MiR-214 melhora a lesão renal aguda induzida por sepse por meio de autofagia regulada por PTEN/AKT/mTOR
Feb 28, 2022
Abstrato. Estudos anteriores sugeriram que o estresse oxidativo e a autofagia resultam emlesão renal (AKI) durante a sepse e microRNA (miR)-214 desempenha um papel vital na proteção derinssubmetidos ao estresse oxidativo. O presente estudo teve como objetivo testar se a renoproteção do miR‑214 está relacionada à autofagia na sepse. O papel da autofagia foi investigado em um modelo de camundongo de ligadura e punção cecal (CLP). A reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT‑qPCR) foi usada para analisar a expressão de miR‑214. A estrutura e a função derinscolhidos dos camundongos foram avaliados.Rimos níveis de autofagia foram detectados com imunohistoquímica, imunofluorescência e western blotting. Descobriu-se que o miR-214 pode aliviar a IRA em camundongos sépticos, inibindo o nível derimautofagia. Além disso, o miR‑214 inibiu a autofagia silenciando a expressão de PTEN norimtecidos de camundongos sépticos. Esses achados indicaram que o miR-214 melhorou a LRA induzida por CLP, reduzindo o estresse oxidativo e inibindo a autofagia por meio da regulação da via PTEN/AKT/mTOR.
Palavras-chave:microRNA-214, sepse, lesão renal aguda, autofagia,
Introdução Agudolesão renal(LRA) é uma das complicações mais comuns da sepse e ocorre em 40-50 por cento dos pacientes sépticos, com uma taxa de mortalidade de até 60 por cento (1). No entanto, a patogênese da LRA induzida por sepse permanece incerta. Foi relatado que a autofagia desempenha um papel fundamental na IRA induzida por sepse e a inibição da autofagia resulta no desenvolvimento de IRA durante a sepse (2,3). Estudos anteriores (4,5) confirmaram que a sepse desencadeia autofagia em múltiplos órgãos, incluindo orim(6) e processos autofágicos estão envolvidos na remoção de mitocôndrias danificadas e estresse oxidativo (7). No entanto, a autofagia excessiva pode causar morte celular indesejada e deletéria (8). Portanto, um nível moderado de autofagia é a chave para reduzir a LRA induzida pela sepse. Estudos anteriores relataram que o miR-214 melhora a IRA induzida por isquemia-reperfusão ao inibir a apoptose (9) e o miR-214 suprime o estresse oxidativo na nefropatia diabética através da via de sinalização de espécies reativas de oxigênio (ROS)/AKT/mTOR (10). O presente estudo descobriu que o miR-214 pode atenuar a disfunção miocárdica induzida pela sepse em camundongos, inibindo a autofagia (11). No entanto, se o miR-214 pode melhorar a LRA induzida por sepse ainda não foi elucidado. No presente estudo, foi levantada a hipótese de que o miR‑214 atenua a LRA induzida por CLP, reduzindo o estresse oxidativo e inibindo a autofagia por meio da regulação da via PTEN/AKT/mTOR.
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Materiais e métodos
Animais.Um total de 100 camundongos machos Kunming (peso, 20,40±2,92 g; idade, 6-8 semanas) fornecidos pelo Medical Laboratory Animal Center da Hebei Medical University (Shijiazhuang, China) foram usados no presente estudo. Todos os camundongos foram aclimatados a um ciclo claro/escuro de 12 horas a 24°C com 50 por cento de umidade e receberam acesso livre a comida e água em maior ou igual a 1 semana antes dos experimentos. Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (publicação NIH nº 85-23, revisada em 1996) e aprovação pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Central de Cangzhou (aprovação nº 2017-020- 01). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
Ligadura e punção cecal (CLP).O CLP foi realizado em camundongos para criar um modelo de sepse murina, conforme descrito anteriormente (12). Após anestesia por inalação de isoflurano (induzida em 3 por cento e mantida em 0,5 por cento), uma incisão na linha média de 1 cm foi cortada. O ceco exposto (distância de 1 cm da extremidade) foi ligado com duas punções com agulha de calibre 23. O ceco extruiu suavemente uma pequena quantidade de fezes e foi recolocado em sua posição anatômica. A parede abdominal foi suturada em planos com trança de seda 3-0. Após o procedimento, 1 ml de 0,9 por cento de solução salina foi injetado por via subcutânea. Os camundongos tiveram acesso livre apenas a água. Os camundongos modelo Sham foram operados da mesma maneira que o modelo CLP sem CLP.
