Complexos de Nano Proteína do Leite-Mucilagem: Caracterização e Efeito Anticancerígeno Parte 2

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3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais

A casca de Plantago ovata (subobjetivo) e o fruto maduro de Ziziphus Spina-Christi (Nabeq) foram adquiridos de Gizé, Egito; o concentrado de proteína do leite (MP, 81,3 por cento de proteína) foi adquirido da empresa Fonterra (Auckland, Nova Zelândia). A caseína e as proteínas do soro no MPC estão em grande parte em sua forma nativa e semelhante, micelar, àquelas encontradas no leite. Todos os produtos químicos utilizados eram de pureza analítica.

3.2.Preparação de Mucilagem de Casca de Isabgol (IHM) e Mucilagem de Nabeg (NabM)

A mucilagem de casca de Isabgol (IHM) e a mucilagem de Nabeq (NabM) foram preparadas de acordo com o método descrito por El-Maksoud et al. [5]. Resumidamente, uma suspensão de casca de isabgol foi preparada dissolvendo 1,2 g em 100 mL de água destilada e purificada com solução de acetona. O gel resultante foi armazenado na geladeira (4-5 graus) até ser usado.

Para NabM, os frutos maduros de Nabeq foram cuidadosamente lavados com água da torneira para remover a sujeira. Os frutos frescos foram separados das sementes e misturados com água destilada na proporção de 1:10(p/v) após serem cortados em pequenos pedaços. A mistura foi misturada usando um liquidificador de laboratório (Toshiba Mixie, Japão) e deixada em repouso por 12 h na geladeira.

O extrato mucilaginoso foi então centrifugado a 2000 rpm por 30 min e filtrado em musselina. A mucilagem viscosa solúvel resultante foi precipitada com acetona. A mucilagem bruta obtida foi armazenada em geladeira até o uso.

Para fins analíticos, a mucilagem foi seca em estufa de ar a 40 graus e moída com moinho de bolas MM400(Retsch, Alemanha). A composição química do pó de mucilagem de casca de psyllium (PHMP) e pó de mucilagem de Nabeq (NabMP) foi medida. Os teores de umidade, proteína, gordura, cinzas, fibra bruta e carboidratos totais foram 8,49, 0,34,0,21,2,13,1,53 e 87,44% para PHMP e 9,18,4,72,2,05,2,69,1,70 e 78,26% para NabMP , respectivamente. O pó resultante foi armazenado a uma temperatura fria (4-5 graus) até análise posterior.

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3.3. Preparação de Complexos de Proteína do Leite-Mucilagem (MPMC)

Os complexos de proteína do leite (MP) com IHM e NabM foram preparados de acordo com Morr et al.com algumas modificações [44]. O concentrado de proteína do leite foi reconstituído em água destilada (10 por cento). O colóide de proteína de leite resultante foi misturado com IHM e NabM em uma proporção de 1:3 (o/o). O pH da mistura foi ajustado para 1{13}} e deixado em repouso por 10 min. Depois disso, o pH foi reduzido para 3,5 usando HCl 0,1 N e deixado por mais 10 min. O pH foi então ajustado para pH 4,6 usando NaOH 0,5 M para coletar MPMC por filtração em um papel de filtro: MP, bem como o MPMC resultante, foram secos por liofilização a -45 grau C por 24h usando o liofilizador Novalyphe-NL500 , Savant Instruments, Holbrook, NY, EUA.

3.4. Características físico-químicas e funcionais

3.4.1. Medição de pH

O pH dos produtos resultantes em solução a 10 por cento foi medido usando um medidor de pH calibrado (HANNA, HI 902 m, Alemanha).

3.4.2.Determinação da Densidade A granel (BD), Densidade Derivada (TD) e Índice de Carr

O pó de MPMC foi despejado em um cilindro de medição de 50 mL até 25 mL, correspondente ao volume não aproveitado, e então bata 5-10 vezes até que nenhuma alteração adicional do volume do pó seja observada correspondente ao volume extraído.

