Proteína 75 regulada por mortalina/glicose promove a resistência à cisplatina do câncer gástrico

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Abstrato

O tratamento medicamentoso com platina é uma das estratégias quimioterápicas mais predominantes para pacientes com câncer gástrico (CG). No entanto, o efeito terapêutico é menos do que satisfatório, em grande parte devido à resistência adquirida às drogas de platina. Portanto, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes pode melhorar muito a eficácia terapêutica do GC. Neste estudo, nosso objetivo foi investigar as funções/mecanismos relacionados à quimio-resistência e o significado clínico da proteína 75 regulada por glicose (GRP75) no GC. Aqui, nossos dados mostraram que, em comparação com as células SGC7901, a expressão de GRP75 foi marcadamente maior na resistência à cisplatina (células (SGC7901 *). A eliminação de GRP75 aboliu a manutenção do potencial de membrana mitocondrial (MP) e inibiu o fator nuclear eritróide{{ 10}}fator 2 relacionado (NRF2), fosfatidilinositol 3 quinase/proteína quinase B (Pl3K/AKT), fator 1a induzível por hipóxia (HIF-1a) e c-myc, que resultou no bloqueio da ativação de Esses processos atenuaram as habilidades de anti-oxidação/apoptose e alteraram a reprogramação metabólica nas células SGC7901", levando à ressensibilização dessas células à cisplatina. No entanto, a superexpressão de GRP75 nas células SGC7901 causou os efeitos opostos. Um modelo de xenoenxertos confirmaram os resultados acima mencionados. Em pacientes do GC que receberam quimioterapia com platina e uma meta-análise, um alto nível de GRP75 foi positivamente associado a características agressivas e prognóstico ruim, incluindo, mas não limitado a gastrite cânceres intestinais, e foi um preditor independente para sobrevida global. Coletivamente, nosso estudo indicou que o GRP75 estava envolvido na resistência à cisplatina do GC e que o GRP75 poderia ser um potencial alvo terapêutico para restaurar a resposta à droga em células resistentes à platina e uma ferramenta de prognóstico aditivo útil para orientar o manejo clínico de pacientes com GC.

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Introdução

O câncer gástrico (CG) foi a primeira maior incidência e a segunda maior mortalidade de cânceres do sistema digestivo na China. Os tratamentos atuais para o GC avançado eram a cirurgia combinada com quimioterapia sistêmica, mas a taxa de sobrevida em longo prazo foi menos do que satisfatória devido à alta recorrência pós-cirúrgica2. Quimioterapia GC3. No entanto, a resistência adquirida às drogas sempre ocorreu após vários ciclos de tratamento à base de platina e indica um mau prognóstico.cistanchPortanto, iluminar os mecanismos potenciais e identificar as novas estratégias terapêuticas para superar a resistência às drogas de platina em pacientes com GC eram urgentemente essenciais.

Cistanche pode anti-envelhecimento

A proteína 75 regulada por glicose (GRP75) era a chaperona molecular induzível por estresse que pertencia à família de proteínas de choque térmico4. A superexpressão de GRP75 foi intimamente associada à progressão tumoral em vários cânceres humanos5-7. Aqui, explorando uma meta-análise, descobrimos que um alto nível de GRP75 indicava um prognóstico significativamente ruim em vários cânceres do sistema digestivo (câncer colorretal, colangiocarcinoma e câncer de pâncreas). Para resistência a drogas, a inibição do GRP75 reverteu a resistência à cisplatina e à doxorrubicina no carcinoma hepatocelular e câncer de ovário". tumores positivos tiveram um prognóstico pior em comparação com tumores GRP75 negativos no GC com função p53 normal. No entanto, p53 foi um dos genes mais frequentemente mutados no GC (afetando mais de 50 por cento dos pacientes)l2-15. Então, nós levantamos a hipótese que além da repressão clássica da atividade da p53, o GRP75 pode estar envolvido na indução/manutenção da resistência à platina no GC através do emprego de uma forma independente de p{24}}.