Design experimental. Camundongos (n=6 para cirurgia simulada e CLP) foram distribuídos aleatoriamente em sete grupos: grupo Sham, grupo CLP, proteína fluorescente verde de adenovírus (Ad) (GFP) mais grupo CLP, grupo Ad-miR-214 mais CLP , anti-miR-214 mais grupo CLP, inibidor de PTEN mais grupo CLP e Ad-miR-214 mais inibidor de PTEN mais grupo CLP. Os camundongos do grupo Sham foram expostos ao mesmo procedimento, mas sem ligadura e punção do ceco. Os camundongos dos outros grupos receberam ligadura e perfuração cecal. Todos os camundongos foram rapidamente anestesiados por inalação de isoflurano para coleta de sangue, urina erimamostras 24 h após o último tratamento.
Ad-miR-214 mediado por adenovírus, anti-miR-214 ou Ad-GFPtransferência de genes in vivo e injeção de inibidor de PTEN. Ad-miR-214, anti-miR-214, ou Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) foi entregue na cavidade abdominal de camundongos 4 dias antes do CLP. Resumidamente, os camundongos foram anestesiados por inalação de isoflurano. Um cateter contendo 200 µl de adenovírus (2x1011 pfu, expressando miR‑214, anti‑miR‑214 ou Ad‑GFP) foi administrado a camundongos normais por meio de injeção intraperitoneal. O inibidor de PTEN (VO‑OHpic, intraperitoneal, Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) foi administrado a camundongos CLP que receberam anti‑miR‑214 via injeção intraperitoneal em uma dose única de 10 µg/kg 30 min antes da administração de adenovírus .
Avaliação da função renal. Amostras de sangue foram colhidas do coração de camundongos, seguidas de centrifugação (à temperatura ambiente por 15 min a 3,000 xg) para coleta de soro. Os níveis séricos de nitrogênio ureico no sangue (BUN) e creatinina sérica (Cr) foram determinados usando um analisador automático Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA foi usado para analisar os níveis delesão renalmolécula-1 (KIM-1; cat. n.º RKM100; R&D Systems, Inc.) e lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL; cat. n.º DY3508; R&D Systems, Inc.) em amostras de urina.
Ensaio para citocina de inflamação sérica.O soro TNF- (nº de cat. H052) e IL-6 (n.º de cat. H007) foram examinados usando kits comerciais de ELISA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) de acordo com as instruções do fabricante.Medição de marcadores de estresse oxidativo. O kit de ensaio correspondente (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) foi usado para medir os níveis de malondialdeído (MDA) e testar a atividade da superóxido dismutase (SOD) de acordo com as instruções do fabricante.
Histologia e pontuação de lesão tubular. Todos os camundongos foram submetidos arimperfusão sob anestesia 24 h após FLP. orimos espécimes foram fixados em paraformaldeído a 4% por 72 h a 4˚C. As amostras de tecido foram então desidratadas em uma série graduada de soluções de etanol, incluídas em parafina e cortadas em seções de 4 µm. Secções (4 µm) foram cortadas usando um micrótomo e as secções de tecido foram coradas com hematoxilina (5 min) e eosina (1 min) à temperatura ambiente para exame histológico. As lâminas foram avaliadas e graduadas usando um microscópio (BX51, Olympus Corporation).Renaltissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 por cento (13).