A densidade aparente, a densidade rosqueada e o índice de Carr foram determinados aplicando as seguintes equações [45]:

(1)BD=massa/volume inexplorado

(2)TD=massa/volume de derivação

(3) Índice de Carr ( por cento )= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Índice de Absorção de Água (WAI) e Índice de Solubilidade em Água (WSD)

Os índices de solubilidade em água e absorção de água de MP e MPMC foram examinados de acordo com o método descrito por Yagc e Gogus com algumas modificações [46]. As amostras (0,5 g) foram dispersas em 10 mL de água destilada a 25 graus em um tubo de centrífuga. Após repouso por 30 min, com inversão do tubo a cada 5 min, as amostras foram centrifugadas a 3500 rpm por 15 min. O filtrado foi transferido para uma placa de alumínio e seco durante 3 horas a 105 graus. O peso do gel restante foi registrado e WSI e WAI foram determinados da seguinte forma:

(4)WAI(g/g)= Ganho de peso do gel/Peso seco da amostra

(5)% WSI=Peso de sólidos secos no sobrenadante ×100/Peso seco da amostra

3.4.4. Digestibilidade da Proteína do Leite

A digestibilidade da proteína foi determinada de acordo com Abd El-Ghany et al. [47]. Resumidamente, as amostras de MP e MPMC foram dispersas em água destilada na concentração de 6,38 mg/mL e o pH foi ajustado para 8.0. Um mililitro de solução estoque de enzima recém-preparada (1,6 mg/mL de tripsina, 3,1 mg/mL de quimotripsina e 1,3 mg/mL de ER amino peptidase1

(ERAP1) foi misturado com suspensão de proteína a 37 graus. O pH foi registrado após 10 minutos e a atividade enzimática foi determinada usando caseína como referência. A seguinte equação foi usada para calcular a digestibilidade da proteína [47]:

(6) porcentagem de digestibilidade=210.46-18.10 (pH)

3.5. Frações Fenólicas de PHM e NabM

Os compostos fenólicos de amostras de mucilagem utilizando análise de HPLC foram conduzidos pelo protocolo descrito por Elsayed et al. [48]. Resumidamente, o extrato de mucilagem foi analisado usando um sistema de HPLC da série Agilent 1260 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA). A separação foi passada usando a coluna C18 (100 mm×4,6 mm id,5 um). A fase móvel continha (A) água 0,2 por cento de H3PO4, (B) metanol e (C) acetonitrila a uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min. O gradiente de eluição foi conforme o esquema a seguir: 0-11 min (96 por cento A., 2 por cento B);11-13 min (50 por cento A, 25 por cento B);13-17min (40 por cento A, 30 por cento B);17-20,5 min (50 por cento B, 50 por cento C); e 20,5-30 min (96 por cento A,2 por cento B). O comprimento de onda de detecção (UV detector, 284 nm) foi ajustado em 284 nm. O tamanho da injeção foi de 20 μL e a temperatura da coluna foi mantida em 30 graus. Os compostos eram conhecidos comparando seu tempo de retenção com os de padrões autênticos. As curvas de calibração foram utilizadas para avaliar as quantidades de composto.

3.6. Teor Total de Fenólicos e Flavonóides de MP e MPMC

O teor de polifenóis foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteu com algumas modificações [5]. Em resumo, 2,8 mL de água milli-Q contendo 10 mg de MP ou MPMC foram misturados com 2 mL de carbonato de sódio a 2% e 0,1 mL de reagente Folin-Ciocalteau a 50%. Após 30 min de incubação à temperatura ambiente, a absorbância da mistura de reação foi medida a 750 nm contra água desionizada como um branco usando um espectrofotômetro (Hitachi, Modelo 100-20). O ácido gálico (GA) foi usado como um composto fenólico padrão e uma curva padrão de sete pontos (0-200 mg/L) foi construída. Os resultados foram expressos em miligramas de equivalentes de ácido gálico por grama de proteína (GAE/g).

Flavonóideso teor foi determinado usando o método do cloreto de alumínio como descrito anteriormente por Abedelmaksoud et al. com algumas modificações [5]. Em resumo, 2,8 mL de água mili-Q contendo 10 mg de MP ou MPMC foi misturado com 0,1 mL de hexahidrato de cloreto de alumínio a 10 por cento e 0,1 mL de acetato de potássio 1 M. Após incubação à temperatura ambiente durante 40 min, a absorvância da mistura reaccional foi medida a 415 nm contra água desionizada como um branco. A quercetina foi usada como padrão utilizando uma curva padrão de sete pontos (0-50 mg/L). O conteúdo total de flavonóides foi expresso em miligramas de quercetina equivalentes (QE/g).