Neste estudo, a maior expressão de GRP75 contribuiu para a resistência à cisplatina em células SGC7901 e em um modelo de xenoenxertos. Mecanicamente, o GRP75 induziu/manteve a resistência à cisplatina através da regulação das habilidades anti-oxidação/apoptótica e propriedades de reprogramação metabólica.cistache AustráliaNos pacientes do GC, a superexpressão de GRP75 contribuiu para as características agressivas e mau prognóstico. Nossos resultados indicaram que o GRP75 promoveu a resistência à cisplatina no GC e pode ser um biomarcador para predizer a resposta ao tratamento com drogas de platina.benefícios do cistacheO direcionamento do GRP75 pode fornecer uma nova compreensão da quimioterapia sistêmica de GC.

Resultados

Efeitos do GRP75 na resistência à cisplatina em GC Ensaios de viabilidade celular foram empregados para verificar a resistência das células SGC7901~, os Ipsos (uM) da cisplatina para células SGC7901 e SGC7901CR foram: 5,518 vs. 72,46 (Fig. 1A). Com base em bancos de dados KM-Plotter, o aumento da expressão de GRP75 indicou um prognóstico ruim (Fig.1B). Além disso, expressões de GRP75 marcadamente aumentadas em células SGC7901CR em comparação com suas células SGC7901 parentais (Fig. 1C), sugerindo que GRP75 pode contribuir para a resistência à cisplatina. Para verificar esta hipótese, as células SGC7901~ foram transfectadas por siRNA scramble ou GRP75, e os IC50s (uM) de cisplatina para células SGC7901CK transfectadas com siRNA codificado ou GRP75 foram: 50,83 vs.20.86, respectivamente (Fig. . 1D). Em contraste,

a superexpressão de GRP75 por transfecção dos plasmídeos GRP75 em células SGC7901 mostrou que os IC50s da cisplatina para células SGC7901 transfectadas com plasmídeos de embaralhamento ou GRP75 eram 3,825 vs. 6,98 (Fig. 1E). Coletivamente, esses resultados revelaram que o GRP75 desempenhou papéis cruciais na manutenção/indução da resistência à cisplatina no GC, mas os mecanismos continuaram sendo investigados.

Mecanismos potenciais subjacentes ao GRP75 causaram resistência à cisplatina

Baixamos os conjuntos de dados de microarray GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) e GSE14209 (tecidos, resistentes à cisplatina vs. sensíveis à cisplatina) do GEO, então realizamos o processo GO-Biological e a análise de enriquecimento KEGG-Pathway com base em DAVID e os 10 principais os resultados foram mostrados na Fig.2A-D. As diferenças essenciais dos processos biológicos entre as células SGC7901C* e as células SGC7901 incluíram oxidação-redução, processo apoptótico (Fig. 2A), análise de enriquecimento KEGG-Pathway descobriu que os conjuntos de DEGs estavam intimamente correlacionados com vias metabólicas e fosfatidilinositol 3 quinase/proteína quinase B (PI3K/AKT) (Fig. 2B). A resposta à droga foi incluída nas diferenças essenciais dos processos biológicos entre tecidos tumorais resistentes à cisplatina e sensíveis à cisplatina e a via metabólica também foi o elo central na análise de enriquecimento da via KEGG (Fig.2C, D). Além disso, uma rede de 60 proteínas que interagiram significativamente com o GRP75 foi construída usando o banco de dados String, então a análise KEGG-Pathway mostrou que as vias metabólicas desempenhavam um papel importante entre o GRP75 e seus interagentes (Fig. 2E). Com base nesses resultados, presumimos que a anti-oxidação/apoptose e a reprogramação metabólica podem promover a sobrevivência e o crescimento do GC, o que leva à resistência à cisplatina. No entanto, os mecanismos de participação do GRP75 na regulação precisavam de mais estudos (Fig. 2F).

