Constituintes monoterpenos de Cistanche Tubulosa—Estruturas químicas de Kankanosides A—E e Kankanol—

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Haihui XIE, Toshio MORIKAWA, Hisashi MATSUDA, Seikou NAKAMURA, Osamu MURAOKA, andMasayuki YOSHIKAWA

Abstrato

Quatro novos glicosídeos iridóides, cancanosídeos A (1), B (2), C (3) e D (4), um iridóide clorado, kankanol (5), e um glicosídeo monoterpeno acíclico, kankanosídeo E (6), foram isolados a partir do extrato metanólico de caules secos de Cistanche tubulosa (SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) juntamente com 16 compostos conhecidos. As estruturas desses novos compostos (1-6) foram determinadas com base em evidências químicas e físico-químicas.

Palavras-chave:Cistanche tubulosa; cancanosídeo; cancanol; iridóide; monoterpeno; Orobanchaceae

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae)é uma planta parasita perene que cresce nas raízes das espécies Salvadora ou Calotropis, e distribuída no norte da África, Arábia e países asiáticos.1) Os caules desta planta (Kanka-nikujuyou em japonês) têm sido usados ​​tradicionalmente para tratar , lumbago e fraqueza corporal.2) Anteriormente, vários iridóides, monoterpenóides, feniletanóides e lignanas foram isolados de C. tubulosa chinesa e paquistanesa. 1,3–7) No decorrer de nossos estudos em série sobre constituintes bioativos de medicamentos naturais chineses,8–18) quatro novos glicosídeos iridóides, cancanosídeos A (1), B (2), C (3) e D (4 ), um iridóide clorado, kankanol (5), e um glicosídeo monoterpeno acíclico, kankanoside E (6), foram isolados do extrato metanólico deste fitoterápico juntamente com 16 compostos conhecidos, incluindo 12 monoterpenos (7-18). Este artigo trata do isolamento e elucidação da estrutura de novos constituintes monoterpenos (1-6).

Cistanche tubulosa

O extrato metanólico de caules secos deCistanche tubulosa(26,8 por cento deste medicamento fitoterápico) foi submetido a cromatografia em coluna de sílica gel de fase normal e de fase reversa e HPLC repetida para obter cancanosídeos A (1, 0.0{{10) }}54 por cento ), B(2, 0.030 por cento ), C (3, 0.00 27 por cento ) e D (4, {{40}}.0015 por cento ), kankanol (5, 0.0{ {66}}34 por cento ) e cancanosídeo E (6, 0.027 por cento ) junto com ácido mussaenosídico19) (7, 0.020 por cento ) , ácido geniposidico19) (8, 0,030 por cento), 8-ácido epilogânico7) (9, 0,033 por cento), glurosídeo19) (10, 0,14 por cento), antirretida20) (11, 0,0079 por cento), ajugol19) (12, 0,011 por cento), bartsioside19) (13, 0,21 por cento), 6-deoxicatalpol19) (14, 0,11 por cento), argyol21) (15, 0,0030 por cento), cistanina22,23) (16, 0,0040 por cento), cis taclorina22) ( 17, 0,0035 por cento), (2E,6Z)-8-bD-glucopiranosiloxi-2,6-dimetil-2,6-ácido octadienóico24) (18, 0,0028 por cento ), D manitol25) (4,19 p ercent ), uridine25) (0,0069 por cento ), (3R)-3-hidroxi-2- pirrolidinona26,27) (0,0020 por cento ), e (3R)-3-hidroxi-1-metil{ {97}}pirrolidinona27) (0,0059 por cento).