3.7. Atividade antioxidante de MP e MPMC

A capacidade total de eliminação de radicais livres de MP e MPMC foi avaliada usando três diferentes ensaios antioxidantes: Stable 2,2-difenil-1-picrilhidrazil(DPPH), Azino-bis(3-etilbenzotiazolina{{5 }}ácido sulfônico (ABTS) e radicais hidroxila (HS) como descrito anteriormente por El-Maksoud et al.[5].

3.8. Perfil de aminoácidos de MP e MPMC

As amostras de proteína foram hidrolisadas com ácido usando HCl 6 N de acordo com Peksa et al. [49. Um analisador de aminoácidos automatizado (AAA 400, INGOs Ltd.) foi usado para determinar os aminoácidos.

3.9. Propriedades reológicas

As amostras foram preparadas conforme descrito por Barnes [50] com algumas modificações. A viscosidade da solução de 2,5 por cento (p/p) em pH 7 foi determinada a 25±1 grau usando um viscosímetro Brookfield (DV-II plus Pro, Rheocalc Software, Alemanha). A tensão （σ） e a viscosidade （n） foram plotadas em função da taxa de cisalhamento. O índice de consistência (K) e o índice de comportamento do fluxo (n) do modelo de lei de potência foram calculados:

O valor de n é igual a 1 para fluidos newtonianos e varia de 0 a 1 para fluidos de afinamento por cisalhamento e maior que 1 para fluidos de espessamento por cisalhamento [51].

3.10. Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC)

As propriedades térmicas de MP e MPMC foram medidas usando um calorímetro de varredura diferencial (PerkinElmer, EUA). Amostras (4-6 mg) foram colocadas em uma placa de alumínio e seladas. Cada panela foi então aquecida a 350 graus com um fluxo de gás nitrogênio seco a 20 mL min-I a uma taxa de aquecimento de 10 graus min-1. A partir do pico endotérmico do termograma DSC, foram estimadas a temperatura de início da desnaturação, a temperatura máxima de transição e o ponto de degradação [52]. O valor da entalpia de transição (AH) da área sob o pico endotérmico na curva DSC foi determinado, e o recipiente de alumínio vazio foi usado como referência.

3.11. Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)

Espectros infravermelhos entre 600 e 3500 cm-I foram medidos a 25 graus usando um espectrofotômetro FTIR (QFA Flex, EUA) pelo método de reflexão total atenuada usando uma resolução de 4 cm-I e adquirindo 10 varreduras por segundo.

3.12. Microscopia Eletrônica de Transmissão

A microestrutura de MP e MPMC foi visualizada usando um microscópio eletrônico de transmissão (JEOL, JEM 1400 Flash, Japão) a 80 kV. O estágio criogênico no método de coloração negativa foi aplicado [53].

3.13. Estudos Biológicos sobre MP e MPMC

3.13.1. Atividade anticancerígena in vitro

Todas as linhas celulares utilizadas nesta experiência foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Duas linhagens de células cancerosas humanas foram usadas neste ensaio: adenocarcinoma mamário (MCF{{0}}, ATCCHTB-22TM) e carcinoma hepatocelular (HepG2, ATCC4 HB-8065TM). As linhas celulares de fibroblastos de pele não cancerosa BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) e MCF de mama epitelial-12F(ATCC CRL-10782TM) também foram testadas para comparação. As linhas celulares foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM/high glucose, HyCloneTM, EUA) suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino (FBS, Gibco, Brasil), 100 U/mL de penicilina, 100 ug/mL de estreptomicina e 25 ng/ mL de anfotericina B (Sigma, Oakville, ON, Canadá) e cultivadas a 37 graus com 5 por cento de CO, em uma incubadora umidificada. O meio de cultura foi substituído a cada dois dias por um meio fresco. Quando as células atingiram 70 por cento de confluência, elas foram separadas usando 0,25 por cento de Tripsina-EDTA(1X) Gibco, Canadá, e transferidas para um novo frasco de cultura. Após a segunda passagem, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em uma 96-placa de poço a uma concentração de 2×10* células/poço. Após 24 h de incubação, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS e depois tratadas com 200 μL de meio de cultura contendo diferentes concentrações de amostras de proteína (1, 5,10 e 20 ug/mL). Doxorrubicina HCl (4 ug/mL) foi usado como controle positivo, enquanto as células tratadas com meio não suplementado foram tomadas como controle negativo. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas e oanticâncera atividade das amostras foi determinada usando um ensaio de absorção de vermelho neutro de acordo com Repetto et al. [54]. Resumidamente, após o período de incubação, o meio foi substituído por 150 µL de corante vermelho neutro (100 mg/mL) dissolvido em meio sem soro, e as células foram incubadas a 37°C por 3 h. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e 150 μL de meio de eluição （EtOH/AcCOOH,50∶1） foi adicionado seguido de agitação suave por 10 min para garantir a dissolução completa. A absorbância foi medida a 540 nm usando um leitor de placas de microtitulação (BioTek, 96 Well Plates, ELX808, EUA).