Efeitos do GRP75 na anti-oxidação e anti-apoptose Aqui, o nível de ROS intracelular foi elevado nas células SGC7901CR em comparação com suas contrapartes parentais (Fig. 3A), sugerindo que as células SGC7901Ck foram expostas a condições de estresse oxidativo relativamente mais altas. Um estudo anterior revelou que o GRP75 estava envolvido na estabilização de MMP, uma importante fonte de geração de ROS. Aqui, o knockdown de GRP75 aboliu a manutenção de MMP em células SGC7901CK induzida por cisplatina, e a superexpressão de GRP75 teve o efeito oposto em células SGC7901 (Fig. 3B).colesterol cistancheEm seguida, validamos a relação entre GRP75 e anti-oxidação e anti-apoptose. Conforme mostrado na Fig. 3C, o knockdown de GRP75 diminuiu o nível de fator nuclear eritróide-2-fator 2 relacionado (NRF2) e seus genes alvo a jusante (HO-1 e NQO-1) em SGC7901 ~ células e a superexpressão de GRP75 mostraram o efeito oposto em células SGC7901. Além disso, o knockdown de GRP75 ou NRF2 em células SGC7901CR aumentou ainda mais as gerações de ROS intracelulares, apoptose (Fig. 3D) e atividades de caspase-3 (Fig. S1 suplementar) induzidas por cisplatina. Em contraste, a superexpressão de GRP75 em células SGC7901 atenuou significativamente as gerações de ROS induzidas por cisplatina, apoptose celular (Fig. 3E) e atividades de caspase-3 (Fig. S1 suplementar). Estes resultados revelaram que a resistência à cisplatina mantida/induzida pelo GRP75 pode ser através da indução de anti-oxidação e anti-apoptose em células de GC.

Efeitos do GRP75 na reprogramação metabólica Em seguida, investigamos ainda como o GRP75 induziu a alteração da reprogramação metabólica. Evidências crescentes mostraram que o metabolismo das células tumorais não era uma alteração anormal em uma única via metabólica, mas uma reprogramação de toda a rede metabólica celular17. Muitos oncogenes clássicos ou vias de sinalização estavam envolvidos direta ou indiretamente na reprogramação metabólica, como PI3K/AKT, fator induzível por hipóxia la (HIF-la), c-myc e assim por diante"819. Portanto, verificamos se o GRP75 era envolvidos na reprogramação metabólica de células GC. Conforme mostrado na Fig. 4A, observamos níveis elevados de p-AKT, HIF-la e c-myc em células SGC7901CR em comparação com suas células SGC7901 parentais. Além disso, em células SGC7901CR, knockdown de O GRP75 diminuiu os níveis de proteína p-AKT, HIF-la e c-Myc induzidos por cisplatina e seus alvos a jusante relacionados à glicólise (HK2: hexoquinase 2; PDK1: piruvato desidrogenase quinase l; e LDHA: cadeia de lactato desidrogenase A). Pelo contrário, a superexpressão de GRP75 em células SGC7901 mostrou o efeito oposto (Fig. 4B, C). Além disso, o knockdown de GRP75 ou AKT em células SGC7901CR mostrou uma diminuição significativa na captação de glicose e viabilidade/crescimento celular induzido por cisplatina; no entanto, superexpressão de GRP75 em células SGC7901 marcadamente aumentou a capacidade de captação de glicose e viabilidade/crescimento celular causado pela cisplatina (Fig. 4D-F). Coletivamente, esses dados indicaram que a resistência à cisplatina mantida/induzida pelo GRP75 nas células do GC pode ser através da participação na reprogramação metabólica mediada por p-AKT, HIF-la e c-myc.

Confirmação dos dados in vitro em um modelo de xenoenxerto Em seguida, investigamos a potencial relevância clínica do GRP75 in vivo. Os dados do xenoenxerto indicaram que o tratamento com cisplatina sozinha ou o knockdown de GRP75 sozinho poderia inibir o crescimento do tumor; no entanto, o tratamento com cisplatina combinado com o knockdown de GRP75 facilitou significativamente a inibição do crescimento tumoral induzida por cisplatina (Fig. 5A). Além disso, os ensaios de IHC e qPCR mostraram que cisplatina mais GRP75 siRNA diminuiu significativamente as expressões de Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT e alvos a jusante em comparação com o tratamento com cisplatina sozinho, mas aumentou a apoptose (conforme determinado pela coloração de TUNEL, Fig. 5B , C). Coletivamente, esses resultados indicaram que, através da regulação das habilidades de anti-oxidação/anti-apoptose e reprogramação metabólica, o GRP75 estimulou a sobrevivência e o crescimento in vivo que, por sua vez, levaram à resistência à cisplatina do GC.