Estrutura do Kankanosídeo A (1) O Kankanosídeo A (1) foi obtido como um pó amorfo e exibiu uma rotação óptica negativa ([a]D 25 107,4 graus em MeOH). O espectro de IR de 1 mostrou uma banda de absorção em 1647 cm 1 atribuível à função de olefina, além de fortes bandas de absorção em 341{210}} e 1076 cm 1 sugestivas de uma fração de glicosídeo. No bombardeio de átomos rápidos de íons positivos e negativos (FAB)-MS de 1, picos de íons quasimoleculares foram observados em m/z 369 (M Na) e 345 (MH), e a análise FAB-MS de alta resolução revelou a fórmula de 1 para ser C16H26O8. A hidrólise ácida de 1 com ácido clorídrico 1,0 M (HCl) liberou D-glicose, que foi identificada por análise de HPLC usando um detector de rotação óptica.8,10—12,15—18) O 1 H- (CD3OD, Tabela 1) e Os espectros de 13C-NMR (Tabela 2) de 1, que foram atribuídos por vários experimentos de RMN,28) mostraram sinais atribuíveis a dois metils [d 1,31 (s, 10-H3), 1,51 (br s, {{47} }H3)], dois metilenos [d 1,49, 2,02 (ambos m, 6a- e 6b-H), 1,64, 1,67 (ambos m, 7b- e 7a-H)], dois metinos [d 2,21 (dd, J 2,7 , 9,5 Hz, 9-H), 2,71 (m, 5-H)], e um grupo a,b-insaturado acetal [d 5,33 (d, J 2,7 Hz, 1-H ), 5,95 (br s, 3-H)] juntamente com uma fração b-glucopiranosil [d 4,62 (d, J 7,9 Hz, 1 -H)]. Conforme mostrado na Fig. 1, o experimento de espectroscopia de correlação 1 H–1H (1 H–1 H COSY) em 1 indicou a presença de estruturas parciais escritas em negrito. No experimento de correlações de ligações múltiplas heteronucleares (HMBC) em 1, foram observadas correlações de longo alcance entre os seguintes prótons e carbonos (3-H, 1 -H e 1-C; 11- H3 e 3-C; 3-H, 5-H, 6-H2, 9-H, 11-H3 e 4- C ; 11-H3 e 5-C; 10-H3 e 7-C; 1-H, 7-H2, 9-H, 10-H3 e 8-C; 10-H3 e 9-C; 7-H2 e 10-C) conforme mostrado na Fig. 1. A hidrólise enzimática de 1 com b-glicosidase deu uma aglicona, cankagenina a (1a), conforme mostrado na Fig. 3. A comparação do espectro de RMN de 13C para 1 com aqueles para 1a revelou o deslocamento de glicosilação em torno da posição 1- em 1 [1: dC 94,1 (1-C), 134,6 (3-C), 53,3 (9-C); 1a: dC 92,9 (1-C), 135,3 (3-C), 54,7 (9-C)]. Assim, a conectividade da fração bD-glucopiranosil em 1 também foi esclarecida na posição 1-de 1a. Em seguida, a estereoestrutura relativa de 1 foi caracterizada pelo experimento de espectroscopia de aprimoramento nuclear Overhauser (NOESY), que mostrou correlações NOE entre os seguintes pares de prótons (1-H e 10-H3; 3-H e 11-H3; 5-H e 6b-H, 9-H; 6b-H e 7b-H; 7a-H e 10-H3; 7b-H e {{ 190}}H) como mostrado na Fig. 2. Finalmente, a configuração absoluta da posição 1-em 1 foi determinada pela aplicação da regra de mudança de glicosilação de 13C NMR de 1,1-dissacarídeo,29) que foi encontrada para aplicar aos compostos hemiacetal.30,31) A estereoestrutura da posição 1-em 1 foi confirmada para ser mantida em 1a por comparação da análise de 1 H-NMR incluindo o experimento NOESY. Os valores de desvio de glicosilação [Dd 1,2 ppm (1 -C) e 0,9 ppm (1- C), em piridina-d5] foram encontrados como sendo característicos da combinação R, Rhemiacetal, que correspondeu à estereoestrutura absoluta de 1 como mostrado na Fig. 3. Consequentemente, a configuração absoluta na posição 1- de 1 foi determinada como sendo a configuração S, e a estereoestrutura absoluta de 1 foi elucidada como mostrado.

Estruturas de Kankanosídeos B (2) e C (3) Kankanosídeos B (2) também foram isoladas como um pó amorfo com rotação óptica negativa ([a]D 26 118,7 graus em MeOH). O espectro IR de 2 mostrou bandas de absorção em 3410, 1647 e 1{{5{{80}}}}85 cm 1 atribuíveis às funções hidroxila, olefina e éter. A fórmula molecular C15H24O10 de 2 foi determinada pelos picos de íons quasimoleculares em FAB-MS de íons positivos e por FAB-MS de alta resolução. A hidrólise ácida de 2 com HCl 1,0 M liberou D-glicose, que foi identificada por análise de HPLC usando um detector de rotação óptica.8,10—12,15—18) O 1H- (CD3OD, Tabela 1) e 13C-NMR ( Tabela 2) espectros 28) de 2 mostraram sinais atribuíveis a dois metilenos [d 1,40 (DDD, J 5,2, 7,3, 13,5 Hz, 6a-H), 2,52 (DDD, J 7,0, 9,2, 13,5 Hz, 6b-H), 3,85 , 3,99 (ambos d, J 11,9 Hz, 10-H2)], quatro metinas [d 2,21 (dd, J 6,4, 8,6 Hz, 9-H), 2,83 (m, 5- H), 4,02 (dd, J 5,2, 7,0 Hz, 7-H), 5,49 (d, J 6,4 Hz, 1-H)], e um par de cisolefifina [d 4,95 (dd, J 4,0 , 6,1 Hz, 4-H), 6,22 (dd, J 1,8, 6,1 Hz, 3-H)], juntamente com uma fração b-glucopiranosil [d 4,72 (d, J 7,9 Hz, 1 - H)]. Os sinais de próton e carbono nos dados de 1 H- e 13C-NMR de 2 foram semelhantes aos de 6-deoxicatalpol (14), exceto pelos sinais devidos a 7- e 8- posições. Conforme mostrado na Fig. 1, o experimento 1 H–1 H COZY em 2 indicou a presença de estruturas parciais escritas em negrito e, no experimento HMBC, foram observadas correlações de longo alcance entre os seguintes pares de prótons e carbonos ({{ 122}}H, 1 -H e 1-C; 1-H e 3-C; 10-H2 e 7- C; 1-H , 7-H, 9-H, 10-H2 e 8-C; 7-H, 10-H2 e 9-C ; 7-H e 10-C). A estereoestrutura relativa de 2 foi caracterizada pelo experimento NOESY, que mostrou correlações NOE entre os seguintes pares de prótons (1-H e 10-H2; 3- H e 4-}H; 5-H e 6b-H, 9-H; 6b-H e 7-H; 7-H e 9-H) conforme mostrado na Fig. 2. Finalmente, o tratamento alcalino de 14 com 5 por cento de hidróxido de potássio aquoso (KOH) rendeu 2 e 19, 32) de modo que a estereoestrutura de 2 foi esclarecida.

