos de membros 17- citotóxicos (por exemplo, OF4949 I–IV) isolados de Penicillium rugulose [18]; esclerotomias antifúngicas A−K, identificadas a partir do caldo de fermentação de bactérias halotolerantes [10]; e o antiproliferativo psicrófilo E, isolado de uma cultura mista de duas cepas de fungos derivados de algas marinhas do gênero Aspergillus [19].

2.3. Atividades Biológicas dos Compostos 1-3

Como foi relatado que os peptídeos cíclicos exibem uma ampla gama de atividades biológicas, os efeitos biológicos dos tripeptídeos cíclicos isolados ({{0}}) foram avaliados usando três bioatividades. A citotoxicidade dos compostos 1-3 foi investigada contra quatro linhas celulares de câncer (células de câncer de mama MCE7, células de câncer cervical HeLa, células de câncer de pulmão humano A549 e células de câncer de fígado HepG2) em diferentes concentrações (0, 6,25 , 12,5, 25, 50 e 100 uM). O Composto 1 não afetou a viabilidade celular das células MCF-7, HeLa ou A549. No entanto, o tratamento de células HepG2 com 100 M de composto 1 diminuiu a viabilidade celular para 78,5 mais 3,2 por cento (Figura 3). O Composto 2 reduziu a viabilidade celular das células HeLa e A549 para 82,9  2,1 por cento e 73,5=3,0 por cento, respectivamente, mas não afetou a viabilidade de MCF-7 ou Células HepG2 (Figura 3). O composto 3 não afetou a viabilidade de nenhuma das linhagens celulares (Figura 3).

Em seguida, macrófagos RAW264.7 foram utilizados para investigar os efeitos anti-inflamatórios dos compostos isolados. Para eliminar erros na produção de NO causados ​​pela alteração das taxas de sobrevivência celular, foram examinadas as concentrações não tóxicas de cada composto. Conforme mostrado na Figura 4, os compostos 1–3 tiveram poucos efeitos citotóxicos em células RAW264.7 (Figura 4A–C) e não exerceram efeitos inibitórios na produção de NO em células RAW264.7 estimuladas por lipopolissacarídeo (LPS) (Figura 4D–F) .

Os efeitos inibitórios dos compostos 1–3 no conteúdo de melanina nas células B16F10 foram examinados como evidência de suas atividades de clareamento da pele (Figura 5). Como as alterações na viabilidade celular causam erros na produção e medição de melanina, examinamos primeiro os efeitos dos compostos 1–3 na sobrevivência das células B16F10. Os compostos 1–3 não exerceram efeitos citotóxicos nas células B16F10 em nenhuma das concentrações utilizadas (Figura 5A–C). Em seguida, avaliamos os efeitos inibitórios dos compostos na produção de melanina induzida por 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) em células B16F10 (Figura 5D–F). O IBMX, um conhecido estimulador da melanogênese, induz um aumento significativo na produção de melanina após um único tratamento em células de melanoma. Entre os compostos avaliados, o composto 3 (a 5-100 µM) exibiu efeitos inibitórios significativos na síntese de melanina mediada por IBMX de maneira dependente da dose. O ácido kójico, nosso controle positivo, tem sido amplamente utilizado como material cosmético com efeitos de clareamento da pele [20]. O efeito inibitório do composto 3 na produção de melanina induzida por IBMX foi semelhante ao do ácido kójico (Figura 5F), sugerindo que o composto 3 funciona como um potente inibidor da produção de melanina induzida por IBMX em células de melanoma B16F10.

Além disso, o composto 3 foi contaminado com um pequeno número de impurezas, que foram determinadas como análogos de ácidos graxos pela interpretação dos dados espectroscópicos de NMR e análise LC/MS (Materiais Suplementares, Figuras S11–S15 e S23). Para identificar a atividade das impurezas, experimentos adicionais com os análogos de ácidos graxos foram conduzidos para seus efeitos inibitórios na produção de melanina induzida por IBMX em células B16F10, que revelaram que os compostos testados não tiveram efeito de clareamento (Materiais Suplementares, Figura S24). Assim, embora não possamos excluir que as impurezas no composto 3 sejam responsáveis ​​pelo efeito inibitório na produção de melanina induzida por IBMX, isso parece improvável.