onde Ac é a absorbância do controle e As é a absorbância da amostra. A porcentagem de morte celular apresentada como citotoxicidade ( por cento ) e a concentração que mata 50 por cento das células (IC50) foi calculada para cada amostra.

3.13.2. Determinação do Nível de Proteínas p53, Bax, Caspase-3 e Bcl-2

Os níveis celulares dos principais marcadores de proteína de apoptose foram determinados após 24 h pós-tratamento com o ICso de MP e MPMC. Resumidamente, as células Hep G-2, MCF-7, Bj-1 e MCF-12F foram semeadas em 5× 10* células/poço em 6-poço pratos. Após 24 h de incubação com as amostras a 37 graus, as células foram coletadas e lisadas e centrifugadas a 10,{12}}rpm por 20 min a 4 graus. A concentração de proteína foi quantificada no sobrenadante por ensaio de Bradford [55]. A atividade da caspase-3 foi analisada usando um kit de ensaio colorimétrico (Abcam, ab39401) de acordo com as instruções do fabricante [56]. Em resumo, 10 mg de proteína foram adicionados a 50 uL de substrato de Caspase e o volume final foi ajustado para 200 μL usando o tampão de reação a 37 graus, e a mistura foi incubada por 1 h no escuro seguido pela medição de Caspase{{24} } concentração a 405 nm.

O nível de marcador pró-apoptótico p53, X(Bax associado) e linfoma de células B de marcador antiapoptótico-2(Bcl-2) foram determinados no lisado celular usando Ensaio Imunoadsorvente Enzimático Simples ELISA de acordo com as instruções do fabricante (ab207225, ab119506 e ab199080; Abcam, EUA), respectivamente [57,58].

3.13.3. Danos ao DNA Induzidos pela Proteção contra Estresse Oxidativo

O ensaio de dano ao DNA foi realizado conforme descrito anteriormente por Leba et al. [59] com ligeira modificação. Em resumo, 3 μL de plasmídeo inibidor de Ribonuclease RNH1（NM_203387）Human Tagged ORF Clone 10 ug/μL foram misturados com reagente de Fenton（5 mM de H2O2 e 0,3 mM de FeSO4 e 0,6 mM de EDTA）, e o volume final foi ajustado para 25 μL usando tampão fosfato (H2POA, 8,3 mM, pH 7,4). Em seguida, a solução foi incubada por 20 minutos a 37 graus. Para avaliar a capacidade de proteção antioxidante de MP e MPMC contra danos no DNA induzidos pelo reagente de Fenton, 5 ug/mL de MP/NabM, MP/IHM e MP foram adicionados antes da incubação. DNA de plasmídeo RNH1（3 μL, 10 ug/μL） foi usado como controle de proteção de DNA.

3.13.4. Ensaio de dano de DNA genômico baseado em PCR

O gene Homo sapiens metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) foi amplificado usando PCR de sangue genômico previamente extraído de amostras de sangue saudáveis ​​usando um kit padrão de extração de DNA [60]. O DNA foi incubado por 10 min com ou sem reagente de Fenton suplementado com MP ou MPMC. Um fragmento 198-bp foi amplificado usando iniciadores 5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' e 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3' reverso. Utilizando 50ng de DNA tratado, a amplificação por PCR foi realizada seguindo o termociclador seguinte (94 graus por 5 min, seguido por 25 ciclos de desnaturação, os 30s a 94 graus; hibridização, 30s a 60 graus; e extensão, 30s a 72 graus) para 25 ciclos e 1 ciclo final de extensão a 72 graus por 5min. As amostras de reação de PCR foram aplicadas para eletroforese em gel de agarose (2 por cento).