Kankanosídeo C (3) foi isolado como um pó amorfo com rotação óptica negativa ([a]D 26 34.0 grau em MeOH). No FAB-MS de íon negativo de 3, um par de picos de íons isótopos quasimoleculares foram observados em m/z 399 e 401 (MH) . A fórmula molecular de 3 foi determinada como C15H25ClO10 por medição FAB-MS de alta resolução. A hidrólise ácida de 3 com HCl 1,0 M liberou D-glicose, que foi identificada por análise de HPLC usando um detector de rotação óptica.8,10—12,15—18) O 1H- (CD3OD, Tabela 1) e 13C-NMR ( A Tabela 2) espectros 28) de 3 mostrou sinais atribuíveis a três metilenos [d 1,70 (br dd, J ca. 3, 13 Hz, 4a-H), 2,70 (br dd, J ca. 6, 13 Hz, 4b-H) , 1,68 (br d, J ca. 13 Hz, 6a H), 2,44 (m, 6b-H), 4,01, 4,04 (ambos d, J 11,3 Hz, 10-H2)], cinco metinas [d 2,47 (dd, J 2,5, 7,9 Hz, 9-H), 2,61 (m, 5- H), 3,94 (br s, 7-H), 5,10 (br d, J ca. 3 Hz, 3-H), 5,48 (d, J 2,5 Hz, 1-H)], e uma fração b-glucopiranosil [d 4,60 (d, J 8,0 Hz, 1 -H)]. Os sinais de próton e carbono nos espectros de 1 H- e 13C-NMR de 3 foram sobreponíveis aos de 2, exceto para os sinais devidos às posições 3- e 4-. As posições da função bD-glucopiranosil e cloro em 3 foram elucidadas a partir dos experimentos H–H COZY e HMBC como mostrado na Fig. 1. Consequentemente, a estrutura planar de 3 foi construída para ser como mostrado. A estereoestrutura relativa de 3 foi determinada por um experimento NOESY, no qual foram observadas correlações NOE entre os seguintes pares de prótons (1-H e 3-H, 10-H2; 3- H e 4a-H; 4b-H e 5- H; 5-H e 6b-H, 9-H; 6b-H e 7-H; {{121} }H e 9-H) conforme mostrado na Fig. 2.

Estruturas de Kankanosídeo D (4) e Kankanol (5) O Kankanosídeo D (4) foi isolado como um pó amorfo com rotação óptica negativa ([a]D 25 30,6 graus em MeOH). O espectro IR de 4 mostrou uma banda de absorção em 1655 cm 1 atribuível à função olefina e fortes bandas de absorção em 3410 e 1078 cm 1 sugestivas de sua estrutura glicosídica. No FAB-MS de íon positivo de 4, um pico de íon quasimolecular foi observado em m/z 341 (M Na). A fórmula molecular C15H26O7 de 4 foi determinada por medição FAB-MS de alta resolução. A hidrólise ácida de 4 com HCl 1,0 M liberou D-glicose,8,10—12,15—18) enquanto a (R)-rotundidade (4a) 33,34) foi obtida pela hidrólise enzimática de 4 com b-glicosidase. Os espectros de 1H-NMR (Tabela 3, CD3OD) e 13C-NMR (Tabela 4)28) de 4 mostraram sinais atribuíveis a um metil [d 1,69 (s, 10-H3)], três metilenos [d 1,41, 2,06 (ambos m, 4-H2), 1,51, 2,01 (ambos m, 6a- e 6b-H), 2,23 (br dd, J ca. 8, 15 Hz, 7a-H), 2,37 (br dd , J ca. 8, 15 Hz, 7b-H)], uma metina [d 2,90 (m, 5-H)]] e dois metilenos com uma função de oxigênio {d [3,56 (DDD, J 2,8, 7,4 , 13,2 Hz), 3,97 (DDD, J 4,9, 8,0, 13,2 Hz), 3-H2], 4,04, 4,18 (ambos d, J 12,2 Hz, 1-H2)} juntamente com um b- parte glucopiranosil [d 4,25 (d, J 7,7 Hz, 1 -H)]. A posição da parte bD-glucopiranosil em 4 foi esclarecida pelo experimento HMBC para ser 3-posição (Fig. 1). Com base nesta evidência, a estereoestrutura absoluta de 4 foi determinada como mostrada.