3. Materiais e Métodos

3.1. Procedimentos Experimentais Gerais

Os espectros infravermelhos foram adquiridos em um espectrômetro Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, EUA). Os espectros de ionização por electrospray e HR-ESIMS foram medidos em um espectrômetro de massa SI-2/LCQ DecaXP (LC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Os espectros de NMR, incluindo experimentos 1H-1H COSY, HSQC e HMBC, foram realizados usando um espectrômetro Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, EUA) operando a 800 MHz (1H) e 200 MHz (13C), com deslocamentos químicos dados em ppm (δ). A HPLC preparativa utilizou uma bomba Waters 1525 Binary HPLC com Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, EUA). Sílica gel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, EUA) e sílica gel RP-C18 (230–400 mesh, Merck, foram usadas para cromatografia em coluna. HPLC semipreparativa usou um Shimadzu Prominence HPLC System com SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultravioleta-visível (UV-Vis) Detectores (Shimadzu, Tóquio, Japão). As análises LC/MS foram realizadas em um sistema Agilent 1200 Series HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) equipado com um detector de arranjo de diodos e um espectrômetro de massa ESI Série 6130 com um Kinetex analítico (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Placas F254 de sílica gel pré-revestidas da Merck e placas RP-18 F254s foram usadas para Cromatografia em camada (TLC) As manchas foram detectadas em TLC sob luz UV ou por aquecimento após pulverização com uma solução de anisaldeído-ácido sulfúrico.

3.2. Material Microbiano

Actinomadura sp. RB99 foi isolado da superfície de um cupim operário do gênero M. natalensis, (colônia Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) em 2 de janeiro{ {13}}10. O biomaterial foi colocado em sacos plásticos limpos e processado um dia após a coleta. Os cupins foram lavados em água deionizada estéril e as bactérias foram isoladas por plaqueamento das suspensões resultantes em meio de baixo teor de nutrientes com quitina (por litro: 4 g de quitina, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 e 20 g de ágar) [21]. Isolados com morfologia semelhante a Actinobacteria foram transferidos para ágar ISP2 (por litro: 10 g de extrato de malte, 4 g de extrato de levedura, 4 g de glicose e 20 g de ágar) e subcultivados até a obtenção de isolados puros.

3.3. Extração de DNA e Amplificação da Reação em Cadeia da Polimerase

Actinomadura sp. O RB99 foi cultivado em meio líquido rico em nutrientes ISP2 por cinco a sete dias a 30 ◦C. As células foram coletadas e o DNA genômico foi extraído usando o kit de purificação de DNA genômico GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) seguindo as instruções do fabricante com as seguintes alterações: (a) o tratamento com lisozima foi estendido para 40 min e (b) o tratamento com proteinase K foi estendido para 40 min. O DNA foi quantificado fotometricamente usando um espectrômetro Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Para estudos filogenéticos, o gene 16S rRNA foi amplificado usando o conjunto de primers, 1492R/27F. Cada reação de amplificação foi preparada em um volume de reação final de 25 µL contendo 7,25 µL de água destilada, 5 µL de tampão HF, 5 µL de cada iniciador (2,5 µM), {{10}},5 µL de dNTPs (10 µM), 0,25 µL de Phusion High-Fidelity DNA polimerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) e 2 µL de DNA extraído (molde). A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada nas seguintes condições: 98 ◦C por 38 s; 32 ciclos de 98 ◦ por 30 s, 52 ◦C por 45 s, 72 ◦C por 1 min 20 s; e uma extensão final de 72 ◦C por 8 min. O produto de PCR foi visualizado por eletroforese em gel de agarose e as reações de PCR foram purificadas usando um kit de purificação de PCR (Thermo Scientific). Os fragmentos de DNA foram sequenciados no GATC (Konstanz, Alemanha).

3.4. Sequenciamento e Identificação de Espécies

As sequências foram avaliadas quanto à pureza e incompatibilidades usando o BioEdit [22]. As sequências direta e reversa obtidas para cada cepa foram montadas com BioEdit e testadas para quimeras usando DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). As sequências resultantes foram depositadas no GenBank (número de acesso: KY558684). Análises de blastos com sequências 16S rRNA quase completas (1368 pb) foram realizadas usando o banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (sequências de referência de RNA). Os resultados indicaram que a cepa RB99 é um membro do gênero Actinomadura. As sequências dos primeiros 10 hits foram baixadas do banco de dados NCBI e alinhadas com a sequência 16S rRNA de Actinomadura sp. RB99 utilizando o serviço de alinhamento de sequências Sina [23]. Duas árvores filogenéticas diferentes foram reconstruídas com algoritmos de junção de vizinhos ou máxima verossimilhança usando o software MEGA versão 7.0.26 [24–26]. O modelo de distância evolutiva de Tamura e Nei foi usado para gerar matrizes de distância evolutiva para os algoritmos de máxima verossimilhança e junção de vizinhos, com a exclusão de lacunas completas e dados ausentes [27]. Para o algoritmo de máxima verossimilhança, foi utilizada distribuição gama discreta (mais G), e o modelo de variação de taxa permitiu que alguns locais fossem evolutivamente invariáveis ​​(mais I). Para o algoritmo de junção de vizinhos, a variação da taxa entre os sites foi modelada com uma distribuição gama ( mais G). Os valores de confiança dos nós foram avaliados por análises bootstrap com base em 1000 etapas de reamostragem [28].