Identificação de GRP75 como um fator promotor de câncer característico e o significado clínico de GRP75 no GC

Em seguida, avaliamos a expressão de GRP75 em seções consecutivas de amostras de GC. Conforme mostrado na Fig. 6A, em comparação com tecidos gástricos não tumorais adjacentes, uma elevação considerável da expressão de GRP75 foi observada em tecidos de GC. A superexpressão de GRP75 foi demonstrada em tecidos de GC por pontuação de intensidade de IHC (Fig. 6B). A coloração mais forte para GRP75 também foi observada com o aumento da classificação TNM do estágio de tumores malignos (Fig. 6C, D). Em seguida, dividimos esses 116 espécimes de GC em dois grupos ("GRP75 baixo" vs." GRP75 alto", de acordo com a intensidade de IHC, Fig. 6E). Os diâmetros transversais dos tumores no grupo "GRP75 alto" foram significativamente maiores do que aqueles no grupo "GRP75 baixo" (Fig. 6F). Nós validamos ainda mais o prognóstico clínico do GRP75 no GC. A análise de sobrevida de Kaplan-Meier também mostrou que os pacientes com GC no grupo "GRP75 alto" tiveram uma sobrevida global pior do que aqueles no grupo "GRP75 baixo" (Fig. 6G).

A análise multivariada identificou que GRP75 foi um preditor independente de sobrevida global (Tabela 1).efeitos colaterais de cistanche deserticola,Em resumo, esses resultados sugeriram que o GRP75 teve um papel característico na progressão do GC, resistência à cisplatina e prognóstico ruim. Meta-análise do alto nível de GRP75 com o prognóstico Diagrama de fluxo da busca e seleção da literatura e meta-análise foram mostrados na Fig. S2 suplementar. O modelo de efeito aleatório e o modelo de efeito fixo foram usados ​​para calcular e analisar o valor da FC, ambos mostraram que altos níveis de GRP75 estão significativamente associados a maus resultados dos pacientes. O HR agrupado foi de 1,91 (IC 95 por cento 1,62 a 2,25), com heterogeneidade (I'=0.0 por cento, p =0,559)(Fig. 7A). Em seguida, fizemos uma análise de subgrupo, que mostrou que o nível de expressão de GRP75 em câncer gastrointestinal (HR agrupado foi de 1,99,95 por cento CI 1,64 a 2,43), tem uma relação significativa com mau prognóstico de sobrevida. Certamente, resultados semelhantes também foram encontrados em outros tumores (HR agrupado foi de 1,74,95 por cento CI 1,29 a 2,33) (Fig.7B). Ambos

O gráfico de funil de Begg e o teste de Egger foram usados ​​para avaliar o possível viés de publicação dos estudos incluídos. Na análise da associação entre GRP75 e OS, o valor-p do teste de Begg e do teste de Egger foram 0.076 e 0,024, respectivamente (Fig.7C e D). No entanto, o teste de Egger tem maior sensibilidade na avaliação do viés de publicação. Assim, o método trim and fill foi utilizado para tornar os nossos resultados mais credíveis. Conforme mostrado na Fig. 7E, a FC ajustada no modelo de efeito fixo foi de 1,785 (IC de 95% 1,530 a 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Discussão

Neste estudo, utilizamos um dos agentes quimioterápicos de primeira linha para pacientes com GC, as drogas de platina. Classicamente, drogas de platina podem se ligar covalentemente à guanina na cadeia de DNA e, assim, bloquear a replicação e transcrição do DNA2. No entanto, devido à resistência aos medicamentos e efeitos colaterais indesejáveis, a identificação de novas estratégias terapêuticas para reverter a resistência em pacientes com GC era urgentemente essencial. Além disso, os pacientes do GC desenvolveram resistência a drogas após receberem vários cursos de cisplatina, e nossos resultados mostraram que as células SGC7901~ exibiram resistência significativa à cisplatina em comparação com as células SGC7901.