Kankanol (5) foi obtido como um pó amorfo com rotação óptica positiva ([a]D 25 11,1 graus). A ionização química (CI)-MS de 5 mostrou um par de picos de íons isótopos em m/z 221 e 223 devido a um íon quasimolecular (MH). A medição CI-MS de alta resolução de 5 revelou que a fórmula molecular é C9H13ClO4. Os espectros de 1H-NMR (Tabela 1, CD3OD) e 13C-NMR (Tabela 2)28) de 5 mostraram a presença das seguintes funções: três metilenos [d 1,60 (DDD, J 2,5, 5,5, 13,1 Hz, 4a-H), 1,80 (br dd, J ca. 3, 13 Hz, 4b H), 1,83 (br d, J ca. 12 Hz, 6a-H), 2,57 (m, 6b-H), 3,75 , 3,88 (ambos d, J 9,2 Hz, 10-H2)], cinco metinos [d 2,76 (dd, J 4,3, 8,0 Hz, 9-H), 2,50 (m, 5- H), 3,80 (br s, 7-H), 5,17 (br d, J ca. 3 Hz, 3-H), 5,26 (d, J 4,3 Hz, 1-H) ]. A estrutura planar de 5 foi confirmada por experimentos 1 H–1 H COZY e HMBC. Ou seja, o experimento 1 H–1 H COZY em 5 indicou a presença das estruturas parciais escritas em negrito e, no experimento HMBC, foram observadas correlações de longo alcance como mostrado na Fig. 1. A estereoestrutura relativa de 5 foi determinado pelo experimento NOESY, no qual foram observadas correlações NOE entre os seguintes pares de prótons (1-H e 9-H; 3-H e 4a-H; 4b-H e {{ 93}} H; 5-H e 6b-H, 9-H; 6b-H e 7-H; 7-H e 9-H) conforme mostrado na Fig. 2. Por comparação dos dados de 1 H- e 13C-NMR para 5 com aqueles para 14a, que foi obtido pelo tratamento de 14 com 5 por cento de HCl aquoso como mostrado no Gráfico 1,35) a posição do cloro group in 5 foi suportado para ser a 3-posição. Além disso, a acetilação de 5 com anidrido acético (Ac2O) e piridina rendeu o 3,{119}}óxido (5a), enquanto 14a deu o diacetato (14b) sob a mesma condição de acetilação. Esta evidência também nos levou a confirmar a posição da função do cloro como sendo a posição 3b (Quadro 3). Consequentemente, a estereoestrutura de 5 foi determinada como mostrada.

Estrutura do Kankanosídeo E (6) O Kankanosídeo E (6) foi isolado como um pó amorfo com rotação óptica negativa ([a]D 25 20.0 grau em MeOH). O espectro IR de 6 mostrou bandas de absorção em 3410, 1647, 1085 cm 1 atribuíveis às funções glicosídica e carbonil, enquanto seu espectro UV mostrou absorção máxima em 211 nm (log e 4,63), indicando a presença de um ácido carboxílico b-insaturado. A fórmula molecular C16H28O8 de 6 foi caracterizada pelo íon positivo e negativo FAB-MS e pela medição de MS de alta resolução. A hidrólise ácida de 6 D-glicose liberada,8,10—12,15—18) enquanto (2E,6R)-8-hidroxi-2,6-dimetil- 2-ácido octanóico (6a) 36) foi obtido por hidrólise enzimática de 6 com b-glicosidase. Os espectros de 1H-NMR (Tabela 3, CD3OD) e 13C-NMR (Tabela 4)28) de 6 indicaram a presença de um (2E,6R)-8-hidroxi-2,6- fração de ácido dimetil-2-octanoico [d 0,95 (d, J 6,4 Hz, 10-H3), 1,30, 1,48 (ambos m, 5-H2), 1,45, 1,70 (ambos m, { {70}}H2), 1,65 (m, 6-H), 1,81 (s, 9-H3), 2,22 (2H, m, 4-H2), 3,61, 3,94 (ambos m, 8-H2), 6,78 (dd, J 1,2, 7,3 Hz, 3-H)] juntamente com uma parte bD-glucopiranosil [d 4,26 (d, J 7,6 Hz, 1 -H)] . Por comparação dos sinais de carbono no espectro de 13C-NMR de 6 com os de 6a, o deslocamento de glicosilação foi observado em torno da 8-posição de 6. A posição da ligação glicosídica também foi confirmada por experimentos HMBC, conforme mostrado em Fig. 1. Consequentemente, a estereoestrutura absoluta de 6 foi esclarecida como sendo (2E,6R)-8-b-D-glucopiranosiloxi-2,6-dimetil-2-ácido octanóico).