3.13.5. Perfil de Expressão Gênica por RT-qPCR

As análises da expressão gênica dos principais genes marcadores pró e antiapoptóticos foram conduzidas com células HepG-2, MCF-7, Bj-1 e MCF-12F expostas a IC50 obtidas dados (Tabela 3) por 72 h. Resumidamente, o RNA total foi extraído usando o Total RNA Purification Kit (QIAGEN., Thorold, ON, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante. cDNA

a síntese foi realizada como descrito anteriormente por Aboul-Sound et al. [61]. Os programas de amplificação e a especificidade do amplicon de PCR foram realizados e avaliados pelo uso de um termociclador Rotor-Gene O 5-Plex HRM (Qiagen, Alemanha) com Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Alemanha), conforme documentado anteriormente seguindo protocolos padrão [61]. Os seguintes primers foram usados: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); Linfoma de células B 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011);Bcl-2-como proteína Hs_BAX_1_SG QuantiTect Primer Assay ( QT00031192); e 18S rDNA house-keeping (HK) gene Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay(QT00199367). O programa de ciclo térmico de PCR e a análise de expressão gênica para determinar a mudança de dobra em relação ao gene 18S foram essencialmente realizados como relatado anteriormente [61].

3.14. Análise Estatística

Os resultados obtidos foram expressos em média ± desvio padrão. As estatísticas foram obtidas usando o software SPSS 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, EUA). O teste de múltiplas faixas de Duncan foi usado para determinar as diferenças significativas entre todas as amostras, e as diferenças foram consideradas significativas em p<>

4. Conclusões

Em conclusão, este estudo revelou que a mistura de proteína do leite compolissacarídeosatravés da diferenciação do pH da solução é uma técnica adequada para complexação. Os complexos de mucilagem de proteína do leite (MPMC) resultantes têm níveis fenólicos eflavonóidesteores de proteína do leite (MP). Os resultados de DSC mostraram que a complexação de MP com polissacarídeos aumentou significativamente a estabilidade térmica com uma mudança na temperatura de desnaturação. Análises de FTIR foram realizadas para identificar os grupos funcionais e o comportamento de fluxo dos complexos preparados foi investigado. O WSI e WAI da proteína do leite foram aumentados pela complexação com NabM ou IHM. TEM foi usado para visualizar a microestrutura dos complexos preparados. Por outro lado, espera-se que os complexos de proteína do leite resultantes com mucilagem de casca de isabgol (HM) ou mucilagem de Nabeq (NabM) superem as proteínas do leite nativas no efeito antioxidante e anticancerígeno. Em resumo, o MPMC expressou propriedades anticancerígenas únicas contra linhas celulares modelo de câncer de mama e carcinoma hepático (MCF7 e HEPG2, respectivamente) conforme comprovado por um ensaio de absorção de vermelho neutro.

MPMC melhorou tantoantioxidantee atividade antiproliferação. As caspases são proteínas reguladoras chave que estão implicadas na indução de apoptose. A regulação positiva da proteína caspase 3 e transcritos de mRNA (Figura 9A, B) controlam outras proteínas na via da apoptose, que é caracterizada pelo colapso da membrana mitocondrial com liberação de citocromo c induzida por Bax e ativação da caspase 9 levando ao subsequente envolvimento de caspase 3. A regulação positiva de Casp3, p53 e Bax, juntamente com a redução da expressão de Bcl-2 revelou que MPMC induziu a indução de apoptose, onde a regulação positiva de p53 estimulará a expressão de Bax, que, por sua vez, induzirá o citocromo c lançamento, seguido por caspase-9 e-3 ativação. Além disso, Bcl-2 é conhecido por inibir a liberação de citocromo c. Em nosso estudo, a regulação negativa de Bcl{15}} induzida por MPMC mostrou facilitar a liberação de citocromo c induzida por Bax sem oposição e a apoptose subsequente.

O efeito anticancerígeno dos complexos proteína-polissacarídeos fornece esclarecimento adicional sobre a aplicabilidade desses complexos para serem usados ​​no desenvolvimento de terapias contra o câncer acessíveis e eficientes com efeitos colaterais mínimos.