GRP75 (mortalina/mot-2/HSPA9) desempenhou um papel fundamental na regulação do início e progressão de cânceres humanos-7. Mais recentemente, ficou claro que o GRP75 também tinha um papel crítico na resistência à quimioterapia ". Além do GRP75, outras proteínas de choque térmico desempenharam papéis críticos na resistência à cisplatina através de PI3K/AKT/NF-KB e outras vias21-24 . No entanto, o mecanismo molecular da resistência ao GRP75 e à cisplatina foi raramente relatado. Aqui, nosso estudo revelou que o GRP75 promoveu habilidades de anti-oxidação/apoptose e alterou a reprogramação metabólica, levando à resistência à cisplatina nas células do GC. Também descobrimos que o GRP75 foi regulado positivamente em SGC7901~ e em amostras de tecido de pacientes, e foi correlacionado com resistência a drogas, pró-sobrevivência, crescimento e resultados ruins. Enquanto isso, a análise multivariada identificou que GRP75 era um preditor independente para sobrevida global. Além disso, a meta-análise indicou que um alto nível de GRP75 mostrou prognóstico ruim, incluindo, mas não limitado a GC, o que foi altamente consistente com nossa pesquisa. Todos os resultados acima validaram que o direcionamento de GRP75 poderia espera-se que se torne uma nova abordagem para reverter a resistência à cisplatina e melhorar o prognóstico de pacientes com GC.

Sob condições fisiológicas, as células foram inevitavelmente expostas a EROs de fatores externos e do metabolismo aeróbio intracelular. Como uma faca de dois gumes, ROS apropriados eram importantes moléculas sinalizadoras que regulam a função normal das células, enquanto ROS excessivos levavam à apoptose. Portanto, existia um sistema preciso de regulação antioxidante no organismo para manter o equilíbrio redox e os procedimentos apoptóticos 20. No entanto, diferentemente das condições fisiológicas, os níveis de ROS dos tumores eram geralmente significativamente maiores do que os controles normais da mesma origem tecidual, o que determinava a existência de um sistema antioxidante em células tumorais, especialmente para células tumorais resistentes a drogas27-29. Nossos resultados confirmaram que as células SGC7901CR exibiram um nível relativamente maior de ROS em comparação com as células SGC7901 e que, GRP75 elevou as capacidades de anti-oxidação/apoptose. As células tumorais tinham uma longa história de anormalidades metabólicas. Já na década de 1930, Otto Warburg descobriu que as células tumorais preferem a glicólise. Mesmo sob condições de oxigênio suficiente, as células tumorais ainda mantinham altas taxas de glicólise para geração de ATP. Esse padrão metabólico anormal foi denominado "efeito Warburg"3031. As mudanças metabólicas lideradas pelo efeito Warburg foram recentemente referidas como reprogramação metabólica, e os estudos dessas mudanças forneceram uma compreensão mais profunda do metabolismo das células do GC. Foi demonstrado que as células do GC e as células normais apresentam diferenças metabólicas não apenas no metabolismo da glicose, mas também no metabolismo de lipídios e aminoácidos³2-35. ligações mantendo o crescimento celular, eventualmente levando à resistência à cisplatina GC.

Como mencionamos, oncogenes clássicos e vias de sinalização como PI3K/AKT, HIF-la e c-myc estavam direta ou indiretamente envolvidos na reprogramação metabólica. A ativação da via PI3K/AKT em células tumorais aumentou muitas das atividades metabólicas. Primeiro, permitiu que as células absorvessem glicose, aminoácidos e outros nutrientes. Em segundo lugar, o AKT aumentou a glicólise e a produção de lactato por meio de seus efeitos na expressão gênica e na atividade enzimática e foi suficiente para induzir um efeito War-burg em células cancerígenas. Terceiro, a ativação desta via melhorou a biossíntese de macromoléculas e estimulou a expressão de genes lipogênicos e a síntese de lipídios'7. Além disso, GRP75-ativou AKT e proteínas quinases reguladas por sinal extracelular 1 e 2 inibiram mudanças conformacionais de Bax e apoptose 8. produção e secreção de ácido lático, armazenamento de glicogênio, catabolismo de glutamina³ e promover o acúmulo de triglicerídeos em gotículas lipídicas³. Mais recentemente, ficou claro que GRP75 poderia se ligar especificamente ao HIF-la e atingir a membrana mitocondrial externa, associada VDAC1 e HK2, que impediram a apoptose'. C-myc pode mediar a reprogramação metabólica de várias maneiras, e a reprogramação metabólica mediada por c-myc foi amplamente alcançada afetando as mitocôndrias. Por um lado, c-myc também promoveu a glicólise regulando diretamente a expressão de enzimas glicolíticas, incluindo LDHA, HK2 e PDK11938. glutamina pelas mitocôndrias em células tumorais. Este efeito é chamado de "glutaminólise". Além disso, a superexpressão de GRP75-reduziu a Ciclina-B1 e regula positivamente a Ciclina-D1 e c-myc para promover o crescimento de células de câncer de ovário*. Com base em nossos resultados atuais, fornecemos uma nova compreensão da resistência à cisplatina do GC através do GRP75 como um elo potencialmente importante na regulação das redes de reprogramação metabólica do tumor.