benefício do extrato de cistache

Experimental

Para a obtenção dos dados físicos foram utilizados os seguintes instrumentos: rotações específicas, polarímetro digital Horiba SEPA-300 (l 5 cm); espectro UV, espectrômetro Shimadzu UV-1600; espectros IR, espectrômetro Shimadzu FTIR-8100; EI-MS, CI-MS e CI-MS de alta resolução, espectrômetro de massa JEOL JMS-GCMATE; FAB-MS e MS de alta resolução, espectrômetro de massa JEOL JMS-SX 102A; espectro de 1H-NMR, espectrômetros JEOL EX-270 (270 MHz) e JNM-LA500 (500 MHz); espectros de 13C-NMR, espectrômetros JEOL EX-270 (68 MHz) e JNM-LA500 (125 MHz) com tetrametilsilano como padrão interno; e detector HPLC, Shimadzu RID-6Um índice de refração e detectores SPD- 10Avp UV-VIS. Coluna de HPLC, colunas YMC-Pack ODS-A (250 4,6 mm id) e (250 20 mm id) foram usadas para fins analíticos e preparativos, respectivamente.

As seguintes condições experimentais foram usadas para cromatografia: cromatografia em coluna de sílica gel de fase ordinária, Sílica gel BW-200 (Fuji Silysia Chemical, Ltd., Aichi, Japão, 15{{10}}—35 0 malha); cromatografia em coluna de gel de sílica de fase reversa, Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd., Aichi, Japão, 100-200 mesh); TLC, placas de TLC pré-revestidas com Sílica gel 60F254 (Merck, 0,25 mm) (fase comum) e Sílica gel RP- 18 F254S (Merck, 0,25 mm) (fase reversa); HPTLC de fase reversa, placas de TLC pré-revestidas com sílica gel RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm); e a detecção foi obtida por pulverização com 1 por cento de Ce(SO4)2–10 por cento de H2SO4 aquoso seguido de aquecimento.

Material vegetal

Caules secos de Cistanche tubulosa (SCHRENK) R. WIGHT foram adquiridos em Urumqi, província de Xinjiang, China em janeiro de 2005 via Eishin Trading Co., Ltd. Osaka, Japão, e a identificação botânica foi realizada pelo professor Jia Xiaoguang no Instituto de Chinês Tradicional de Xinjiang e Medicamentos Etnológicos. Um espécime de comprovante (2005.01. Xinjiang-01) desta planta está arquivado em nosso laboratório.