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM).Frescorinsforam lavados em solução salina tamponada com fosfato e cortados em cubos de 1 mm e fixados sequencialmente em glutaraldeído a 2,5 por cento por 24 h a 4°C. Os cortes foram imersos em tetróxido de ósmio a 1 por cento por 2 h a 4°C, desidratados em etanol graduado e embebidos em resina epóxi. Finalmente, os cortes ultrafinos (60 nm) foram duplamente corados com acetato de uranila e citrato de chumbo a 20°C por 60 min. A observação foi realizada em microscópio eletrônico de transmissão (Tecnai; Hitachi, Ltd.) a 80 kV usando Filme de Microscopia Eletrônica 4489 (base espessa ESTAR; Kodak).
Imuno-histoquímica (IHC).Frescorimos tecidos foram fixados em paraformaldeído a 4% (por 72 h a 4˚C) e incluídos em parafina. As amostras foram cortadas em seções de 4 µm de espessura e desparafinizadas em xileno. Depois que as seções de tecido foram lavadas com PBS, elas foram fervidas em tampão citrato 10 mM (pH 6.0) por 4 min para recuperação de antígeno e depois bloqueadas com 10% de soro de cabra em PBS à temperatura ambiente por 1h. O anticorpo primário (anti‑LC3B; 1:400; cat. n.º 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) foi adicionado de acordo com as instruções e incubado a 4˚C durante 12 h. O anticorpo secundário (HRP anticoelho de cabra; 1:2,000; cat. n.º BS13278; Bioworld Technology, Inc.) foi adicionado e incubado à temperatura ambiente durante 10 min. Adicionou-se DAB (100 µl) e contracorou-se durante 5 min com a coloração observada ao microscópio de luz (Modelo CX31‑P; Olympus Corporation). A intensidade da coloração positiva, que parecia marrom, foi determinada usando o software de análise de imagem Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). A densidade óptica integral (IOD) foi calculada para representar a intensidade. Os valores de IOD aumentaram à medida que a expressão da proteína aumentou.
Transcrição reversa-quantitativa(RT-q) PCR. O RNA total foi extraído detecido renalapós a indução do modelo usando o reagente TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). De acordo com as instruções do kit de transcrição reversa TaqMan (cat. n.º N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), o ARN foi transcrito inversamente em cDNA. Foram utilizadas as seguintes condições de termociclagem (miR‑214): Desnaturação inicial a 95°C por 5 min; seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 segundos, recozimento a 60°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 30 segundos. A RT‑qPCR foi realizada usando um ABI Prism 7500 Sequence Detection System (PerkinElmer, Inc.) e um kit SYBR Green PCR padrão (Toyobo Life Science). O U6 foi usado como controle interno para o miR‑214. As sequências de iniciadores foram as seguintes: miR-214, direto, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' e reverso, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, frente, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' e reverso, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Esses experimentos foram replicados seis vezes. Os resultados foram analisados pelo método 2‑ΔΔCq (14). Os níveis de expressão de mRNA de LC3, p62, PTEN, AKT e mTOR foram avaliados via RT‑qPCR. Com a ‑actina como referência interna desses genes, o 2‑ΔΔCq foi usado para medir a expressão relativa dos genes-alvo. As sequências de primers mostradas na Tabela I foram sintetizadas por Sangon Biotech Co., Ltd.
Manchas ocidentais. Rimo tecido foi misturado com lisado de RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology) para fazer o homogenato e a lise foi interrompida quando nenhum tecido visível foi observado. As amostras foram centrifugadas a 13,000 xg por 10 min a -4˚C e o sobrenadante foi recuperado para a análise de Western blot. Em resumo, as concentrações de proteína foram determinadas usando o kit de ensaio de proteína micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). As amostras de proteína (80 µg por amostra) foram submetidas a separação por eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio a 12% e, em seguida, transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno a 4˚C durante a noite. As proteínas separadas foram transferidas para membranas de PVDF. Após o bloqueio em 5% de leite desnatado à temperatura ambiente por 2 h, as membranas foram incubadas durante a noite (a 4°C) com anticorpos primários. Os seguintes anticorpos primários (todos Cell Signaling Technology, Inc.) foram usados: Cadeia leve 3B (1:1,000; cat. no. 4412), p62 (1:1,000; cat. . nº 4412), Anti-PTEN (1:1,000; cat. nº 9188), anti-fosforilado (p)-AKT (Ser473) (1:1,000; cat . nº 4060), anti-AKT (1:1,000; cat. nº 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1,000; cat. não . 5536), anti‑mTOR (1:1,000; cat. no. 2972) e ‑actina (1:2,000; cat. no. 4970). Após a lavagem, as membranas foram incubadas (à temperatura ambiente por 2 h) com os anticorpos secundários anti-coelho conjugados com HRP (1:3,000; cat. nº A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). As bandas de proteína foram detectadas com Immobilon Western (MilliporeSigma) e analisadas usando o software Total‑Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). A expressão da proteína foi normalizada para ‑actina.