3.5. Extração e Isolamento

Actinomadura sp. RB99 foi cultivado em 50 mL de caldo ISP2 por sete dias a 30 ◦C (pré-cultura) e usado para inocular 100 placas de ágar ISP2. As placas foram incubadas por 10 dias a 30 ◦C, cortadas em pequenos pedaços, consolidadas e imersas durante a noite em MeOH. A fase MeOH foi filtrada e evaporada sob pressão reduzida. O extrato de MeOH (20 g) foi dissolvido em água destilada (700 mL) e depois particionado com solvente com EtOAc (700 mL) três vezes, gerando 1,1 g de resíduo. A fração solúvel em EtOAc (1,1 g) do extrato de MeOH foi carregada em uma coluna de sílica gel (230-400 mesh) para cromatografia e eluída com um sistema solvente gradiente de CH2Cl2-MeOH (100:1 a 1: 1, v/v). Isso forneceu seis frações (A–F), que foram submetidas à análise baseada em LC-UV/MS. A análise de desreplicação usando uma biblioteca espectral UV interna sugeriu a existência de análogos peptídicos menores na fração E. Estes exibiram um padrão UV simples em torno de 220 nm e picos de íons de fórmula molecular única contendo átomos de nitrogênio. A fração polar E (233 mg) foi fracionada por HPLC preparativa de fase reversa (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm di, 5 µm, Torrance, CA, EUA) usando CH3CN/H2O (1:9 a 9:1, v /v, sistema de gradiente, taxa de fluxo: 5 mL/min) para produzir cinco subfrações (E1–E5). A subfração E2 (27 mg) foi purificada por HPLC semipreparativa de fase reversa (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) com 33 por cento de MeOH/H2O (sistema isocrático, taxa de fluxo: 2 mL/min ) para produzir o composto 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Os compostos 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) e 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) foram isolados da subfração E3 (15 mg) por fase reversa semipreparativa HPLC eluindo 43 por cento MeOH/H2O (sistema isocrático, taxa de fluxo: 2 mL/min).

3.5.1. Natalenamida A (1)

3.5.2. Natalenamida B (2)

3.5.3. Natalenamida C (3)

3.6. Hidrólise Ácida dos Compostos 1-3

Uma quantidade totalizando 0,4 mg de cada composto (1–3) foi hidrolisada com 6 N HCl (500 µL) por 1 h a 110 ◦C. Após o resfriamento à temperatura ambiente, os hidrolisados ​​de 1-3 foram evaporados para remover vestígios de HCl. Água destilada (500 µL) foi adicionada às misturas de hidrolisados ​​e então evaporada para remover vestígios de HCl; este processo foi realizado três vezes.

3.7. Determinação da Configuração Absoluta de Aminoácidos em 1–3

As misturas de hidrolisado (1–3), bem como os aminoácidos padrão (L/D-Leu, Glu, Phe e Val), foram dissolvidos em 1 N NaHCO3 (100 µL) e depois tratados com 50 µL de L-FDAA (10 mg/mL em acetona). Sucessivamente, cada hidrolisado foi aquecido por 10 min a 80 ◦C. Cada mistura foi extinta com HCl 2 N (50 µL) e concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em 300 µL de MeOH. Cada alíquota (5 µL) adquirida das misturas de hidrolisado foi injetada diretamente no LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, vazão de 0,3 mL/min), e uma varredura completa em positivo e negativo modos iônicos (faixa de varredura de m/z 100 a 1000) foi aplicado para identificar os tempos de retenção dos aminoácidos derivados de L-FDAA.

A fase móvel, consistindo de ácido fórmico em água destilada ({{0}}.1 por cento v/v) (A) e acetonitrila (B), foi transportada com um sistema de solvente gradiente da seguinte forma: 20–40 por cento (B) por 10 min, 100 por cento (B) isocrático por 5 min e, em seguida, 20 por cento (B) isocrático por 5 min, para conduzir um procedimento de lavagem pós-corrida para a coluna. Os tempos de retenção dos aminoácidos derivados de L-FDAA usados ​​como padrões foram de 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M mais H] mais ), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M mais H] mais ), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M mais H] mais ), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M mais H] mais ), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M mais H] mais ), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M mais H] mais ), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M mais H] mais ) e 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M mais H] mais). Os tempos de retenção dos hidrolisados ​​derivatizados de 1–3 foram L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) e L-Val (22,5 min) de 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) e L-Leu (25,6 min) de 2; e L-Glu (16,9 min) e L-Phe (25,7 min) de 3.