Extração e Isolamento

Caules secos de C. tubulosa (5,0 kg) foram pulverizados e extraídos três vezes com metanol sob refluxo por 3 h. A evaporação do solvente sob pressão reduzida forneceu o extrato metanólico (1340 g, 26,8% deste fitoterápico). O extrato metanólico (160 g) foi submetido a cromatografia em coluna de sílica gel de fase normal [3,2 kg, CHCl3–MeOH–H2O (10 : 3 : 1→7 : 3 : 1, inferior layer→6 : 4 : 1)MeOH] para dar seis frações [Fr. 1 (5.04 g), Fr. 2 (9,84 g), Pe. 3 (7,80 g), Fr. 4 (13,28 g), Pe. 5 (113,6{{104}} g), e Fr. 6 (7,61 g)]. A fração 1 (5.00 g) foi separada por cromatografia em coluna de sílica gel de fase reversa [150 g, MeOH–H2O (40 6: 60→ 5{{ 162}} : 50→60 : 40, v/v)→MeOH] para obter cinco frações [Fr. {{50}} (83{{201}} mg), Fr. 1-2 (590 mg), Fr. 1-3 (180 mg), Fr. 1-4 (124 mg), e Fr. 1-5 (3200 mg)]. Pe. {{60}} (830 mg) foi ainda separado por HPLC [MeOH–H2O (10 : 90, v/v)] para dar kankanol (5, 20 mg, 0,0034 por cento), argyol (15, 18 mg, 0,0030 por cento), cistanina (16, 24 mg, 0,0040 por cento), e Fr. 1-1-2 (62 mg), que foi ainda separado por HPLC [MeOH–H2O (2: 98, v/v)] para dar (3R)-3-hidroxi-2-pirrolidinona (0,0020 por cento ) e (3R)-3-hidroxi-1-metil-2-pirrolidinona (0,0059 por cento). Pe. 1-2 (590 mg) foi purificado por HPLC [MeOH–H2O (35: 65, v/v) e CH3CN–H2O (20: 80, v/v)] para dar cistanclorina (17, 21 mg, 0,0035 por cento). A fração 2 (9,72 g) foi submetida a cromatografia em coluna de sílica gel de fase reversa [290 g, MeOH–H2O (20: 80→30: 70→40: 60→60: 40, v/v)→MeOH] para garantir sete frações [Fr. 2-1 (1986 mg), Fr. 2-2 (1563 mg), Fr. 2-3 (3931 mg), Fr. 2-4 (375 mg), Pe. 2-5 (486 mg), Fr. 2-6 (460 mg), e Fr. 2-7 (336 mg)]. Pe. 2-1 (466 mg) foi separado por HPLC [MeOH–H2O (5: 95, v/v)] para dar uridina (0,0069 por cento). Pe. 2-2 (535 mg) foi separado por HPLC [MeOH–H2O (10: 90, v/v)] para dar antirretida (11, 15 mg, 0,0079 por cento) e 6-deoxicatalpol (14, 214 mg, 0,11 por cento). Pe. 2-3 (535 mg) foi separado por HPLC [MeOH–H2O (20: 80, v/v)] para fornecer glurosídeo (10, 110 mg, 0,14 por cento) e bartsiosideo (13, 164 mg, 0,21 por cento) . Pe. 2-4 (375 mg) foi separado por HPLC [MeOH–H2O (30: 70, v/v)] para dar cancanosídeos A (1, 32 mg, 0,0054 por cento) e D (4, 9 mg, 0,0015 por cento ). Pe. 2-6 (460 mg) foi ainda separado por HPLC [MeOH–H2O (45: 55, v/v)] para fornecer cancanosídeo E (6, 161 mg, 0,027 por cento) e (2E,6Z){{192 }}bD-glucopiranosiloxi-2,6-dimetil-2,6-ácido octadienóico (18, 17 mg, 0,0028 por cento). A fração 3 (7,60 g) foi submetida a cromatografia em coluna de gel de sílica de fase reversa [230 g, MeOH–H2O (20: 80→40: 60→50: 50→ 60: 40, v/v)→MeOH] para dar cinco frações [Fr. 3-1 (2652 mg), Fr. 3-2 (593 mg), Fr. 3-3 (3610 mg), Fr. 3-4 (190 mg), e Fr. 3-5 (336 mg)]. Pe. 3-1 (480 mg) foi purificado por HPLC [MeOH–H2O (10: 90, v/v)] para dar kankanosídeo B (2, 19 mg, 0,018 por cento), ácido geniposidico (8, 32 mg, 0,030 por cento) e ajugol (12, 12 mg, 0,011 por cento). A fração 4 (13,10 g) foi submetida a cromatografia em coluna de sílica gel de fase reversa [390 g, MeOH–H2O (10: 90→20: 80→30: 70→40: 60→50: 50, v/v)→ MeOH] para dar sete frações [Fr. 4-1 (6114 mg), Fr. 4-2 (430 mg), Fr. 4-3 (1058 mg), Fr. 4-4 (170 mg), Pe. 4-5 (2595 mg), Fr. 4-6 (1635 mg), e Fr. 4-7 (1064 mg)]. Pe. 4-2 (430 mg) foi ainda separado por HPLC [MeOH–H2O (5: 95, v/v)] para gerar 2 (70 mg, 0,012 por cento) e kankanosídeo C (3, 16 mg, 0,0027 por cento) . Pe. 4-6 (1058 mg) também foi separado por HPLC [MeOH–H2O (15: 85, v/v)] para fornecer ácido mussaenosídico (7, 116 mg, 0,020 por cento) e 8-ácido epilogânico (9, 193 mg, 0,033 por cento). A fração 5 (15,15 g) foi submetida a cromatografia em coluna de sílica gel de fase reversa [455 g, MeOH–H2O (0: 100→10: 90→20: 80→40: 60→50: 50, v/v)→MeOH ] para dar sete frações [Fr. 5-1 (9311 mg), Fr. 5-2 (1114 mg), Fr. 5-3 (306 mg), Pe. 5-4 (347 mg), Pe. 5-5 (1620 mg), Fr. 5-6 (1453 mg), e Fr. 5-7 (1106 mg)]. Pe. 5-1 (9311 mg) foi cristalizado a partir de MeOH para dar D-manitol (3337 mg, 4,19 por cento).

Os compostos conhecidos (7-18) foram identificados por comparação de seus dados físicos ([a]D, IR, 1H-NMR, 13C-NMR, MS) com valores relatados 1,7,19-24,26,27) ou os de amostras comerciais.25) Kankanosídeo A (1): Um pó amorfo, [a]D 25 107,4 graus (c 1,50, MeOH). FAB-MS de íons positivos de alta resolução: Calculado para C16H26O8Na (M Na) 369,1525; Encontrado 369.1522. IV (KBr): 3410, 2940, 1647, 1076 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD e piridina-d5) d: fornecido na Tabela 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD e piridina-d5) d C: fornecido na Tabela 2. FAB-MS de íon positivo: m /z 369 (M Na). FAB-MS de iões negativos: m/z 345 (MH).