Conclusões

Em conclusão, demonstramos que a superexpressão de GRP75 pode promover a sobrevivência/crescimento em células do GC regulando a anti-oxidação/apoptose e redes de reprogramação metabólica, induzindo assim a resistência à cisplatina

Materiais e métodos

Células, reagentes e condições de cultura

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 por cento de pureza), foi adquirido da Sigma-Aldrich (Shanghai, China). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, EUA), suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino （FBS）, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina (Gibco) e incubadas em 5 por cento de CO2 a 37 graus. Para manutenção do fenótipo de resistência à cisplatina, as células SGC7901CR foram incubadas em um meio contendo cisplatina （5μM）.

Xenoenxertos e tratamentos

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Nanjing, e os animais foram tratados com humanidade e no que diz respeito ao alívio do sofrimento. Os camundongos nus BALB/c foram obtidos do SLRC Laboratory Animal Center (Xangai, China) e mantidos convencionalmente como descrevemos anteriormente*1. Para o estudo de xenoenxerto, células SGC7901CK de 2 × 10 graus em matrigel de 100 ul foram injetadas subcutaneamente nos flancos dos camundongos por 5 semanas. Para determinar os efeitos do GRP75 na resistência à cisplatina do GC, realizamos o ensaio de injeção intratumoral e intraperitoneal. Resumidamente, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (5 camundongos por grupo): (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK＋cisplatina e （4） GRP75 KD＋cisplatina. 100ul de siRNA (si-Con ou si-GRP75, 100nM) foram injeções intratumorais a cada 3 dias. Os grupos submetidos à terapia com cisplatina (5 mg/kg) receberam injeções intraperitoneais 3 vezes por semana e os demais grupos foram perfundidos com igual volume de solução salina. Os tumores foram medidos semanalmente e seus volumes foram calculados usando a fórmula: V=Y (largura2 comprimento). Após 5 semanas, os camundongos foram sacrificados e os tecidos tumorais foram removidos para investigação adicional.

Pacientes e amostras de tecido

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing e do Hospital Afiliado Changzhou No. 2 da Universidade Médica de Nanjing e os consentimentos informados por escrito dos participantes foram obtidos de cada paciente. Os dados clínico-patológicos foram listados na Tabela Complementar S1. O microarray de tecido foi construído pela Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Shanghai, China) como descrevemos anteriormente*

Transfecção celular

Para transfecção, scrambled e pcDNA-3.1-GRP75-Flag foram sintetizados pela General Biotech (Xangai, China); enquanto os siRNAs foram listados na Tabela Suplementar S2. As células foram transfectadas transitoriamente via reagente lipofectamina 3000 (Invitrogen, Carlsbad, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram plaqueadas em 6-placas de poços a uma densidade de células de 1 × 10 graus em meio RPMI 1640 contendo 10 por cento de FBS sem antibióticos. Após incubação por 24 h, as células foram transfectadas transitoriamente com 5 ng/ml mexidos ou GRP75-Flag, ou 20 nM de si-Con ou si-GRP75 por 12h. Após a transfecção, as células foram cultivadas em meio fresco suplementado com 10% de FBS por mais 24 h antes de serem usadas para outros experimentos.

Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) Os primers usados ​​foram listados na Tabela Suplementar S3. O isolamento de RNA total, a transcrição de RNA para cDNA e o desempenho de qRT-PCR com máquina Applied Biosystems 7300HT foram todos de acordo com nosso estudo anterior 2. A -actina foi amplificada para garantir a integridade do cDNA e normalizar a expressão. As alterações de dobra na expressão de cada gene foram calculadas por um método de ciclo de limiar comparativo (Ct) usando a fórmula 2-(4ACt)

Este artigo é extraído de Dai et al. Descoberta de morte celular (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w