3.8. Ensaios citotóxicos usando células cancerígenas

As células MCF7, HeLa e A549 foram adquiridas da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). As células HepG2 foram adquiridas no Korean Cell Line Bank (Seul, Coréia). As células MCF7 foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal. As células HeLa e A549 foram cultivadas em meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, EUA) suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal. As células HepG2 foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal. As condições de cultivo foram mantidas a 37 ◦C em atmosfera umidificada contendo 5 por cento de CO2. A citotoxicidade foi testada nestas quatro linhagens de células humanas (MCF7, HeLa, A549 e HepG2) usando o kit de ensaio de viabilidade celular EZ-CyTox (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão). Resumidamente, 5 × 103 células/poço foram semeadas em 96-placas de poços. Após 24 h, as células foram tratadas com compostos nas concentrações indicadas. Após 72 h de incubação, foi utilizado o kit de ensaio de viabilidade celular EZ-CyTox. Após 2 h de incubação, a absorbância foi medida em 450 nm com referência em 620 nm. A viabilidade celular foi calculada como uma porcentagem do controle.

3.9. Atividade anti-inflamatória

A linha celular de macrófagos de camundongo RAW264.7 foi adquirida da American Type Culture Collection. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina e incubadas a 37 ◦C em uma atmosfera umidificada com 5 por cento de CO2. A viabilidade celular foi medida usando o kit de detecção de viabilidade celular Ez-Cytox. As células foram incubadas em placas de poços 96- a uma concentração de 2500 células por poço durante 24 h e tratadas com as concentrações indicadas dos compostos 1–3 durante 24 h. Em seguida, os reagentes Ez-Cytox foram adicionados a cada poço. A densidade óptica em 450 nm foi medida após 1 h usando um leitor de microplacas (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, EUA) para estimar a viabilidade celular. Em um experimento separado, as células RAW264.7 foram incubadas em 96-placas de poços a uma concentração de 30,000 células por poço por 24 h. Após jejum de soro por 12 h, as células foram pré-tratadas com os compostos 1–3 por 1 h e depois estimuladas com 1 µg/mL de LPS por 24 h. A absorbância do meio de cultura em uma reação de Griess foi medida a 540 nm usando um leitor de microplacas PowerWave XS para estimar o nível de NO.

3.10. Medição do conteúdo de melanina

A linha celular de melanoma de camundongo, B16F10, foi adquirida da American Type Culture Collection. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10 por cento de FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina e incubadas a 37 ◦C em uma atmosfera umidificada com 5 por cento de CO2. As células B16F10 foram incubadas em placas de cultura de 6 cm a 250,000 células por poço em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 µg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina por 24 h. As células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e então estimuladas por IBMX e incubadas com diferentes concentrações de compostos 1-3 ou ácido kójico (controle positivo) em meio RPMI isento de vermelho de fenol suplementado com 10 por cento de FBS, 100 unidades /mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina por 24 h e 48 h. A absorbância do meio de cultura foi medida a 405 nm usando um leitor de microplacas PowerWave XS para estimar o conteúdo de melanina. Os resultados são expressos como variação de dobra em comparação com o controle (células não estimuladas por IBMX).

3.11. Análise estatística

Todos os dados incluindo viabilidade celular, NO e produções de melanina foram apresentados como valor médio e desvio padrão (DP). Todos os ensaios foram feitos em triplicata e foram repetidos pelo menos três vezes. Neste estudo, foram incluídos apenas alguns números de repetições de cada experimento celular, portanto, o método de análise não paramétrica foi adotado para análise estatística. O teste de Kruskall‐Wallis foi utilizado para a análise estatística de cada variável. O pacote estatístico SPSS foi usado para todas as análises (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS statistics versão 21, Boston, MA, EUA). A significância estatística foi considerada em um valor de p inferior a 0,05.

4. Conclusões

Nosso relatório fornece uma análise química de isolados microbianos de um cupim que cultiva fungos. Três novos tripeptídeos cíclicos, natalenamidas A–C (1–3), foram isolados e caracterizados estruturalmente a partir do caldo de cultura de Actinomadura sp. RB99 usando um método de desreplicação baseado em LC-UV/MS. Todos os compostos isolados foram avaliados quanto às atividades biológicas usando ensaios baseados em células. Os compostos 1 e 2 exibiram citotoxicidade fraca contra células HepG2 e HeLa/A549, respectivamente. Nenhum dos compostos isolados apresentou efeitos inibitórios significativos na produção de NO em células RAW264.7 estimuladas por LPS. O composto 3 exibiu efeitos inibitórios significativos na síntese de melanina mediada por IBMX de uma maneira dependente da dose. O efeito foi semelhante ao do ácido kójico, que é usado como material cosmético com efeitos de clareamento da pele.

Agradecimentos:

Somos profundamente gratos a Michael Thomas-Poulsen (Departamento de Biologia, Universidade de Copenhague, Dinamarca) por apoiar nosso trabalho de campo.

Conflitos de interesse:

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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Disponibilidade de amostra:

Amostras dos compostos não estão disponíveis nos autores.

For more information:1950477648nn@gmail.com