Kankanosídeo B (2): Um pó amorfo, [a]D 26 118,7 graus (c 0.10, MeOH). FAB-MS de íons positivos de alta resolução: Calculado para C15H24O10Na (M Na) 387,1267; Encontrado 387.1261. IV (KBr): 3410, 2940, 1647, 1085 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 2. FAB-MS de iões positivos: m/z 387 (M Na). FAB-MS de iões negativos: m/z 363 (MH).

Kankanosídeo C (3): Um pó amorfo, [a]D 26 34.0 grau (c 1.00, MeOH). FAB-MS de íons negativos de alta resolução: Calculado para C15H24ClO10 (MH) 399,1058; Encontrado 399.1077. IV (KBr): 3410, 2964, 1159, 1078, 1048, 949 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 1. 13C NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 2. FAB-MS de iões negativos: m/z 399, 401 (MH).

Kankanosídeo D (4): Um pó amorfo, [a]D 25 30,6 graus (c 0,50, MeOH). FAB-MS de íons positivos de alta resolução: Calculado para C15H26O7Na (M Na) 341,1204; Encontrado 341.1210. IV (KBr): 3410, 2940, 1655, 1078, 1040 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 3. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 4. Íon positivo FAB-MS: m/z 341 (M Na). FAB-MS de iões negativos: m/z 317 (MH).

Kankanol (5): Um pó amorfo, [a]D 25 11,1 graus (c 1,40, MeOH). CI-MS de alta resolução: Calculado para C9H14ClO4 (MH) 221,0580; Encontrado 221.0582. IV (KBr): 3399, 3004, 1165, 1096, 1059, 1048, 955 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 2. CI-MS m/z (porcentagem): 221 (MH) (5 ), 223 (MH) (2), 185 (88), 167 (100), 149 (71) e 57 (49).

Kankanosídeo E (6): Um pó amorfo, [a]D 25 20.0 graus (c 2.00, MeOH). FAB-MS de íons positivos de alta resolução: Calculado para C16H28O8Na (M Na) 371,1682; Encontrado 371.1690. UV [MeOH, nm (log e)]: 215 (4,16). IV (KBr): 3410, 2940, 1647, 1085, 1043 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 3. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 4. Íon positivo FAB-MS: m/z 371 (M Na). FAB-MS de iões negativos: m/z 347 (MH).

benefício do extrato de cistache

Hidrólise ácida de 1-4 e 6 com HCl 1 M

Uma solução de 1-4 ou 6 (cada 1,5 mg) em 1 M HCl (0,5 ml) foi aquecida sob refluxo durante 3 h. Após arrefecimento, a mistura reaccional foi vertida em água gelada e neutralizada com Amberlite IRA-400 (forma OH), e a resina foi removida por filtração. Em seguida, o filtrado foi extraído com EtOAc. A camada aquosa foi submetida a análise de HPLC sob as seguintes condições: coluna de HPLC, sensor Ka LC NH{{10}}, 4,6 mm id 250 mm (Tóquio Kasei Co., Ltd., Tóquio, Japão); detecção, rotação óptica [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd., Tóquio, Japão)]; fase móvel, CH3CN–H2O (75: 25, v/v); taxa de companheiro 0,8 ml/min; temperatura da coluna, temperatura ambiente. A identificação da D-glicose presente na camada aquosa foi realizada por comparação do seu tempo de retenção e rotação óptica com os de uma amostra autêntica: tR 12,3 min (rotação óptica positiva)

Hidrólise enzimática de 1, 4 e 6 com b-glicosidase

Uma solução de 1 (7,7 mg) em H2O (1,5 ml) foi tratada com b-glucosidase (5.0 mg, de amêndoa, Oriental Yeast Co., Tóquio, Japão) e a solução foi agitada a 37 graus por 3d. Depois que EtOH foi adicionado à mistura de reação, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por HPLC [MeOH-H2O (55: 45, v/v)] para fornecer cankagenina a (1a, 2,3 mg, 56 por cento) . Por meio de um procedimento semelhante, (R)-rotundiol33,34) (4a, 1,2 mg, 69 por cento) e (2E,6R)-8-hidroxi-2,6-dimetil{{30} }ácido octanóico36) (6a, 6,8 mg, 62 por cento) foram obtidos a partir de 4 (3,5 mg) e 6 (20,4 mg), respectivamente.

Kankagenina a (1a): Um pó branco, [a]D 25 18,4 graus (c 0.20, MeOH). EI-MS de alta resolução: Calculado para C10H16O3 (M) 184,1099; Encontrado 184.1106. IV (KBr): 3410, 2940, 1684 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 2. EI MS: m/z (porcentagem): 184 (M, 37) , 95 (100).