Análise estatística. A análise estatística foi realizada usando o GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Todos os dados foram apresentados como média ± desvio padrão ou mediana (intervalos interquartis) para variáveis contínuas, dependendo de suas distribuições. As características basais e os resultados foram comparados usando ANOVA de uma via seguida pelo teste posthoc de Tukey ou teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn, conforme apropriado. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultados
Ponto de tempo 24 h após CLP. Estudos anteriores relataram (6,15,16) que a análise bioquímica (ou seja, LC3 e p62) revela que o fluxo de autofagia é suprimido com a progressão da sepse após 6-8 h de FLP. No presente estudo, o número de autolisossomos norimde camundongos tratados com CLP aumentou dentro de 24 h após a cirurgia. Além disso, a análise de marcadores delesão renalmostrou quefunção renalfoi mais seriamente danificado 24 h após CLP. Portanto, o ponto de tempo 24 h após CLP foi escolhido para os seguintes experimentos.
Efeito regulador no miR-214 em tecidos renais. A análise de RT‑qPCR foi usada para detectar a expressão de miR‑214 em camundongos tratados com CLP. Verificou-se que a expressão de miR-214 foi ligeiramente regulada positivamente norimtecidos após a cirurgia de FLP 24 h, em comparação com o grupo sham (1,47 vezes, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">rimtecido, em comparação com o grupo sham (tanto P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
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Efeito do miR-214 na disfunção renal em camundongos sépticos.Todos os camundongos foram sacrificados para coleta de sangue, urina erimamostras 24 h após a cirurgia de FLP. BUN e Cr são importantes indicadores da gravidade darenaldeficiência (17). Além disso, NGAL e KIM-1 foram identificados como biomarcadores específicos delesão renale sua expressão aumentada está associada arenallesão tubular na LRA (17). Conforme mostrado na Fig. 2A-D, os níveis de BUN, Cr, KIM-1 e NGAL aumentaram significativamente após a cirurgia de CLP em comparação com o grupo simulado. No entanto, Ad-miR-214 diminuiu significativamente os níveis de BUN, Cr, KIM-1 e NGAL em comparação com o grupo CLP (todos P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">função renalparâmetros. No entanto, após o pré-tratamento com inibidor de PTEN, os efeitos de proteção do Ad‑miR‑214 foram aprimorados. Os resultados mostram que o miR‑214 atenua a disfunção renal em camundongos sépticos.
Efeito do miR-214 na inflamação renal e estresse oxidativo.Conforme mostrado na Fig. 3A e B, CLP elevou significativamente os níveis de TNF- e IL-6, enquanto Ad-miR-214 diminuiu significativamente os níveis desses marcadores. Comparado com o
Efeito do miR-214 na autofagia renal em camundongos sépticos.O presente estudo examinou as mudanças em LC3 emrimtecidos por coloração IHC. Conforme mostrado na Fig. 6, a intensidade de LC3 de coloração positiva aumentou significativamente no grupo CLP em comparação com o grupo simulado (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 ativa a via AKT/mTOR para inibirautofagia silenciando PTEN em tecidos renais.O efeito do CLP na autofagia emrimtecidos foi investigado pela avaliação dos níveis de LC3-II/I e p62. A via de sinalização PTEN/AKT/mTOR desempenha um papel importante na autofagia (18). Para investigar o efeito do miR‑214 na via PTEN‑AKT/mTOR, os níveis de proteína de LC3‑II/I, p62, AKT, p‑AKT, mTOR, p‑mTOR e PTEN foram analisados por meio de western blotting e RT‑ Análise qPCR. Conforme mostrado na Fig. 7A-C, a modificação nessas proteínas ocorre rapidamente, com aumento na taxa de LC3-II/LC3-I e redução nos níveis de p62 (tanto P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">rim tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Esses resultados mostraram que a autofagia foi induzida por CLP, e a superexpressão de miR‑214 poderia inibi-la parcialmente.