Tratamento alcalino de 14 com 5 por cento de KOH aquoso

Uma solução de 14 (23.0 mg) em 5 por cento de KOH aquoso (1.0 ml) foi agitada a 80 graus durante 2 h. A mistura reaccional foi neutralizada com Amberlite HCR-W2 (forma H). A remoção do solvente do filtrado sob pressão reduzida forneceu um resíduo, que foi purificado por HPLC [MeOH-H2O (5: 95, v/v)] para dar 2 (4,0 mg, 16 por cento) e 1932) (10,5 mg , 43 por cento).

Tratamento ácido de 14 com 5 por cento de HCl aquoso

Uma solução de 14 (25.0 mg) em 5 por cento de HCl aquoso (2.0 ml) foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h. A mistura reaccional foi vertida em água gelada e toda a mistura reaccional foi extraída com EtOAc. O extrato de EtOAc foi sucessivamente lavado com NaHCO3 aquoso saturado e salmoura, depois seco sobre pó de MgSO4 anidro e filtrado. A remoção do solvente do filtrado sob pressão reduzida forneceu um resíduo, que foi separado por HPLC [MeOH–H2O (20: 80, v/v)] para dar 14a (4,0 mg, 25 por cento).

14a

Um pó branco, [a]D 20 21,5 graus (c 0,30, MeOH). CI-MS de alta resolução: Calculado para C9H14ClO4 (MH) 221,0580; Encontrado 221.0587. IV (KBr): 3410, 2962, 1365, 1152, 1055, 945 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 2. CI-MS: m/z (porcentagem): 221 (MH) ( 7), 223 (MH) (3), 203 (M H2O) (97), 205 (M H2O) (33), 185 (7), 167 (12), 159 (32), 121(27), 110 (48), 95 (64), 85 (100), 67 (56) e 57 (65).

Acetilação de 5 e 14a

Uma solução de 5 (2,5 mg) em piridina (0,5 ml) foi tratada com anidrido acético (Ac2O, 0,4 ml) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 12 h. A mistura reaccional foi vertida em água gelada e toda a mistura reaccional foi extraída com EtOAc. O extrato de EtOAc foi sucessivamente lavado com HCl aquoso a 5 por cento, NaHCO3 aquoso saturado e salmoura, em seguida, seco sobre pó de MgSO4 anidro e filtrado. A remoção do solvente do filtrado sob pressão reduzida forneceu um resíduo, que foi purificado por HPLC [MeOH-H2O (35: 65, v/v)] para dar 5a (2,3 mg, 77 por cento). Através de um procedimento semelhante, 14b (2,7 mg, 87 por cento) também foi preparado e purificado por HPLC [MeOH-H2O (55: 45, v/v)] de 14a (2,1 mg).

5a

Um pó branco, [a]D 20 1,8 graus (c 0,18, MeOH). CI MS de alta resolução: Calculado para C11H15O5 (MH) 227,0919; Encontrado 227.0925. IV (KBr): 2962, 1734, 1374, 1258, 1237, 1169, 1103, 1053, 947 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 2. CI-MS m/z (porcentagem): 227 (MH) (28 ), 209 (M H2O) (4), 184 (3), 166 (45), 149 (22), 138 (38), 122 (44), 94 (31), 85 (100) e 57 (34) ).

14b

Um pó branco, [a]D 20 23,7 graus (c 0,06, MeOH). CI-MS de alta resolução: Calculado para C13H18ClO6 (MH) 305,0792; Encontrado 305.0790. IV (KBr): 1744, 1376, 1243, 1231, 1001, 941 cm1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 2. CI-MS: m/z (porcentagem): 305 (MH) ( 2), 307 (MH) (1), 263 (MH C2H3O) (6), 265 (MH C2H3O) (3), 245 (30), 203 (8), 185 (100), 167 (7), 149 (33), 121 (26), 95 (15), 85 (37) e 57 (93).

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo 21º Programa COE, Academic Frontier Project e um Grant-in-Aid for Scientific Research do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão. Os autores agradecem ao professor Xiaoguang Jia do Instituto de Medicina Tradicional Chinesa e Etnológica de Xinjiang em Urumqi, China, pela identificação do material vegetal.

benefício cistache

Referências e Notas

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25) Esses compostos conhecidos foram identificados por comparação de seus dados físicos com amostras obtidas comercialmente.

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28) Os espectros de 1 H- e 13C-NMR de 1-6 e compostos relacionados (19, 1a, 5a, 14a, 14b) foram atribuídos com o auxílio de aprimoramento sem distorção por transferência de polarização (DEPT), espectroscopia de correlação de filtro quântico duplo ( DQF COSY), coerência quântica múltipla heteronuclear (HMQC) e conectividade de ligação múltipla heteronuclear (HMBC).

29) Nishizawa M., Kodama S., Yamase Y., Kayano K., Hatakeyama S., Ya mada H., Chem. Farmácia. Bull., 42, 982-984 (1994).

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