Conforme mostrado na Fig. 7A e D-F, o nível de expressão de PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">rim tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Esses achados sugerem que a CLP induzrimautofagia tecidual inibindo a via AKT/mTOR. Ad-miR-214 ativou a via AKT/mTOR silenciando PTEN emrimtecidos. No entanto, em comparação com o grupo CLP, o anti‑miR‑214 não inibiu significativamente a expressão de mTOR. Portanto, RT‑qPCR foi ainda utilizado para determinar a expressão de mRNA de genes relacionados à via de sinalização PTEN/AKT/mTOR. De acordo com os resultados de RT‑qPCR (Fig. 8), em comparação com o grupo Sham, os níveis de expressão de mRNA de p62, LC3 e PTEN foram acentuadamente aumentados, enquanto a expressão de mRNA de AKT e mTOR foi diminuída no grupo CLP. Comparado com o grupo CLP, o Ad-miR-214, PTEN
inibidor e Ad-miR-214 mais grupos inibidores de PTEN apresentaram expressão de mRNA diminuída de LC3 e PTEN, mas expressão de mRNA aumentada de p62, AKT e mTOR (todos P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Assim, o efeito da p62 na autofagia pode ocorrer no nível transcricional e não no nível pós-transcricional. Os resultados atuais demonstraram que o miR‑214 regulou negativamente a expressão de PTEN e ativou a via de sinalização AKT/mTOR.
Discussão
O presente estudo descobriu que a autofagia excessiva foi prejudicial para afunção renalem camundongos sépticos. Estudos anteriores mostraram que o miR‑214 está associado ao aumento da proliferação, metástase, invasão e funciona como um oncogene para células e tecidos (19‑22). Estudos relatam que o miR‑214 desempenha um papel protetor contra a LRA através da atenuação da apoptose, do estresse oxidativo e da regulação negativa de fatores inflamatórios (21,23). O presente estudo examinou ainda os mecanismos subjacentes ao efeito protetor do miR‑214 na IRA induzida por sepse, concentrando-se no potencial envolvimento do miR‑214 na modulação da autofagia. Os resultados mostraram que o estresse oxidativo ocorreu norimapós a administração da cirurgia de FLP. Enquanto isso, a ativação da autofagia ocorre norim.Elevação de LC3 II/I e redução de p62 norimfoi observada após o tratamento com cirurgia de FLP. Como esperado, a superexpressão de miR-214 atenuou significativamenterimlesões patológicas erimdisfunção causada pela sepse. No entanto, a inibição do miR‑214 apresentou uma tendência oposta à renoproteção. Além disso, o efeito de proteção do Ad-miR-214 foi aprimorado pelo inibidor de PTEN.
Em uma fossarim, a inflamação excessiva é acompanhada por aumentos maciços na produção de EROs e um grande número de EROs desencadeia mudanças na estrutura mitocondrial e prejudica a função mitocondrial, o que faz com que o corpo entre em um ciclo vicioso que agravarimdanos (24,25). Portanto, o estresse oxidativo pode ser um dos principais mecanismos patológicos da LRA induzida pela sepse. O presente estudo forneceu mais evidências demonstrando estresse oxidativo excessivo, que foi indicado pelo aumento da produção de MDA e redução da atividade de SOD norimtecidos após a cirurgia de FLP. Além disso, descobriu-se que a superexpressão de miR‑214 poderia proteger orimcontra a lesão oxidativa induzida por CLP, que está envolvida na inibição autofágica. Isso é consistente com os estudos anteriores de que o miR‑214 protege várias células e tecidos contra o estresse oxidativo (26,27).
A autofagia serve como uma 'faca de dois gumes' no desenvolvimento da sepse: a autofagia basal pode exercer efeitos protetores ao remover proteínas oxidativas tóxicas, mas a autofagia excessiva pode levar à morte celular autofágica sob estresse severo, como erupção de ROS (28,29) . Foi demonstrado que a autofagia é ativada inicialmente na sepse, seguida por uma fase subsequente de disfunção devido à morte celular autofágica (30), o que agrava a lesão oxidativa induzida pela sepse. No presente estudo, o inibidor de PTEN ou a superexpressão de miR‑214 exibiu renoproteção antioxidante em camundongos tratados com CLP. No entanto, a inibição do miR‑214 apresentou uma tendência oposta à renoproteção antioxidante. Portanto, a autofagia excessiva ou inadequada pode causardanos nos rins; ambos são mal-adaptativos e eventualmente provocam a morte celular. Assim, manter níveis moderados de autofagia é a chave para atenuar a lesão oxidativa na condição séptica.
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Evidências acumuladas indicaram que o miR‑214 inibe a autofagia em várias células e tecidos (31‑33). No presente estudo, a superexpressão de miR-214 foi encontrada para inibir a autofagia induzida por CLP emtecidos renais,conforme indicado pelas alterações nos marcadores proteicos, como LC3‑II/I e p62. Além disso, os resultados demonstraram que a superexpressão de miR‑214 atenuou a lesão oxidativa induzida por CLP ao inibir a autofagia excessiva. O presente estudo também investigou os mecanismos moleculares pelos quais o miR‑214 modularimautofagia na LRA induzida por sepse. PTEN/AKT/mTOR é uma importante via de sinalização que regularimautofagia (34,35) e que desempenha um papel-chave na LRA induzida por sepse, e o PTEN é um inibidor negativo da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR. Estudos anteriores relataram que o miR‑214 pode regular a autofagia através da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR em vários modelos (36‑38). Ma et al (39) descobriram que o miR‑214 pode regular negativamente a autofagia em rins diabéticos. Portanto, foi hipotetizado que os efeitos do miR-214 na LRA induzida por CLP podem estar envolvidos na regulação da via PTEN/AKT/mTOR. Notavelmente, os resultados do presente estudo mostraram que a cirurgia de CLP elevou significativamente os níveis de PTEN, mas diminuiu os níveis de p-AKT e p-mTOR, indicando que a cirurgia de CLP inativou a via AKT/mTOR. Além disso, a superexpressão de miR‑214 ativou a via AKT/mTOR pelo silenciamento de PTEN na autofagia induzida por CLP emrimtecidos. No entanto, anti‑miR‑214 não inibiu significativamente a expressão de mTOR em análises de Western blot. Assim, o RT‑qPCR foi ainda utilizado para determinar a expressão de mRNA de genes relacionados à via de sinalização PTEN/AKT/mTOR. O presente estudo identificou que o miR‑214 regulou negativamente a expressão de PTEN e ativou a via de sinalização AKT/mTOR para inibir a autofagia. No entanto, mais estudos exaustivos devem ser realizados para obter detalhes adicionais relacionados ao mecanismo derimautofagia em estado séptico.
Para concluir, os resultados do presente estudo sugeriram que o miR‑214 exerceu um papel protetor contra infecções induzidas por sepse.lesão renalreduzindo o estresse oxidativo e inibindo a autofagia através da regulação da via PTEN/AKT/mTOR. Os presentes achados sugeriram que o miR‑214 pode ser um potencial alvo terapêutico para a LRA induzida por sepse. No entanto, o presente estudo usou camundongos com 6-8 semanas de idade, portanto, mais pesquisas sobre o mecanismo do miR-214 são necessárias em camundongos adultos.
